Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Özet

Optik çözünürlüklü foto akustik mikroskobu (OR-PAM), görüntüleme optik soğurma yeteneğine sahip gelişmekte olan bir teknoloji tezat In vivo Hücresel çözünürlük ve hassasiyet. İşte, biz, sistem konfigürasyonuna, sistem hizalama da dahil olmak üzere, OR-PAM deneysel protokolleri, görüntülenmiştir bir talimat tipik In vivo Deneysel prosedürleri ve fonksiyonel görüntüleme programları.

Özet

Organel ve hücresel düzeyde değerli bilgiler sağlayan optik mikroskop, çok yetenekli bir biyomedikal teknoloji olarak kabul edilmiştir. Olarak in vivo olarak üç boyutlu (3-D), optik mikroskop, single-/multi-photon floresan mikroskopi ve Optik Koherens Tomografi (OCT), sırasıyla olağanüstü duyarlılıkları, floresan ve optik saçılma zıtlıklar göstermiştir dayanaklarından. Ancak, temel fizyolojik / patolojik bilgileri kodlayan, biyolojik dokular, optik soğurma kontrastı henüz değerlendirilebilir edilmiş değil.

Biyomedikal photoacoustics ortaya çıkışı, optik ışınlama ^{hücresel 1 veya} 2 düzeyinde yatay çözünürlük bile Subselüler ulaşmak için kırınım sınırı odaklı optik mikroskop optik çözünürlükte foto akustik mikroskobu ^{(OR-PAM) 1,} yeni bir şube açmıştır . OR-PAM değerli bir tamamlayıcısı olarak, mevcut optik mikroskop teknolojileri, en az iki yenilikler getiriyor. Birinci ve en önemlisi, OR-PAM olağanüstü hassasiyeti (yani% 100) ile optik soğurma kontrastlar algılar. Floresan mikroskobu ³ veya optik saçılma tabanlı Ekim ⁴ (veya her ikisi ile) ile OR-PAM birleştiren kapsamlı biyolojik dokuların optik özellikleri sağlar. İkincisi, floresan mikroskopi ve OCT saf optik süreçler aksine OR-PAM, akustik dalgalar, optik soğurma kodlar, arka plan ücretsiz algılanmasını sağlar. OR-PAM akustik algılama sinyal bozulması optik saçılma etkileri azaltır ve doğal olarak uyarma, uyarma ve floresans spektrumları arasındaki örtüşme nedeniyle floresan mikroskobu yaygın bir sorundur algılama arasındaki olası etkileşimler (yani, crosstalks) ortadan kaldırır.

Benzersiz optik soğurma görüntüleme için, OR-PAM dahil olmak üzere, icadından bu yana geniş biyomedikal uygulamalar göstermiştir, ^{fakat nöroloji 5, 6, 7 oftalmoloji,} 8, ^vasküler biyoloji ⁹ ve 10 dermatoloji, sınırlı değildir. Bu video, sistem konfigürasyonu ve OR-PAM uyumun yanı sıra, in vivo fonksiyonel mikrovasküler görüntüleme deneysel prosedürleri öğretir .

Protokol

1. Sistem yapılandırması

1. Optik ışınlama
   1. Optik ışınlama kaynağı: solid-state darbeli lazer (INNOSLAB, Edgewave) ve dye lazer (CBR-Ge, Sirah) pompalanır-diyot.
   2. Çıkış lazer ışını (darbe genişliği: 7 ns) (p50c, Thorlabs) 50 mikron iğne deliğinden geçirmek için yoğunlaştırıcı mercek (LA1131, Thorlabs) odaklanmıştır.
   3. Iğne deliği iğne deliği çapı etkin bir mekansal filtreleme için temel mod ışın çapı ile maç kondenser lens odak biraz uzakta konumlandırılmış.
   4. Süzülmüş ışını bir tek modlu optik fiber (P1-460A-FC-2, Thorlabs) içine birleştiğinde sonra bir nötr yoğunluk filtresi (NDC-50C-2M, Thorlabs) ve zayıflatılmış.
   5. 570 nm dalga boyunda bir kırınım sınırlı ~ 2.6 mm optik odak fiber çıkış elde etmek için bir mikroskop objektif arka diyaframı (RMS4X, Thorlabs) doldurur.
2. Ultrasonik algılama
   1. Ultrasonik transdüser: 50-MHz merkez frekansı (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. Ultrasonik sensör, ultrasonik algılama, kırınım sınırlı optik radyoterapi ile aynı eksende hizalanmış bir ev yapımı akustik-optik ışın ^{birleştirici} 11 eklenir .
   3. Küresel kavite akustik lens üretmek için birleştirici alt zemin. Bu akustik lens, su, 0.5 'lik bir sayısal diyafram ve 50-MHz merkez frekansı akustik bir odak çapı 43 mikron verir.
   4. Optik ve akustik odaklar algılama duyarlılığını en üst düzeye çıkarmak için confocally hizalanır.
3. Akustik kaplin
   1. Kuru ultrasonik kaplin erken foto akustik görüntüleme sistemleri ¹² olduğu, su, deney hayvanlarında daldırarak önlemek için kullanılmaktadır .
   2. Petri kabı (çapı 9 cm) altında bir görüntüleme penceresi açılır ve bir ultrasonik ve optik olarak saydam polietilen membran ile mühürlenir.
   3. Polietilen membran ve görüntülü çiftler batık OR-PAM görüntüleme baş Petri kabındaki Petri kabı nesneden oluşturulan foto akustik dalga ve deiyonize su dalgası daha fazla çiftler nesne arasındaki Ultrasonik jel (Temiz görüntü SonoTech) .
4. Elektronik
   1. Ultrasonik sensör tarafından tespit foto akustik sinyal iki basamaklanmasını yükselticiler (ZFL 500LN, Mini-Devreleri) tarafından yükseltilir.
   2. Güçlendirilmiş sinyal 200 MS / s örnekleme oranı 14-bit veri toplama (DAQ) kartı (14200 CompuScope Gage Uygulamalı Bilimler) dijitalleştirilmiştir
5. Şeması Tarama
   1. Raster, yatay (xy) düzlemi boyunca OR-PAM görüntüleme kafa tarama İki boyutlu (2-D) DAQ kurulu ve pompa lazer hem de tetikleyen bir kişisel bilgisayar tarafından kontrol edilir. Tetikleme sinyali DAQ kurulu saat sinyali ile senkronize edilir.
   2. 2-B tarayıcının hızlı eksen kesitsel tarama (B-scan) yönü olarak tanımlanır.
   3. B-tarama görüntü dizisi, doğrudan 3 boyutlu render veya 2-D maksimum genlik projeksiyon (MAP) görüntü ya görülebilir hacimsel bir görüntü oluşturmak için yavaş eksen boyunca görüntüleme kafasını çevirerek elde edilebilir .

