三次元光学分解能光音響顕微鏡

要約

光学分解能光音響顕微鏡（OR - PAM）は、撮像光学吸収が可能な新たな技術は対照的です。 in vivoで携帯電話の解像度と感度を持つ。ここで、我々は典型的なシステム構成、システムの配置、を含むOR - PAMの実験プロトコル、上に可視化命令を提供する in vivoで実験手順、および機能イメージングの手法。

要約

携帯とオルガネラレベルでの貴重な洞察を提供する光学顕微鏡は、、広く可能にする生物医学技術として認識されている。 in vivoでの柱として、3次元（3 - D）光学顕微鏡、single-/multi-photon蛍光顕微鏡および光コヒーレンストモグラフィは、（OCT）はそれぞれ、蛍光および光散乱コントラストに彼らの異常な感受性を示している。しかし、本質的な生理学的/病理学的情報をエンコードする生体組織の光吸収コントラストでは、、まだ課税をされていない。

生物医学photoacousticsの出現は、光照射が細胞内局在、たとえ¹携帯電話または²レベルの横方向の解像度を達成するための回折限界に焦点を当てている光学顕微鏡の光学解像度光音響顕微鏡（OR - ^PAM）1の新しい枝につながっている。既存の光学顕微鏡技術に貴重な補完するものとして、OR - PAMは、少なくとも2つのノベルティにもたらします。まず、最も重要なことは、OR - PAMは、異常な感度（すなわち、100％）と光吸収のコントラストを検出します。蛍光顕微鏡³でまたは光散乱ベースの10月^4日 （あるいはその両方を持つ）とOR - PAMを組み合わせることにより、生体組織の包括的な光学特性を提供します。第二に、OR - PAMは、蛍光顕微鏡およびOCTの純粋な光学過程とは対照的に、音響波に光吸収を符号化し、バックグラウンドのない検出を提供します。 OR - PAMの音響検出は、信号劣化の光散乱の影響を軽減し、自然に励起し、励起と蛍光スペクトルの重なりに起因する蛍光顕微鏡での共通の問題である検出、間に可能な限り干渉（すなわち、クロストーク）を排除。

光吸収イメージングのためのユニークな、OR - PAMは神経学^5、6、眼科^7、8、血管生物学^9、皮膚科^10、を含むがこれに限定されないが、その発明以来、広範な生物医学アプリケーションを、実証されています。このビデオでは、我々はシステム構成とOR - PAMの配置だけでなく、in vivoで機能的な微小血管イメージングのための実験手順を教える。

プロトコル

1。システムの構成

1. 光照射
   1. 光照射源：固体パルスレーザー（INNOSLAB、Edgewave）と色素レーザー（CBR - D、Sirahを）ダイオード励起。
   2. 出力レーザービームは、（パルス幅：7nsの）（P50C、Thorlabs）50μmのピンホールを通過して集光レンズ（LA1131、Thorlabs）で焦点を当てています。
   3. ピンホールは、効果的な空間フィルタリングのための基本モードビーム径のピンホールの直径に合わせて、集光レンズの焦点から少し離れて配置されている。
   4. フィルタ処理されたビームは、シングルモード光ファイバ（P1 - 460A - FC - 2、Thorlabs）に結合して中性の高密度フィルター（NDC - 50C - 2M、Thorlabs）と減衰されます。
   5. ファイバー出力は570nmの波長で〜2.6μmの回折限界の光学フォーカスを達成するために顕微鏡対物の背面開口部（RMS4X、Thorlabs）を埋めます。
2. 超音波検出
   1. 超音波トランスデューサー：50 MHzの中​​心周波数（V214 - BB - RM、オリンパスNDT）。
   2. 超音波トランスデューサは、回折限界の光照射と同軸に整列される超音波検出、ために自家製音響光学ビームコンバイナ¹¹に接続されている。
   3. 球形空洞は音響レンズを生産するコンバイナの底から粉砕される。この音響レンズは水中で0.5の開口数を有し、50 MHzの中​​心周波数は43μmの音響焦点直径を与えます。
   4. 光学および音響病巣は、検出感度を最大にするconfocally整列されます。
3. 音響結合
   1. 乾燥した超音波カップリングは、初期の光音響イメージングシステム¹²で使用された水、実験動物を水没を避けるために採用されている。
   2. イメージングウィンドウをシャーレ（直径9cm）の底部で開かれており、超音波および光学的に透明なポリエチレン膜で封止されている。
   3. ポリエチレン膜と画像化されたカップルの水没OR - PAMイメージングヘッドにシャーレ内のシャーレへのオブジェクトから生成された光音響波、および脱イオン水をさらに夫婦波になるオブジェクトの間に超音波ジェル（クリア画像、SonoTech） 。
4. エレクトロニクス
   1. 超音波トランスデューサで検出された音響信号は、2つのカスケード接続アンプ（ZFL 500LN、Mini - Circuits社）によって増幅される
   2. 増幅された信号は、200 MS /秒のサンプリングレートで14ビットのデータ集録（DAQ）ボード（CompuScope 14200、ゲージ応用科学）によってデジタル化される
5. スキャン方式
   1. ラスターは水平（XY）平面に沿って、または- PAMイメージングヘッドのスキャンを2次元（2 - D）は、DAQボードとポンプレーザの両方をトリガするパーソナルコンピュータによって制御されます。トリガ信号は、DAQボードからクロックアウト信号に同期しています。
   2. 2次元スキャナの高速軸は断面走査（Bスキャ​​ン）の方向として定義されています。
   3. B -スキャン画像のシーケンスは、直接3次元レンダリングでまたは2 - Dの最大振幅の投影（MAP）の画像のどちらか見ることができる体積のイメージを形成し、遅相軸に沿ってイメージングヘッドを翻訳することで取得することができます。

