Альфавирус трансдуцирующих Система: Инструмент для визуализации инфекции у комаров-переносчиков

Резюме

Методы использования альфавирус трансдуцирующих системы, чтобы выразить флуоресцентные журналистам в пробирке и у взрослых комаров описаны. Эта техника может быть адаптирована для выражения какого-либо белка интереса вместо или в дополнение к репортеру.

Аннотация

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well^9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.

ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles^3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission^5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP^2,9.

Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission⁷. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

протокол

Следующий протокол написан для производства и использования АТС на основе вируса Синдбис MRE16. АТС предназначена для выражения GFP в комаров-переносчиков Aedes aegypti. кДНК Инфекционные клоны число alphaviruses (Синдбис вирус, вирус Чикунгунья, O'nyong-nyong вирус, западная конского энцефалита вирус) в настоящее время доступны, которые были разработаны как АТС (таблица 1). Для достижения наилучших результатов ДНК плазмиды усиливается в такие бактерии, как УВЕРЕН компетентных бактерий (Stratagene / Agilent Technologies), чтобы избежать нежелательных рекомбинации и потери вирусной кДНК. Все инфекционные плазмид клона у бактериофага Т7 или SP6 промоутер в непосредственной 5 'концу вирусной кДНК для транскрипции полнометражных РНК геномных и уникальные рестриктазой на 3' конец для стока транскрипции. Для каждой АТС, пользователи должны использовать соответствующий бактериофаг ДНК зависимой РНК-полимеразы и уникальные рестрикции для экстракорпорального транскрипции вирусного генома РНК.

1. Поколение инфекционных РНК из кДНК клонов.

1. Линеаризовать 5 мкг инфекционного клона плазмиды (p5'dsMRE16 / GFP) с 20 единиц фермента ограничение XhoI в 100 мкл реакции. Инкубировать 2-3ч при температуре 37 ° C
2. Purify линеаризованной ДНК с использованием Qiagen QIAprep Спиновые Miniprep Kit альтернативный протокол очистки, элюируя ДНК из спин колонки, используя 50 мкл РНКазы без воды. Плазмиды концентрация должна быть приблизительно 1,0 мкг / мкл.
3. В РНКазы без трубки 0,2 мл ПЦР, настройка 50 мкл реакции транскрипции использованием Амбион MAXIscript комплект в соответствии с протоколом следующим образом.
   
   • 22,5 мкл РНКазы без дН ₂ O
     • 5,0 мкл линеаризованной ДНК-матрицы (1,0 мкг / мкл)
     • 2,5 мкл 10 мМ ATP
     • 2,5 мкл 10 мМ CTP
     • 2,5 мкл 10 мМ UTP
     • 2,5 мкл 1 мМ GTP
     • 2,5 мкл 10 мМ шапка аналоговый (м ⁷ G (5 ') ППС (5') G)
     • 5,0 мкл 10х буфера транскрипции
     • 5,0 мкл T7 или SP6 полимеразы смеси
   • Всего 50,0 мкл
4. Инкубируйте транскрипции реакции в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После инкубации реакция должна быть использована немедленно для электропорации ВНК-21 клеток. Подготовка ВНК-21 ячеек для электропорации должны начаться во время инкубации реакцию транскрипции.

2. Генерация вирусов от инфекционных РНК

1. Trypsinize две 70-80% сливной 150 см ² (Т-150) колбу ВНК-21 клеток на АТС.
2. Передача всех клеток в 15 мл коническую трубку центрифуги.
3. Гранул клетки центрифугированием при 2000 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С в обычных настольных центрифуг.
4. Ресуспендируют клеток в стерильных ФСБ без Mg + + и Са + +. Повторите шаги 2.3 и 2.4, пока клетки были трижды промывали PBS.
5. Ресуспендируют гранулированный клетки 0,5 мл MEM, содержащей 10% FBS.
6. Развести 10 мкл клеток с 90 мкл MEM с 10% FBS и рассчитывать на hemacytometer. При необходимости, разбавить клетки 2.5-12.5 х 10 ^{7 клеток} / мл MEM, содержащей 10% FBS.
7. Для ледяной 0,2 кювет электропорации см, добавить 400 мкл клеточной суспензии и 20 мкл реакции транскрипции. Протрите конденсации из кювета.
8. Импульсный кювет дважды: 450В, 1200Ω, 150 мкФ. Мы используем Электро Манипулятор Cell, Гарвардский Аппарат Модель ECM630.
9. Место все содержимое кюветы в 25 см ² культуре ткани колбу 5 мл MEM с 10% FBS.
10. Инкубируйте колбы (ы) на 37С с 5% CO _2.
11. Монитор инфекции ежедневно с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа с соответствующим набор фильтров (например, GFP фильтр: длина волны возбуждения = 460-490 нм, длина волны излучения = 510-550 нм, или DsRed фильтр: длина волны возбуждения = 460-560 нм, длина волны излучения => 590 нм).
12. При флуоресценции предполагает инфекция сливной и / или CPE виден абсолютно во всем колбу, собирать содержимое колбы, добавляют 30% FBS, аликвоту по мере необходимости, и хранить при температуре -80 ° C. При желании, клеточные лизаты могут быть удалены путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С) перед добавлением ФБС.
13. Прохождение вирус не реже одного раза через новую колбу клеток к увеличению титра вируса для последующих анализов кормления кровью.

3. Перорально Заражение комаров

1. Смешать крови (обычно покупается де-fibrinated овечьей крови) и клеточной культуры производных суспензии вируса, начиная с шага 2.13. Заключительный титр вируса в крови еды обычно должна быть ~ 1x10 ⁷ бляшкообразующих единиц (БОЕ) / мл для эффективного инфекции средней кишке комара. Чтобы стимулировать комары жадно и много есть, аденозин-5'-трифосфата (АТФ) могут быть добавлены в конечной концентрации 0,02 М.
2. Комары могутдолжны быть лишены воды и сахара до заражения, чтобы стимулировать их к эффективной крови ленты из искусственной подачи. Срок лишения должны быть предварительно созданы, чтобы минимизировать смертность. Времена, будет зависеть от видов комаров, влажность insectary т.д. В качестве отправной точки, удалить сахара и воды 24 часа 12 часов до подачи. Этот протокол использует водяной рубашкой стекла feeders17 с циркулирующим 37 ° С воду. Свиной кишечной мембраны (т.е. тщательно промывают колбасной оболочки доступны в большинстве продуктовых магазинов) находится над устьем фидера и еда пипеткой в ​​камеру. Различные конструкции, мембраны и протоколы, которые доступны для различных типов вектор.
3. Комары сортируются, чтобы выбрать только те комары наливается кровью. Налиты кровью комаров передается коробка с органди на верхней и комаров инкубируют при 28 ° С, 75-80% относительной влажности до обработаны для выражения GFP.

4. Внутригрудного Прививка от комаров

Внутригрудного прививка является альтернативным методом для заражения членистоногими. Этот метод используется, когда распространение через кишки не требуется. (Метод, описанный ниже, но техника не показано в этом визуальный эксперимент).

1. Небольшое количество комаров (5-10) всасывается из холдинга клетки в пластиковые трубы проведения. Запечатанных проведение трубы будут размещены на 4 ° С в течение 15 минут, чтобы охладить комаров.
2. 2 5 комаров прольется из тюбика на стеклянном блюде Петри отдыха на льду. Место крышку чашки Петри, когда он не используется или если комары начинают передвигаться. Во время обработки комаров, необходимо позаботиться рассчитывать и отслеживать количество комаров манипулируют. Как комары пролитой на холод таблицы, общее число будет записано в лаборатории счетчика.
3. Игла подготовленный плавления капиллярная трубка использованием Nanoject конкретных стекла и иглы съемника.
4. Установка Nanoject II microinjector в соответствии с инструкциями изготовителя на поставку 69 нл посевной. Следует быть внимательным при составлении посевной в иглу так, чтобы игла не была повреждена.
5. Использование рассекает микроскоп, вставить иглу в грудную клетку от комаров и активировать Nanoject для прививки. Следует быть внимательным, когда прививки комаров таким образом, чтобы игла не полностью проникнуть комаров и выйти с другой стороны, в результате последующей гибели комара. Проверьте каждый комаров, чтобы быть уверенным, что посевной введен до удаления его от иглы.
6. После прививки, а комар все еще насаженные на иглу, поместите его в бумаги холдинга картонной через небольшое отверстие в боковой, который подключен с хлопком или корковой пробкой во все другие времена.
7. Когда комары прививку и помещаются в картонные (примерно до 50 в упаковке), тщательно ленты пробки в месте, чтобы предотвратить случайное высвобождение комаров. Место коробок в безопасное проведение бен перед дальнейшей инкубации в insectary при 28 ° C и 80% относительной влажности.

5. Мониторинг Заражение комаров

1. Положите бумагу проведения упаковке при 4 ° С в течение примерно 15 минут, чтобы обездвижить комаров.
2. Передача небольшого количества комаров (5-10 за раз), чтобы холод таблица адаптирована для использования на флуоресцентный микроскоп.
3. Изучить и комаров рода на основе наличия или отсутствия флуоресценции. Кроме того, люминесцентные интенсивности может быть использован в качестве прокси-количественного измерения инфекции. Mosquito тканей, таких как midguts, слюнные железы, жир можно разрезать и контроль за флуоресценцию.
4. В случае необходимости, вернуть выбранные комаров на бумагу картон для продолжения инкубации инфицированных комаров.

6. Передача анализ (Принудительное Слюноотделение для демонстрации передачи вируса)

1. Лишить комаров сахара источника в течение 24 ч до подачи.
2. Удалить ногами и крыльями
3. Для 50 мкл капиллярной трубке, которая была разогрета, вытащил и отрезал на одном конце, добавить 3-5 мкл Cargille типа B нефти погружения или 10% от сыворотки раствором сахарозы.
4. Вставьте хоботок в трубку. При использовании масла, капельки слюны будет видно, чтобы источать с хоботком. Один мкл 1% раствора в pilocarbine PBS и 0,1% Твин-80 может быть применен к грудной клетке, чтобы стимулировать.
5. После 60-90 минут, снимите комаров и хранить для выделения вируса, если требуется.
6. Удалить раствор из трубки с помощью центрифугирования в пробирку, содержащую 100 мкл 20% FBS-би-эс.
7. Стерильный фильтр посевной через 0,2 мкм фильтр шприца, а затем использовать фильтруется посевной заразить культуру клеток.

БИОБЕЗОПАСНОСТИ Примечание: Этот протокол описываетметод генерации, идентификации и мониторинга инфицированных комаров. Основываясь на ваших объектах (например, холод стол, локализации и т.д.), и утверждение IBC, Вы можете быть ограничены рассматривая их только после их удаления крылья и ноги, чтобы предотвратить побег. SINV основе АТС могут быть получены и использованы в BSL2 окружающей среды. Использование АТС, основанные на других alphaviruses, таких как вирус Чикунгунья или западной вирусов конского энцефалита потребует BSL3 объектов.

7. Представитель Результаты

Обзор выражение маркерный ген (GFP) с использованием АТС 5'dsMRE16 / GFP показано на рисунке 1. Экспрессия GFP в ВНК-21 и C6/36 (Aedes albopictus) клетки показано на рисунке 2, в определенное время после заражения клеток с 5'dsMRE16 / GFP вируса на 0,01 множественности заражения. На рисунке 3 приведен обзор вирусной инфекции альфавирус и ОВД в организме комара, когда вирус передается через еду крови инфекционный. Рисунок 4 показывает, подготовка крови еду с ~ 10 ⁷ БОЕ / мл вируса АТС с последующим пероральным заражения Aedes aegypti. Всего зрения организма инфицированного комара и отдельных частей тела в 10 дней после инфекции использованием epifluorescence микроскоп (рис. 5). Обнаружение GFP и DsRed в midguts инфицированных комаров после заражения с АТС 5'dsMRE16 вирусов выражения каждый флуоресцентный ген маркера (рис. 6). Передача методом с использованием инфицированных комаров 5'dsMRE16 / GFP АТС вируса (рис. 7).

Таблица 1. ОВД, в настоящее время разработан для экспрессии генов в комаров.

Альфавирус	АТС	Комар	Ссылка
Синдбис вирусов	TE / 3'2J и TE / 5'2J	Aedes aegypti	12
		Ochlerotatus triseriatus	13
	3'dsMRE16 и 5'dsMRE16	A. aegypti	5
		Culex tritaeniorhynchus	5
	5'dsTR339	А. AEG ypti	2
Чикунгунья Вирус	3'dsCHIKV и 5'dsCHIKV	A. aegypti / A. albopictus	20
O'nyong nyong вирус	5'dsONNV	Anopheles gambiae	1,9
Западные лошадиного энцефалита	5'dsWEEV. Макмиллан	Culex tarsalis	Stauft и соавт., Неопубликованные

Таблица 2. Преимущества / Недостатки использования АТС для экспрессии генов в комаров.

Преимущества:

Быстрое производство с высоким титром вируса

Широкий спектр хост (SINV)

Высокая скорость репликации РНК

Высокие уровни экспрессии трансгенов

Относительная легкость манипулирования генами

Стабильная, постоянная экспрессия генов у насекомых

Минимальная патология у насекомых

Недостатки:

Краткосрочные выражение в режиме клеток позвоночных

Сильные цитопатического воздействия на клетки позвоночных

Гена ограничения размера (<1Кб, в идеале)

Некоторые alphaviruses требуют BSL3 сдерживания

Рисунок 1: Обзор АТС вирус производства в ВНК-21 ячеек с помощью p5'dsMRE / GFP SINV выражения GFP. После в пробирке транскрипции, геномная РНК АТС электропорации в ВНК-21 ячеек, в которые вирус спасены. Вирус АТС могут быть использованы для заражения комаров. ПМГ = субгеномных промоутера. Три АТС РНК видов переписаны челЛ.С., геномные, субгеномных 1 и 2 субгеномных РНК. С (капсид), E2 и E1 гликопротеины собираются с АТС генома для создания инфекционного вируса.

Рисунок 2: Выражение GFP в комара (C6/36) клеток после инфицирования SINV 5'dsMRE16 / GFP вируса.

Рисунок 3: Обзор инфекции вируса в ОВД, комары, ведущих к передаче вируса.

Рисунок 4: АТС SINV 5'dsMRE16 инфекции, подвергая комары еды крови инфекционный.

Рисунок 5: АТС SINV 5'dsMRE16 / GFP инфекции в 10 дней после инфекции. Всего обнаружения тела GFP показывает, что вирус бежал кишки и распространены среди вторичных тканей. Рис также показывает, GFP выражение в отдельных частях тела, что также свидетельствует о диссеминированной инфекции.

Рисунок 6: АТС SINV 5'dsMRE16 / GFP и 5'dsMRE16 / DsRed заражения midguts в определенное время после заражения. Midguts как правило, имеют различные очаги инфекции в ранние сроки после проглатывания крови пищи, содержащей вирус, который распространяется по всей задней кишки в более поздние сроки после заражения.

Рисунок 7: Обнаружение АТС 5'dsMRE16 / GFP в слюне комаров еще 8 дней после инфекции. Анализ предназначен для демонстрации передачи вируса АТС и показывает, что 5'dsMRE16 / GFP вирус может стабильно выразить GFP всей внешней инкубационный период в организме комара. Левая панель показывает комаров слюноотделение в капиллярной трубке, панель показывает C6/36 центре клетки, инфицированные слюной на 1 день и правой панели через 3 дня после заражения.

Обсуждение

Методы, представленные здесь, позволяют исследователям следить заражения комаров альфавирус в культуре клеток и взрослая самка комара. Преимущества и недостатки использования АТС вирусов приведены в таблице 2. АТС инфекционных клон может быть генетически манипулировать, чтобы выразить любую ГОИ и были использованы для выражения одноцепочечные антитела, супрессоры RNAi, антисмысловые РНК ориентации эндогенных генов, и про-апоптотических белков. Если репортер не используется, то часть изображения этого метода не имеет значения. Тем не менее, многие из тех же протоколов необходимы для АТС вирус спасения, распространения и комаров инфекции. Существуют ограничения в максимальный размер трансгенов при вставке в системе трансдуцирующих альфавирус. Ограничений по размеру различаются в зависимости от родительского штамма используется для создания АТС, но, как правило, около 1 КБ, хотя больше репортер генов, таких как люциферазы светляков были использованы в построении АТС для использования в комаров. Исследовательские лаборатории со скромным количеством фоне вирусологии должны быть в состоянии использовать в следующих АТС этих протоколов. Ряд научно-исследовательских лабораториях уже сделали это, используя SINV основе АТС в.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
MAXIscript Kit	Ambion	AB1312	Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.
Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G)	Ambion	AM8050
Nanoject II nanoliter injector	Drummond Scientific	3-000-204
Electro Cell Manipulator	Harvard Apparatus	ECM 630