2. Sistem hizalama

1. Akustik odak düzlemli konumunu belirlemek için (yani, maksimum darbe-yankı ultrasonik sinyali tetikleme sinyali zaman gecikmesi) darbe-eko ultrason ve ultrasonik reflektör kullanın. Bu adım, OR-PAM sistemi oluştururken sadece bir kez yapılması gereklidir.
2. Single-mode fiber bağlantı verimliliği maksimize.
3. Optik emici bir nesne (örneğin, bir parça siyah bant) üst ultrasonik jel uygulayın ve hafifçe deiyonize su ile doldurulur Petri kabındaki görüntüleme penceresi altına ekleyin.
4. Görüntüleme kafası suya indirin ve akustik mercek altında hava kabarcığı kaldırmak.
5. Emici nesne foto akustik sinyal görüntüleme kafası akustik gecikme değerlendirilecektir akustik odak düzlemli kadar ayarlayın.
6. Düz nesneden oluşturulan foto akustik sinyal genliği en üst düzeye çıkarmak için mikroskop objektif dikey konumda (yani, z konum) ayarlayın. Maksimize sinyal genliği, optik odak dikey yönde akustik odak ile uyumlu olduğunu göstermektedir.
7. Mikroskop amacı yatay pozisyonları (yani, x ve y pozisyonlarını) hedef üretilen foto akustik sinyal simetrik desen görünene kadar ayarlayın. Simetri optik odak yatay yönde akustik odak ile uyumlu olduğunu göstermektedir.
8. Foto akustik sinyal simetri ve genlik hem de optimize kadar 2.6 ve 2.7 adımları tekrarlayın.