2。システムの配置

1. 音響焦点面の位置を（すなわち、最大パルスエコー超音波信号にトリガ信号からの遅延時間）を決定するためにパルス - エコーの超音波と超音波反射板を使用してください。このステップは、OR - PAMシステムを構築する際に一度だけ実行する必要がある。
2. シングルモードファイバの結合効率を最大化します。
3. 光学的に吸収するオブジェクト（例えば、黒のテープの部分）の上に超音波ゲルを適用し、静かに脱イオン水で満たされたペトリ皿の中でイメージングウィンドウの下に取り付けます。
4. 水にイメージングヘッドを下ろし、そして音響レンズの下に閉じ込められた空気の泡を取り除く。
5. 吸収物体の光音響信号は、音響遅延から判断することができる音響焦点面、からになるまで、イメージングヘッドを調整します。
6. 平らなオブジェクトから生成された光音響信号の振幅を最大にするために顕微鏡対物レンズの垂直位置（すなわち、zの位置）を調整します。最大化した信号の振幅は、光焦点が垂直方向に音響を中心に揃っていることを示唆している。
7. ターゲットから発生する光音響信号が対称的なパターンが表示されるまで顕微鏡対物の水平位置（すなわち、xとyの位置を）調整する。対称性は、光学フォーカスが水平方向に音響を中心に揃っていることを示唆している。
8. 光音響信号が対称と振幅の両方に最適化されるまでのステップ2.6と2.7を繰り返します。

3。 SA mple実験手続きのin vivo OR - PAMマウス耳管構造の

1. このステップは、ヌードマウスは不要です 。カクテルの腹腔内注射[：;：0.1 ml/10グラム投与量1ミリリットルケタミン（100 mg / ml）を、0.1ミリリットルキシラジン（100 mg / ml）を、8.9 mlの生理食塩水レシピ]で動物を麻酔。耳の毛を剃って、さらにSurgiクリーム（カテゴリ＃：82565、アメリカンインターナショナルインダストリーズ）との残差の毛を脱毛する脱イオン水でクリーニングする前に。そのような脱毛が若干皮膚血管を刺激するかもしれないので、最善の計画的な実験の24時間前に行われることに注意してください。
2. 光音響レーザーシステムの電源を入れ、システムのアライメントを確認してください。
3. 吸入ガス（典型的な流量は、動物の体重に応じて、1.0〜1.5リットル/分である）でイソフルラン3％を気化して、マウスを麻酔し、実験を通してイソフルラン1％の麻酔を維持する。メディカルグレードの空気は、正常な生理状態でマウスを維持するために吸入ガスとして推奨されます。
4. 定位ステージにマウスを移し、そして加熱パッドで37℃の体温° Cを制御します。
5. プラスチック板上にマウスの耳を平らにし、耳の上に超音波ゲルの層を適用する。ゲル内部の気泡をトラップすることは避けてください。その後、イメージングのウィンドウの下に耳を配置し、徐々に超音波ゲルコンタクトポリエチレン膜の底まで、動物の段階を上げる。膜に対して耳を押すと、耳に血流に影響を与える可能性があるので、ソフトコンタクトが必要です。
6. その生理的状態を監視するためにマウスの足や尾部にパルスオキシメータをクランプし、乾燥やマウスの眼への偶発的なレーザーの損傷を防ぐために、目に軟膏を塗る。
7. 音響レンズを脱イオン水に浸漬されるまで、イメージングヘッドを下ろし、そして音響レンズの下に閉じ込められた空気の泡を取り除く。
8. それは米国規格協会¹³のレーザーの安全基準内であることを確認するためにレーザフルエンスを確認してください。レーザーのフルエンスは、レーザビームが皮膚の表面下150μm以下に集束されたレーザパルスのエネルギーの80 NJに変換する20 MJ / cm ^2の 、超えてはならない。
9. 外部トリガモードにレーザーを設定し、裁判のスキャンを開始します。最強の光音響信号が音響焦点面からになるまで、イメージングヘッドのZ位置を調整します。
10. 正しいスキャンパラメータを設定し、正式な画像取得を開始します。
11. 実験後、レーザーをオフにする、、マウスを離す脱イオン水でマウスの耳をきれいに、麻酔のシステムと温度コントローラをオフにし、マウスをアンロードするために動物の段階を下げ、脱イオン水のイメージングヘッドを持ち上げ定位のステージから。
12. 反復的なイメージングが必要な場合は、37℃で設定された環境温度℃でインキュベーターにマウスを置くそれが自然にウェイクアップ後の動物施設にマウスを返します。そうでなければ、euthanatizeとそれを処分するために動物のプロトコルに従ってください。

4。機能的OR - PAM総濃度とヘモグロビンの酸素飽和度の

1. オキシヘモグロビン（HBO _2） ​​とデオキシヘモグロビン（HBR）はヘモグロビンの二つの主要な形態、可視スペクトル領域で支配的な内因性光音響源です。 HBO ₂とHBRは、別個の光吸収スペクトルを有し、したがってスペクトルヘモグロビン⁵の合計濃度（HBT）と酸素飽和度（SO _2）の両方を定量化するために区別することができます。ここでSO ₂の測定のための適切な光波長を選択するのに役立つ2つのガイドラインは以下のとおりです。
2. 波長が十分な信号対雑音比と十分な浸透を確実にするためにヘモグロビンの吸収スペクトル（すなわち、550〜600 nm）のQ -バンドの中で選択する必要があります。
3. HBO _2、HBRの吸収係数は顕著な違い（例えば、HBR -支配的な561 nmのとHBO ₂ -支配的な578 nm）を持つ波長が推奨されます。

SO ₂に加えて、HBTは追加[HBR]と[HBO _2]を一緒にして計算することができる、または、直接ヘモグロビンのモル吸光係数スペクトルの等吸収波長で測定することができます（例えば、530nmで、545 nmの、570nm以下、及びHBRとHBO _2は等しいモル吸光係数が584 nm）を^14。

5。代表的な結果：

図1に示すように血管解剖とSO ₂のデュアル波長（561および570 nm）のOR - PAMによって撮像された生きているヌードマウスの耳の中にあります。デュアル波長の典型的な画像取得時間は、関心のような地域のSO ₂の測定（画像サイズ：10ミリメートル× 10ミリメートル、ステップサイズ：2.5μmの× 5μm）を〜80分です。

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図1。 生体光学分解能光音響顕微鏡で 。血管の解剖学的構造を示す（A）総ヘモグロビン濃度（570 nmで買収）とヌードマウスの耳の中に（B）ヘモグロビンの酸素飽和度（561 nmと570 nmで取得した）のMAP画像。 （C）クローズアップパネルで囲み領域（）の。パネルのスケールバーは、（）両方（）と（B）に適用されます。

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ディスカッション

このビデオでは、我々は、システム構成、システムのアライメント、および典型的な実験手順を含むOR - PAMの実験的なプロトコルに関する詳細な指示を提供しています。ラベルのない、非侵襲的OR - PAMは、シングルキャピラリー的に微小血管機能と代謝の研究を有効にし、それにより微小循環に関連した生理学と病理学の理解を拡大する可能性を保持しています。 Microphotoacousticsは現在、このO...

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