Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

Summary

כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Abstract

במחקר זה, אנו המתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור cryopreservation המוצלחת הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. עבור פרוטוקול זה המדיום הקפאת בשימוש הוא sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) מדולל פתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS). בלוקים של רקמת קליפת המוח מועברים cryovials המכיל את המדיום מקפיא קפוא לאט ב -1 ° C / min במיכל שיעור שבשליטת מקפיא. לאחר ההפשרה עיבוד ניתוק של גושי רקמה קפוא המיוצר באופן עקבי העצבית מועשר תרבויות אשר הציגו צמיחה מהירה מדלקת עצבים במהלך 5 הימים הראשונים בתרבות הרחבה משמעותית של רשת נוירונים בתוך 10 ימים. מכתים Immunocytochemical עם חלבון סמן astrocytic גליה חומצי fibrillary (GFAP) ואת עצבי בטא טובולין סמן המעמד השלישי, גילה מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתרבויות. הדור של תאים עצביים תרבויות מבשר לאחר רקמות לחסום דיסוציאציה הביא המתרחב במהירות neurospheres, אשר הפיק מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתנאים מבדל. זה פרוטוקול cryopreservation פשוט מאפשר לשימור, מהיר ויעיל, ולא יקר של גושי רקמה קורטיקלית במוח, המעניק גמישות משופרת עבור דור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

Protocol

1. Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים

חומר הכנה

1. הכן שנאגרו 1X של האנק תמיסת מלח (HBSS) על ידי דילול לפתרון מניות 10X במים סטריליים (01:09). חנות HBSS ב 4oC.
2. הכן 10% בינוני DMSO הקפאת ידי דילול DMSO ב HBSS (01:09). המדיום הקפאת צריכה להיעשות טרי לפני cryopreservation ומאוחסן על 4oC עד צונן.
3. סכין גילוח פלדה משמשת קיצוץ שיטתי של הרקמה. לפני השימוש, סכין הגילוח הוא מעוקר ידי והשקיעה אתנול 70% עבור שעות 2. מיד לפני עיבוד רקמות, יש לשטוף את הסכין עם מים סטריליים 3 פעמים. הימנע עוזבים את הסכין במים סטריליים בסכום מופרז של זמן, כפי שהוא נוטה חמצון.
4. מיכל הקפאה Nalgene טעון cryovials (2.5 מ"ל) ולאחר מכן הביא לתוך ארון ביולוגי סטרילי. 1 מ"ל של מדיום הקפאת צונן מתווסף בקבוקון אחד. מיכל הקפאה ממוקם אז לפחות 2 שעות בשעה 4oC.

ניקוי, קיצוץ, ועל הקפאת

1. רקמת המוח להיות קפוא הוא ניקה של קרום קרום המוח וכלי הדם. השתמש טיפים מחט סטרילית כדי להסיר בזהירות פסולת הרקמה תוך כדי עבודה על גבי שקית קוביות קרח. רקמה נוקה יש לשטוף קלות HBSS קר הועבר בצלחת פטרי חדש קיצוץ.
2. עבודה על גבי שקית קוביות קרח, השתמש סכין גילוח לעקר במהירות כדי לקצוץ את הרקמה לתוך כ 1 ³ בלוקים מ"מ. עבודה עם מנות קטנות של רקמה לנקות את תוצאות זמן שליטה טובה יותר על הליך החיתוך, וכתוצאה מכך גדלים גוש אחיד יותר.
3. לאט לאט להוסיף רקמה קצוץ לתוך 50 מ"ל של HBSS בצינור חרוטי 50 מ"ל. בעדינות ולשטוף את צלחת פטרי עם HBSS כדי לאסוף כל גושי רקמה הנותרים. אפשר גושי רקמה לרדת לחלק התחתון של הצינור, יצירת רקמה ארוזים בצורה רופפת לחסום גלולה.
4. בעוד הרקמה שיקוע, להביא את מיכל הקפאה מקורר בעבר cryovials לתוך ארון הבטיחות הביולוגית. פותח את הפקק כל cryovials כדי לזרז את התהליך של הוספת רקמה.
5. אחרי הכל את גושי רקמה התיישבו, לשאוב בעדינות HBSS עודף, משאיר שכבה דקה מאוד של המדיה מעל גלולה. צנטריפוגה אינה מומלצת, מכיוון שהדבר יגרום גושי רקמה לדבוק זה בזה, הולכת ופוחתת באופן משמעותי את יעילות מקפיא.
6. לאט לאט לאסוף 200 μL מהחלק התחתון של הרקמה רפויה לחסום גלולה באמצעות קצה פיפטה עם פתחים רחבים (לחתוך קצה במספריים סטריליות). העברת את החומר cryovial אחד לעבור הרקמה, הבא שוב איסוף מהחלק התחתון של גלולה. זה חיוני כי ההליך כולו הקצאת רקמה לא לוקח יותר מ 3-4 דקות לכל מיכל ההקפאה. הדבר מבטיח כי רקמות חשוף DMSO לתקופה רק זמן קצר לפני ההקפאה. לאחר העברת רקמה על צלוחיות, במקום מיכל הקפאה במקפיא-80oC במשך לפחות 4 שעות. לחלופין, מיכל הקפאת ניתן להשאיר ולינה -80 מעלות. חזור על תהליך זה עבור כל מיכלי הקפאה הנותרים.
7. מעבירים את cryovials ממיכל ההקפאה (ים) cryobox ובמקום במיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

2. הפשרה ו culturing של בלוקים קפואים רקמות קליפתיים

חומר הכנה

1. יום אחד לפני ההפשרה דגימות רקמה, _{poly-L-ליזין} צלחות פטרי מצופה / coverslips מוכנים. באופן כללי, עבור נוירונים בקליפת המוח אנו מכינים מאכלים מצופה 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​או 1 מ"ג / מ"ל. הוסף מספיק _{poly-L-ליזין} פתרון (שנעשו חיץ borate) באופן מלא לכסות את החלק התחתון של המנה. אם coverslips זכוכית נדרשים, להבטיח כי הם שקועים לחלוטין מתחת פתרון _{poly-L-ליזין.} דגירה של לפחות 12 שעות. לפני השימוש, לשטוף ביסודיות את הכלים עם כמות ליברלית של מים סטריליים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד.
2. HBSS חם משמש לניקוי הרקמות מופשר, וכן לנתק את הרקמה השעיות לתוך התא. נפח HBSS צורך ישתנה בהתאם לכמות רקמות להיות מופשר, אבל בדרך כלל 1 cryovial מדללים ב 50 מ"ל של HBSS ויהיה ניתק ב 10 מ"ל של HBSS.
3. שינוי של Dulbecco בינוני הנשר עם 10% ברזל בתוספת שור עגל בסרום (EBS) ו -1% אנטיביוטי / antimycotic (AA) תערובת (DMEM (++)) צריך להיות ממוקם בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים.
4. בינוני ציפוי (NB (+++)) צריכה להיעשות טרי לפני השימוש. בינוני זה הוכן על ידי הוספת 1% אנטיביוטי / antimycotic בתוספת B27 ותוספי N2.

הערה: שמות מדיה שצורפה צלבים (+) מצביעים על הכללת תוספי הרכב הבסיס של התקשורת. בטקסט הזה, DMEM (+ +) מציין DMEM EBS פלוס 10% פלוס 1% AA, בעוד NB (+++) מציין NB plלנו 1% AA פלוס B27 פלוס N2.

הפשרה ו culturing

1. הסר את cryovials מהטנק חנקן נוזלי במהירות להפשיר על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד רק קרח גלולה קטנה הוא ציין את הבקבוקון בתוך התוכן.
2. בעדינות להעביר את תוכן הבקבוקון 50 מ"ל של HBSS חם צינור חרוטי. השתמש קצה פתח רחב בעדינות כדי לסלק כל גושי רקמה שנותר תקוע cryovial. הפוך את הצינור 3-4 פעמים ולאפשר הרקמה לאט לאסוף בתחתית. רקמות צריכה להתיישב מהר, אבל אם בלוקים קטנים מדי זה לא יכול להתרחש ואור צנטריפוגה (~ 200 x ז) ​​מומלץ.
3. לשאוב HBSS עודף.
4. הוסף 10 מ"ל של HBSS חם רקמת גלולה ו 300 μL של טריפסין 0.25% ו 50 μL של DNAase. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 5 דקות, ולאחר מכן מקום שייקר מסלולית מוגדר 80 סל"ד ו - 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.
5. לאחר תקופה זו, להביא את גושי רקמה לתוך ארון בטיחות ביולוגית להשתמש פיפטה 10 מ"ל בזהירות להתסיס את גושי רקמה עד ההשעיה תא מעונן נוצר. לבטל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) כדי השעיית התא.
6. צנטריפוגה התאים ניתק ב 1200 x g עבור 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) ולכמת מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
7. פלייט תאים _{פולי-L-ליזין} מנות מצופה. בדרך כלל, מנה 60 מ"מ יהיה מצופה 1x10 ⁶ תאים.
8. אפשר התאים לצרף צלחת / coverslips במשך שעה בערך 1 ב בתרבית רקמה חממה. מומלץ לעקוב אחר התקדמות מצורף צלחת אחת כל 10 דקות עד מצורף יעיל הוא ציין. ואז, בעדינות להחליף את מדיום עם טרי DMEM (++).
9. לאחר 24 שעות, להחליף את DMEM (+ +) עם חם NB (+++). שינויים בינוני חלקית (50%) מתבצעות כל 5 ימים עם טרי NB (+++). תרבויות בריא בדרך כלל מראים סימנים של בידול וצמיחה של תהליכים לאחר 24 שעות. בתנאים אלה, וביצוע שינויים בינוני חלקית כל 4-5 ימים, התרבויות יכול להישמר במשך תקופות ממושכות של זמן עד 4-6 שבועות.
10. עבור הדור של תאים עצביים מבשר (NPCs), פרוטוקול דומה משמש למעט שאחרי צנטריפוגה, DMEM ללא EBS משמש. תאים הם מצופה ב-T-25 צלוחיות ב DMEM/F12 (01:03) בתוספת B27 ו EGF (20 ng / mL) כדי לאפשר היווצרות של neuropheres. כדי לבדל את NPCs, neurospheres הם מצופה על laminin (10 UG / mL) coverslips מצופה DMEM/F12 (01:03) בינוני בתוספת N2.

3. נציג תוצאות

תרבויות בריא תציג צמיחה בידול משמעותי לאחר 5 ימים שלאחר ההפשרה ובדרך כלל לייצב את הצמיחה שלה על ידי 10 ימים (איור 1). מכתים Immuncocytochemical של תרבויות אלה מגלה האסטרוציטים רבים (איור 2 א) ו נוירונים (תרשים 2B) הן האדם חולדה תרבויות עצבי ראשוני. פרוטוקול זה מתאים גם לדור של NPCs כמו ריחוף ללא neurospheres (איור 3A), אשר בתנאים הבחנה, תוצאה בתרבויות באיכות גבוהה מעורבת (איור 3B, C).

באיור 1. בתרביות תאים של רקמות קפוא קליפת המוח האנושי. קפוא חוסם רקמת קליפת המוח האנושי הם מופשרים, מצופה על poly-ליזין coverslips מצופה גדל במשך 10 ימים. ביום 5 הרחבת התא ניכר וביום 10 confluency מושגת. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר.

איור 2. מכתים Immunocytochemical של תרביות תאים. (א) תרבויות הוכתמו החלבון סמן גליה גליה חומצי fibrillary (GFAP, חיצים עבה). (ב) נוירונים התגלו עם עצבי בטא טובולין סמן III (TIII, חיצים דקים). (ג) הן האדם בתרבויות עכברוש להראות גליה שפע נוירונים לאחר 10 ימים בתרבות. נוגדנים העיקרי: עכבר אנטי GFAP (1:1000) ו הארנב נגד TIII (1:1000). נוגדנים משני: אנטי עכבר Alexa 594 (1:500) ואנטי ארנב Alexa 488 (1:500). מכתים גרעינים: Hoestch כחול (1:1000). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר.

איור 3. דור neurospheres. (א) הרקמה הקפואה היה מעובד כמתואר לעיל ואיפשר להפיץ כמו neurospheres. (ב) Neurospheres היו על coverslips מצופה זכוכית בתנאים המבדילים גדל במשך 10 ימים, וכתוצאה מכך התאים נודדות הרחק neurosphere. (ג) שני נוירונים האסטרוציטים נמצאים בשוליים של הרחבת neurosphere מבדל. Counterstaining גרעיני, נוגדנים ראשוניים ומשניים לשמש באיור 2.

Discussion

Cryopreservation מציע הזדמנות לבנק היקר דגימות רקמות המוח לשימוש עתידי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוטה אך יעילה ליצור שתי נוירון מועשר תרבויות תאים עצביים מאבני מבשר קפוא רקמות המוח. הליך זה חסכוני ימנע את העלויות של טכניקות מסורתיות cryopreservation לנצל יותר יקר שיעור שבשליטת מקפיאים. הפרוטוקול מאפשר לדור של תרבויות העצבית קיימא שלאחר ההפשרה על ידי מתן אמצעי מהיר אך יעיל להקפיא בלוקים רקמות. תהליך הקפאה כולו יכול לקחת קצת כמו 20 דקות. בנוסף תרבויות עצבי ראשוני, תוך שימוש בשיטה זו רקמת בלוקים יכולים גם להיות מופשר ליצור NPCs גדל כמו neurospheres צף חינם. בהקשר זה, היעדר נסיוב במדיום הקפאת שלנו מבטיחה כי התאים נשמרים במצב לא מובחן. בתנאים הבחנה, המיוצר neurospheres מהרחבת להראות קפוא רקמות שיעורי הבחנה דומה מאוד neurospheres שנוצר מרקמות טריות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995-073	High gluclose 1X
Bovine calf serum supplemented	Hyclone	SH30072.03	For culture medium
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	Invitrogen	1088-022
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	Supplement for Neurobasal medium
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Supplement for Neurobasal medium
Trypsin (10X)	Cellgro	25-054CI	Tissue dissociation
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)	Sigma-Aldrich	D4527-30KU	Tissue dissociation
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	GIBCO, by Life Technologies	14065	Cleaning tissue, washes, and freezing medium
Poly-L-Lysine- 500mg	Invitrogen	P2636	Substrate for adhesion of neuronal cells
antibiotic-antimycotic (100X), liquid	Invitrogen	15240-062	To prevent contamination
Large orifice pipette Tips (1-200 ul)	Fisher Scientific	02-681-141	To prevent shear stress to cells
Graduated pipette tips (101-1000 ul)	USA Scientific, Inc.	1111-2721
21 G1 precision guide needles	BD Biosciences	305165	To clean tissue
10 ml pipette	USA Scientific, Inc.	1071-0810	Individually wrapped
50 ml tubes	USA Scientific, Inc.	926-9-04
Single edge razor blade	Smith & Nephew Inc.	67-0238	To chop tissue
60 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0160	For general culture
100 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0010	For cleaning tissue
Cryogenic box	Nalge Nunc international	5026-1010
Freezing container	Nalge Nunc international	5100-0001	"Mr. Frosty"
2.0 ml cryogenic vials	Nalge Nunc international	5012-0020
DMSO	Fisher Scientific	D128-500	For freezing medium
Ethanol 200 proof	Sigma-Aldrich	E7023	For sterilizing razor blade