3. A sa mple deneysel işlemin in vivo OR-PAM fare kulak vasküler

1. Bu adım, çıplak fareler için gerekli değildir . Bir kokteyl intraperitoneal [:: 0.1 ml/10 g dozu 1 ml ketamin (100 mg / ml), 0.1 ml ksilizin (100 mg / ml) ve 8.9 ml serum fizyolojik tarifi] hayvan anestezisi. Kulak saçlarını tıraş ve daha fazla cerrahi Krem (Kategori: 82.565, American International Industries) ile kalan saç kıllarını deiyonize su ile temizlemeden önce. Gibi epilasyon deri vaskülatürü hafifçe tahriş olabilir ve böylece en iyi 24 saat önce planlanan deney yapılır.
2. Foto akustik lazer sistemi açın ve sistem hizalamayı kontrol edin.
3. Izofluran% 3 buharlaşmış inhalasyon gaz (tipik akış hızı, hayvanın vücut ağırlığına bağlı olarak, 1.0-1.5 lt / dk) ile fare anestezi ve deney boyunca% 1 izofluran ile anestezi korumak. Medikal dereceli hava fare normal fizyolojik durumunu korumak için inhalasyon gaz olarak tavsiye edilir.
4. Stereotaktik bir aşamaya fare aktarın ve bir ısıtma yastığı ile vücut ısısı 37 ° ° C kontrol.
5. Plastik bir plaka üzerinde Düzleştir fare kulak ve kulak üstündeki ultrason jel tabakası uygulayın. Jel içindeki hava kabarcıklarını yakalama kaçının. Daha sonra, görüntüleme penceresi altında kulağı ve ultrason jel temas polietilen membran alt kadar yavaş yavaş hayvan aşamada yükseltmek. Yumuşak kontakt karşı kulak zarı basarak kulağa kan akışını etkileyebilir, çünkü gereklidir.
6. Fizyolojik durumunu izlemek için fare bacak veya kuyruk bir pulse oksimetre Kelepçe, kuruluk ve yanlışlıkla lazer fare gözleri hasarı önlemek için gözlere merhem uygulayın.
7. Akustik lens deiyonize suya batırılır kadar görüntüleme kafasını indirin ve akustik mercek altında hava kabarcığı kaldırmak.
8. Lazer fluens Amerikan Ulusal Standartlar Enstitüsü ¹³ lazer güvenlik standartları içinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Lazer akıcılık, lazer ışını, cilt yüzeyi altındaki 150 mm odaklı lazer darbe enerji 80 NJ çeviren 20 ^mJ / cm 2, geçmemelidir.
9. Lazer harici tetikleme modu ayarlama ve deneme taramayı başlatabilirsiniz. Güçlü foto akustik sinyal akustik odak düzlemli kadar görüntüleme kafa z konumunu ayarlayın.
10. Doğru tarama parametrelerini ayarlayın ve resmi görüntü alımı başlatabilirsiniz.
11. Deney sonucunda, lazer kapatmak, deiyonize su görüntüleme kafasını dışarı çıkarın, fareyi bırakın hayvan evresini, fare kulağı deiyonize su ile temizlemek, anestezi sistemi ve sıcaklık kontrolörü kapatın ve fare boşaltma stereotaktik sahneden.
12. Tekrarlayan görüntüleme gerekli ise, 37 olarak belirlenmiştir çevre sıcaklığı ° C ile bir kuluçka fare koymak Doğal olarak uyanır sonra fare hayvan tesis dönün. Aksi takdirde, euthanatize ve bertaraf hayvan protokolleri uygulayın.

4. Fonksiyonel OR-PAM toplam konsantrasyonu ve hemoglobin oksijen satürasyonu

1. Oksihemoglobin (HBO ₂₎ ve deoksihemoglobin (HBR), hemoglobin iki büyük formlar, görünür spektral aralıkta baskın endojen foto akustik kaynak vardır . HBO ₂ ve HBR farklı optik soğurma spektrumları ve böylece toplam konsantrasyonu (HBT) ve ⁵ hemoglobin oksijen doygunluğu (SO ₂₎ Işıksal ölçmek için ayırt edilebilir. İşte sO ₂ ölçüm için uygun optik dalga boylarında seçmenize yardımcı olmak için iki kurallar şunlardır :
2. Q-bant içinde hemoglobin absorbsiyon spektrumunun (yani, 550-600 nm) dalga boylarında yeterli bir sinyal-gürültü oranı ve yeterli penetrasyon sağlamak için seçilmiş olmalıdır.
3. HBO ₂ ve HBR emme katsayıları belirgin bir fark vardır (örneğin, HBR-egemen 561 nm ve HBO _2-baskın 578 nm) dalga boylarında tavsiye edilir.

SO ₂ yanı sıra, HBT ekleyerek hesaplanabilir [HBR] ve [HBO _2] birlikte veya doğrudan hemoglobin molar sönüm katsayısı spektrumları (örneğin, 530 nm, 545 nm, 570 nm ve isosbestic dalga boylarında ölçülen olabilir HBR ve HBO ₂ eşit molar yok katsayıları 584 nm) ^14,.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1'de gösterildiği gibi çift dalga boyu (561 ve 570 nm) OR-PAM tarafından görüntülü canlı çıplak bir fare kulak vasküler anatomi ve ₂ sO. ~ 80 dakika:: ilgi, böyle bir bölgede ₂ ölçümleri (2.5 mm x 5 mm adım boyutu 10 mm x 10 mm görüntü boyutu) sO çift dalga boyu için tipik bir görüntü elde etme zamanı .

p_upload/2729/2729fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1 in vivo optik çözünürlük foto akustik mikroskopi. (A) (570 nm edinilen) vasküler anatomi gösteren toplam hemoglobin konsantrasyonu ve (B) çıplak bir fare kulak hemoglobin oksijen satürasyonu (561 nm ve 570 nm edinilmiş) HARİTASI görüntüler. (C) Close-up panelinde kutulu bölge (A). Panelindeki ölçekli bar (A) hem (A) geçerlidir ve (B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu video, OR-PAM deneysel protokoller, sistem konfigürasyonuna, sistem hizalama ve tipik deneysel prosedürleri de dahil olmak üzere ayrıntılı bir talimat sağlar. Etiket içermeyen, non-invaziv OR-PAM tek bir kılcal bazında mikrovasküler işleyişi ve metabolizma çalışmaları etkin ve böylece mikrosirkülasyon ilgili fizyoloji ve patoloji anlayışımız genişletmek için bir potansiyele sahiptir. Microphotoacoustics OR-PAM sistemi şu anda bu üretim yapmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler