תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Summary

מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) היא טכנולוגיה המתעוררים מסוגל קליטה הדמיה אופטית ניגודים In vivo עם רזולוציה רגישות הסלולר. כאן, אנו מספקים הדרכה דמיינו על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, כולל תצורה יישור מערכת מערכת, טיפוסי In vivo הפרוצדורות, וערכות הדמיה תפקודית.

Abstract

מיקרוסקופיה אופטית, לספק תובנות רבות ערך ברמות הסלולר אברון, הוכרה באופן נרחב כטכנולוגיה המאפשרת ביו. מאחר התווך של in vivo תלת ממדי (3-D) מיקרוסקופיה אופטית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי single-/multi-photon ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) הראו רגישות יוצאת דופן שלהם ניגודים פיזור הקרינה אופטיות, בהתאמה. עם זאת, בניגוד קליטה אופטי של רקמות ביולוגיות, אשר מקודד מידע פיזיולוגיות / פתולוגי חיוני, טרם שומתי.

הופעתם של photoacoustics ביו הוביל ענף חדש של מיקרוסקופיה אופטית מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) ^1, שם הקרנה ממוקדת אופטי להגביל את עקיפה להשיג הסלולר subcellular ¹ או אפילו ² ברזולוציה רמת לרוחב. כהשלמה ערך הקיימות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה אופטית, OR-PAM מביאה לפחות שני חידושים. ראשית, וחשוב מכל, OR-PAM מזהה ניגודים קליטה אופטית עם רגישות יוצאת דופן (כלומר, 100%). שילוב OR-PAM עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ³ או עם פיזור אופטי מבוסס אוקטובר ⁴ (או עם שניהם) מספק תכונות אופטיות מקיפה של רקמות ביולוגיות. שנית, OR-PAM מקודד קליטה אופטית לתוך גלים אקוסטיים, בניגוד לתהליכי אופטי טהור מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו אוקטובר, ומספק רקע ללא זיהוי. גילוי אקוסטי של OR-PAM מפחית את ההשפעות של פיזור אופטי על השפלה האות טבעי מבטל הפרעות אפשרי (כלומר, crosstalks) בין עירור וגילוי, המהווה בעיה נפוצה מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשל חפיפה בין עירור ואת ספקטרום הקרינה.

ייחודי עבור הדמיה קליטה אופטית, OR-PAM הוכיחה יישומים ביו רחב מאז המצאת שלה, כולל, אך לא מוגבל, נוירולוגיה ^{5, 6,} עיניים ^{7, 8, 9} וסקולרית ביולוגיה, ו ^-10 דרמטולוגיה. בסרטון הזה, אנו מלמדים את תצורת המערכת ויישור של OR-PAM, כמו גם את נהלי ניסיוני בתחום ההדמיה כלי הדם vivo תפקודית.

Protocol

1. תצורת מערכת

1. אופטי קרינה
   1. מקור קרינה אופטי: דיודת-שאוב מצב מוצק פעמו לייזר (INNOSLAB, Edgewave) ו לייזר צבע (CBR-D, סירה).
   2. קרן לייזר פלט (רוחב הדופק: 7 ns) ממוקדת על ידי עדשה מעבה (LA1131, Thorlabs) לעבור דרך חריר 50 מיקרומטר (P50C, Thorlabs).
   3. חריר ממוקמת מעט מן המוקד של העדשה הקבל כדי להתאים את קוטר חריר בקוטר יסוד מצב הקורה לסינון מרחבי יעיל.
   4. קרן מסוננת הוא נחלש על ידי מסנן צפיפות ניטרלי (NDC-50C-2M, Thorlabs) ולאחר מכן מצמידים לתוך סיב יחיד במצב אופטי (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. תפוקת סיבים ממלא את הצמצם חזרה המטרה מיקרוסקופ (RMS4X, Thorlabs) כדי להשיג מוקד עקיפה מוגבל אופטי של ~ 2.6 מיקרומטר באורך גל של 570 ננומטר.
2. זיהוי קולי
   1. מתמר Ultrasonic: 50-MHz בתדר המרכזי (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. מתמר קולי מצורף תוצרת בית אקוסטית אופטי קרן combiner ¹¹ עבור זיהוי קולי, אשר מיושר coaxially עם הקרנה-עקיפה מוגבל אופטי.
   3. חלל כדורית היא קרקע מתוך בתחתית combiner כדי לייצר עדשה אקוסטית. זו עדשה אקוסטית יש הצמצם המספרי של 0.5 במים ונותן בקוטר מוקד אקוסטי של 43 מיקרומטר בתדר המרכזי 50-MHz.
   4. מוקדים אופטיים אקוסטי מיושרים confocally על מנת למקסם את רגישות הזיהוי.
3. אקוסטית צימוד
   1. צימוד קולי יבש מועסק כדי למנוע הצללה חיות הניסוי במים, ששימש בתחילת מערכות הדמיה photoacoustic ^12.
   2. חלון הדמיה נפתח החלק התחתון של צלחת פטרי (9 ס"מ קוטר), והוא חתום עם קרום ultrasonically ו אופטית פוליאתילן שקוף.
   3. ג'ל Ultrasonic (תמונה ברורה, SonoTech) בין הממברנה פוליאתילן את האובייקט להיות זוגות צילמו את גל photoacoustic שנוצר האובייקט צלחת פטרי, ומים deionized בצלחת פטרי זוגות עוד גל של ראש שקוע הדמיה OR-PAM .
4. אלקטרוניקה
   1. האות photoacoustic זוהה על ידי מתמר קולי מוגבר על ידי שני מגברי מדורגות (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. האות מוגבר הוא דיגיטציה על ידי רכישת נתונים 14 סיביות (DAQ) הלוח (CompuScope 14200, גייג' יישומית למדעים) בקצב דגימה של 200 MS / s.
5. תוכנית סריקה
   1. דו מימדי (2-D) סריקה סריקה של הראש או הדמיה-PAM לאורך מישור (xy) אופקי נשלטת על ידי מחשב אישי, אשר מפעילה גם את הלוח DAQ ואת לייזר המשאבה. האות ההדק מסונכרן עם אות השעון את מהלוח DAQ.
   2. ציר מהיר של הסורק 2-D מוגדר לכיוון לסרוק חתך (B-scan).
   3. רצף של B-לסרוק תמונות ניתן נרכשה על ידי מתרגם את הראש הדמיה לאורך ציר איטי כדי ליצור תמונה volumetric, אשר ניתן לצפות גם בעיבוד 3-D ישיר או הקרנה 2-D המרבי משרעת (MAP) תמונה .

2. מערכת יישור

1. השתמש הדופק הד אולטרסאונד רפלקטור קולי כדי לקבוע את המיקום של המטוס מוקד אקוסטי (כלומר, העיכוב זמן מן האות על ההדק לאות הדופק המרבי הד קולי). צעד זה נדרש להתבצע רק פעם אחת בעת בניית המערכת או-PAM.
2. למקסם את היעילות של צימוד סיבים במצב יחיד.
3. החל ג'ל קולי על גבי אובייקט אופטית סופג (למשל, נייר דבק שחור) בעדינות לצרף אותו מתחת לחלון ההדמיה בצלחת פטרי מלא מים deionized.
4. מנמיכים את הראש הדמיה לתוך המים, להסיר בועות אוויר שנלכדו תחת העדשה אקוסטי.
5. התאם את הראש הדמיה עד האות photoacoustic של האובייקט הוא סופג מהמטוס מוקד אקוסטי, אשר יכול להישפט מן העיכוב אקוסטי.
6. כוונו את המיקום האנכי (כלומר, העמדה z) המטרה מיקרוסקופ כדי למקסם את המשרעת של האות photoacoustic שנוצר אובייקט שטוח. משרעת האות מוגדל עולה כי מוקד אופטי מיושר עם המוקד אקוסטי בכיוון אנכי.
7. התאם את עמדות האופקי (עמדות כלומר, x ו-y) המטרה מיקרוסקופ עד האות photoacoustic שנוצר מהיעד מציג דפוס סימטרי. סימטריה עולה כי מוקד אופטי מיושר עם המוקד אקוסטי בכיוון אופקי.
8. חזור על שלבים 2.6 ו - 2.7 עד האות photoacoustic מותאם בסימטריה והן המשרעת.

3. Sa הליך הניסוי mple-in vivo OR-PAM של העכבר לאוזן vasculature

1. בשלב זה לא נדרש עכברים בעירום. להרדים את החיה עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל [מתכון: 1 מ"ל קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 0.1 מ"ל xylazine (100 מ"ג / מ"ל), ו - 8.9 מ"ל תמיסת מלח; מינון: 0.1 ml/10 g]. לגלח את השיער באוזן, ועוד להשיר שער השיער שיורית עם קרם Surgi (קטגוריה #: 82565, American International Industries) לפני ניקוי עם מים deionized. שים לב depilation כזה עלול קצת לגרות את העור ובכך vasculature מבוצע הכי טוב 24 שעות לפני הניסוי המתוכנן.
2. הפעל את מערכת הלייזר photoacoustic, ולבדוק את מערכת היישור.
3. להרדים את העכבר עם 3% isoflurane מתאדה על ידי שאיפת גז (את קצב הזרימה אופיינית היא 1.0-1.5 ליטר / דקות, תלוי במשקל הגוף של בעל החיים), ולשמור על הרדמה עם 1% isoflurane לאורך הניסוי. הרפואי כיתה אוויר מומלץ כמו משאיפת הגז כדי לשמור את העכבר על הסטטוס פיזיולוגי.
4. העברת העכבר לשלב stereotactic, שליטה בטמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס עם כרית חימום.
5. שטחו את האוזן העכבר על צלחת פלסטיק למרוח שכבה של ג'ל אולטרסאונד על גבי האוזן. הימנע השמנה בועות אוויר בתוך הג'ל. ואז, במקום אוזן מתחת לחלון ההדמיה ולאט לאט להעלות את הבמה החיה עד ג'ל הקשר אולטרסאונד התחתון של קרום פוליאתילן. מגע רך נדרש כי לחיצה על אוזן נגד הקרום עשוי להשפיע על זרימת הדם באוזן.
6. קלאמפ oximeter הדופק ברגל או זנב עכבר לפקח המצב הפיזיולוגי שלה, ולהחיל משחה לעיניים למניעת יובש נזק מקרי לייזר לעיניים העכבר.
7. מנמיכים את הראש עד הדמיה העדשה אקוסטי הוא שקוע במים deionized, ולהסיר בועות אוויר שנלכדו תחת העדשה אקוסטי.
8. בדוק את השטף לייזר כדי לוודא שהוא בתוך תקני בטיחות לייזר של המוסד לתקינה האמריקאית מכון ^13. השטף לייזר לא יעלה על 20 mJ / ² ס"מ, אשר מיתרגם 80 NJ אנרגיה הדופק לייזר כאשר קרן הלייזר ממוקדת על 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של העור.
9. הגדר את לייזר מצב חיצוני-ההדק ולהתחיל סריקה לדין. לשנות את מיקום z של ראש הדמיה עד האות החזק ביותר הוא photoacoustic מהמטוס מוקד אקוסטי.
10. הגדרת פרמטרים סריקה נכונה ולהתחיל רכישת תמונה רשמית.
11. לאחר הניסוי, לכבות לייזר, להרים את הראש הדמיה מהמים deionized, מנמיכים את שלב בעלי חיים כדי לשחרר את העכבר, לנקות את האוזן עם העכבר deionized מים, לכבות את המערכת הרדמה בקר טמפרטורה, ולפרוק את העכבר משלב stereotactic.
12. אם הדמיה חוזרות נדרש, לשים את העכבר באינקובטור עם טמפרטורת הסביבה נקבע על 37 ° C. החזר את העכבר למתקן חיה לאחר מתעורר באופן טבעי. אחרת, בצע את הפרוטוקולים החיה euthanatize ו להיפטר ממנו.

4. פונקציונלית OR-PAM של ריכוז מוחלט רווית החמצן של המוגלובין

1. Oxyhemoglobin (HBO ₂₎ ו deoxyhemoglobin (HBr) הן שתי הצורות העיקריות של המוגלובין, המקור העיקרי photoacoustic אנדוגני בטווח הספקטרום הנראה. HBO ₂ ו HBr יש קליטה שונים הספקטרום האופטי, ולכן יכול להיות מובחן spectrally לכמת גם את הריכוז הכולל (HBT) ואת הרוויה חמצן (SO ₂₎ של המוגלובין ^5. להלן שתי הנחיות כדי לעזור לבחור האור הנראה ראוי כל כך ₂ מדידות:
2. אורכי גל יש לבחור בתוך הלהקה-Q של הספקטרום המוגלובין קליטה (כלומר, 550-600 ננומטר), כדי להבטיח יחס מספיק אות לרעש וחדירה הולם.
3. אורכי גל בו מקדמי הספיגה של HBO ₂ ו HBr יש הבדל מובהק (למשל, HBr, דומיננטי 561 ננומטר _2-HBO דומיננטי 578 ננומטר) מומלץ.

חוץ מזה כל כך _2, HBT יכול להיות מחושב על ידי הוספת [HBr] ו [HBO _2] יחד, או שהוא ניתן למדוד ישירות באורכי גל isosbestic של ספקטרה מקדם טוחנת הכחדה של המוגלובין (למשל, 530 nm, 545 nm, 570 nm, ו 584 ננומטר) ^14, שם HBr ו-HBO יש ₂ שווים מקדמי הכחדה טוחנת.

5. נציג תוצאות:

שמוצג באיור 1 הוא אנטומיה של כלי הדם ועוד ₂ באוזן עכבר חי צילמו בעירום באמצעות כפול אורך הגל (561 ו - 570 ננומטר) או-PAM. תמונה אופיינית רכישת זמן אורך הגל כפול כך ₂ מדידות של אזור כזה עניין (גודל התמונה: 10 מ"מ x 10 מ"מ; גודל הצעד: 2.5 מיקרומטר x 5 מיקרומטר) הוא ~ 80 דקות.

p_upload/2729/2729fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה vivo photoacoustic. MAP תמונות של ריכוז (א) המוגלובין הכולל מראה את האנטומיה של כלי הדם (נרכשה ב 570 ננומטר) ו - (ב) את החמצן המוגלובין הרוויה (נרכשה ב 561 ננומטר 570 ננומטר) באוזן עכבר בעירום. (ג) תקריב של האזור התאגרף בלוח (A). סרגל מידה בלוח (א) חלה הן (א) ו - (ב).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בסרטון הזה, אנו מספקים הדרכה מפורטת על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, לרבות תצורת המערכת, יישור המערכת, הפרוצדורות טיפוסי. OR-PAM ללא תווית, לא פולשנית אפשרה מחקרים של תפקוד כלי הדם ואת חילוף החומרים על בסיס נימי יחיד ובכך בעל פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של microcirculation הקשורות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials