Cryopreservation של עוברים Preimplantation של בקר, כבשים ועזים

Summary

עוברים Preimplantation ניתן cryopreserved לאחר מיקום בפתרון cryoprotective hypertonic לגרום להתייבשות הסלולר. לאחר איזון, היווצרות קרח קריסטל מושרה בפתרון המקיף את העובר. התייבשות נוספת מתרחשת כאשר העובר הוא מקורר לאט לטמפרטורות שמתחת לאפס לפני צולל לתוך חנקן נוזלי לאחסון.

Abstract

עוברים Preimplantation מן בקר, כבשים, עזים עשוי להיות cryopreserved לאחסון קצר או ארוך טווח. עוברים Preimplantation מורכב בעיקר מים, הימנעות היווצרות קרח תאיים קריסטל בתהליך cryopreservation היא בעלת חשיבות עליונה לשמור על כדאיות העובר. עוברים ממוקמים בפתרון hypertonic (1.4-1.5 מ ') של סוכן cryoprotective (CPA), כגון אתילן גליקול (למשל) או גליצרול (GLYC) כדי ליצור שיפוע האוסמוטי המאפשרת התייבשות הסלולר. לאחר עוברים להגיע לשיווי משקל אוסמוטי בפתרון רו"ח, שהם נטענים בנפרד הפתרון רו"ח hypertonic לתוך 0.25 קשיות מ"ל להקפאה. עוברים הם מכניסים למקפיא שיעור מבוקר בטמפרטורה של -6 ° C. היווצרות קרח קריסטל מושרה בתמיסה רו"ח המקיפים את העובר, וגיבוש גורמת לעלייה בריכוז של רו"ח החיצוני של העובר, ולגרום להתייבשות סלולרית נוספת. עוברים הם מקורר בקצב של 0.5 דקות ° / C, המאפשר התייבשות נוספת, לטמפרטורה של -34 מעלות צלזיוס, בטרם צלל לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C). עוברים Cryopreserved חייב להפשיר לפני העברת לנמען (פונדקאית) נקבה. קשיות המכילות את העוברים יוסרו דיואר החנקן הנוזלי, שנערך באוויר החדר הטמפרטורה במשך 3 עד 5 שניות, והניח בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים 25 עד 30 שניות. עוברים cryopreserved ב GLYC ממוקמות לתוך פתרון 1 M של סוכרוז במשך 10 דקות להסרה של רו"ח לפני העברה לנמען (פונדקאית) נקבה. עוברים cryopreserved ב EG, לעומת זאת, ניתן להעביר ישירות אל הרחם של הנמען.

Protocol

1. הערכת התאמתם של עוברים cryopreservation ¹

1. דוגמאות שנקטפו מן באיברי הרבייה של נקבות אדם התורם צריך להיות ממוקם בתוך המדיום עובר איזוטוני מחזיק במשך 10 דקות לפני הערכה באמצעות stereomicroscope. כדי להיות בטוח לשמור עוברים מן הנקבה כל התורם נפרדים אחד מהשני כדי לאפשר זיהוי של הורות של צאצאים החזרת העוברים.
2. שימוש בהגדלה נמוכה (≤ 10X), דגימות מן הנקבה תורם יחיד צריך להיות הפרדה לקבוצות נפרדות בהיקף של ביצית מופרית, מנוונת עוברים, או עוברים באיכות להעברה. רק בכיתה איכות 1 או 2 עוברים ב morula קומפקטית שלבים הבלסטוציסט מורחבת של התפתחות מתאימים cryopreservation, וכל השאר אמור להיות מושלך (אלא אם כן הנקבות הנמען סינכרוני זמינים עבור כיתה איכות 3 עוברים ושיעור שלאחר העברת ההריון של כ 25 % -30 נחשב מקובל).
3. בדוק כיתה איכות 1 ו -2 morula קומפקטי עוברים דרך שלב הבלסטוציסט מורחבת בהגדלה 50X ≥ להבטיח כי pellucida zona של העובר תקין וכי יש חומר לא (למשל, תאים, ריר) דבקות pellucida zona. כל העובר עם סדוק או חסר zona pellucida או עם pellucida zona שיש חומר חסיד צריך להיות הפרדה מעוברים אחרים, או להיות מושלך או מעובד בנפרד.

2. עוברים כביסה להפחתת הסבירות של העברת מחלות ²

1. העבר zona pellucida-שלמים עוברים בהיקף מינימלי של המדיום העובר איזוטוני מחזיק לתוך הבאר הראשונה של המדיום עובר כביסה (למשל, פוספט שנאגרו מלוחים מוגבר עם אנטיביוטיקה שור סרום סרום אלבומין, עגל בן יומו, או פוליוויניל אלכוהול). שמור עוברים מן הנקבה כל התורם נפרד, אל תנסה לשטוף יותר מ -10 עוברים בבת אחת. העברת עוברים בהיקף מינימלי של המדיום לתוך לשטוף כל רצופים כדי להשיג דילול סדרתי ≥ 1:100, ולהיות בטוח לשימוש סטרילי טיפול העובר טיפים משתנים בין לשטוף כל רצופים.
2. העברת עוברים דרך 4 שוטף יותר כמתואר 2.1.
3. אם העברת מחלות ויראליות היא דאגה, לשטוף עוברים פעמיים בתמיסה טריפסין 0.25%, בפעם חשיפה סך בשילוב טריפסין של לא יותר מ 90 שניות.
4. אחרי שתי שוטף טריפסין, לשטוף עוברים פי 5 יותר במדיום העובר כביסה כמתואר 2.1.
5. לאחר לשטוף העובר הסופי, עוברים מקום לעובר איזוטוני מחזיק בינוני.

3. Dehydrating עוברים לפני cryopreservation ³

1. לעוברים יש להעביר בהיקף מינימלי של המדיום העובר איזוטוני מחזיק בפתרון hypertonic (1.4-1.5 ריכוז שן טוחנת) של סוכן cryoprotective (CPA), כגון אתילן גליקול או גליצרול.
2. אפשר עוברים לשבת בינוני הקפאה (hypertonic פתרון רו"ח) עד שהם מגיעים לשיווי משקל אוסמוטי. מכיוון אתילן גליקול מחלחלת תאים עובריים במהירות רבה יותר מאשר עושה גליצרול, פעמים איזון הם בדרך כלל פחות עוברים אתילן גליקול (5 דקות) מאשר גליצרול (10 דקות). חלק מהזמן הזה ניתן להשיג איזון במהלך ואחרי עוברים נטענים לתוך קשיות (מתואר השלב הבא).

4. טוען עוברים לתוך קש פלסטיק 0.25 מ"ל עבור cryopreservation

1. צרף את התקע כותנה סוף קש 0.25 מ"ל פלסטיק (11.5 ס"מ אורך העבודה) להתקן טעינה העובר, וכן לשאוב כ 1.3 ס"מ של פתרון רו"ח hypertonic לתוך קשית שכותרתו כהלכה. מגוון פרוצדורות תיוג קיים, כולל השימוש בתוויות מודפסות המצורפת או תקע איטום קש או קש אחר מחובר עם מתאם קש.
2. הסר את קש מפתרון רו"ח, ואת לשאוב כ 0.15 ס"מ של אוויר כדי ליצור בועות אוויר זעירות בתוך הקש.
3. לשאוב עובר יחיד כ 0.8 ס"מ של פתרון רו"ח hypertonic לתוך הקש.
4. הסר את קש מפתרון רו"ח לשאוב כ 0.15 ס"מ של אוויר כדי ליצור בועות אוויר זעירות second בתוך הקש (בועות אוויר לשרת פיזית לבודד את העובר בתוך הקשית).
5. לשאוב כ 9.1 ס"מ של פתרון רו"ח למלא לגמרי את הקשית, להיות בטוח כדי למשוך בנפח מספיק של פתרון רו"ח כדי ללחלח את polyvinylchloride (PVC) אבקת שקיים בתוך סוף כותנה התקע של הקש. הפתרון רו"ח גורם אבקת PVC להגליד ואת החותם כי בסופו של הקש.
6. חותם את הקצה השני של הקשית עם אבקת PVC, פלסטיק איטום תקעים קש, או אוטם חום.

5. הצבת עוברים לתוך מכונת דרג מבוקרת העובר הקפאת

1. אמבטיה או מתנול או חנקן נוזלי אדי מכונות הקפאת יכול להיות מתוכנת עבור cryopreservation של עוברים preimplantation.
2. טען את קשיות המכילות את embry os למכונת הקפאה שהטמפרטורה שלה כבר מקורר מ טמפרטורת הסביבה כדי -6 ° C. טען בקש תקע כותנה בסופו של דבר (אלא אם כן פלסטיק איטום קש תקעים או מתאמי קש נמצאים בשימוש, בהם כותנה מקרה בסוף תקע ממוקם מטה).
3. אפשר עוברים לשבת בטמפרטורת זה לפחות 2 דקות לפני שתמשיך.

6. זרוע

1. לאחר עוברים יש מקורר -6 ° C, להשתמש זוג מלקחיים בקירור בחנקן נוזלי (או מקל כותנה שקצהו שקוע חנקן נוזלי) כדי לגרום להיווצרות גבישי קרח בפתרון רו"ח בתוך הקש ידי נגיעה מלקחיים (או כותנה מקל שקצהו) לעמודה של פתרון מעל או מתחת העובר.
2. המים הפתרון רו"ח יהיה להתגבש באזור חשוף חנקן נוזלי, וגבישי קרח יתפשט הטור של פתרון רו"ח מיד סביב העובר.
3. החזק עוברים על זריעת הטמפרטורה במשך 10 דקות לפני קירור נוסף.

7. התייבשות המשך של עוברים

1. עוברים מגניב בשיעור של 0.5 ° C / min עד לטמפרטורה של -34 ° C. זה קצב הקירור חשוב לוודא התייבשות המשיכה של העובר.
2. החזק עוברים ב -34 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הזינוק עוברים לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C).
3. המקום cryopreserved עוברים לתוך הגביע שכותרתו כראוי (מלא חנקן נוזלי) מצורף מקל שכותרתו כראוי, ומקום את המקל לתוך מיכל של חנקן נוזלי דיואר לאחסון קצר או ארוך טווח.

8. הפשרת עוברים Cryopreserved

1. משוך את המכל לתוך הצוואר של חנקן נוזלי דיואר, להבטיח כי מיכל נשארת מתחת לקו הכפור של דיואר.
2. אתר את מקל המכיל את העובר להיות מופשר, במהירות ובזהירות להסיר את קש מן הגביע, להיות בטוח שלא חם בקש אחרים הגביע.
3. החזק את מקש באוויר למשך 3-5 שניות (כדי להפחית את שכיחות סדוק zona pellucida ^4), ​​ואז לצלול לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים 25-30 שניות נוספות.
4. הסר את קש מן האמבט במים, לנגב את קש (נזהרים שלא למרוח את הזיהוי העובר על הקש), להשתמש בהתקן קש חיתוך לחתוך את הקצה הלא כותנה תקע קש (אם באמצעות חום אטום או אבקת PVC ), או להסיר בזהירות את התקע איטום פלסטיק, או:
   1. לטעון את קש לתוך המכשיר עובר העברה ולהעביר מהר ככל האפשר לנמען העובר סינכרוני (אבל רק אם העובר היה cryopreserved באמצעות אתילן גליקול כמו רו"ח), או
   2. להחזיק את הקצה הפתוח של הקשית מעל צלחת המכילה ריכוז 1.0 שן טוחנת של סוכרוז (תרכובת בלתי המחלחל), ולהשתמש זוג מספריים כדי לחתוך את התקע כותנה סוף הקש. תוכן קש צריך לזרום בחופשיות הפתרון סוכרוז, אבל דוחף עמודה קטנה של אויר דרך הקש עשוי להיות נחוץ אם בכלל בינוני שיורית קיימת בתוך הקש. אפשר עוברי להישאר פתרון סוכרוז למשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר עוברים לעובר איזוטוני מחזיק בינוני למשך 10 דקות. הערכת עוברים שלאחר ההפשרה, לטעון לתוך קש חדש, להעביר לנמען נקבות מתאים.

9. נציג תוצאות:

מגוון של גורמים עשויים להשפיע על ההריון לחיות שיעורי הילודה הנובע העברת קפוא מופשר עוברים preimplantation לנקבות הנמען סינכרוני ^5. עוברים בשלבים התפתחותיים מתקדמים פחות morula קומפקטי או מתקדם יותר הבלסטוציסט מורחבת לעיתים קרובות אינם שורדים את תהליך cryopreservation כמו גם העוברים על morula קומפקטית, הבלסטוציסט מוקדם, הבלסטוציסט, ובשלבים הבלסטוציסט מורחבת של ההתפתחות העוברית. עוברים כיתה איכות 1 ו -2 תשואה גבוהה יותר לאחר ההפשרה שיעורי ההריון מאשר ציון איכות 3 עוברים (אשר בדרך כלל אינם cryopreserved בגלל שלאחר ההפשרה נמוכים ההריון). עוברים כשלה במהלך הקפאת העובר או העובר הפשרת ההליכים צפויים להפגין שיעורי ההריון מופחת. העוברים הועברו הנקבות הנמען אשר מחזורי הייחום אינם מסונכרנים עם זה של הנקבה תורם בדרך כלל לייצר שיעור ההריונות נמוך יותר. עוברים מיוצרים במבחנה או להשפיע בצורה כלשהי (למשל, ביופסיה או חצוי) בדרך כלל תשואה שיעור ההריונות נמוך יותר. בתנאים אופטימליים, שיעור ההריונות שהושגו לאחר העברת קפוא מופשר בעוברים נגזר vivo הוא בדרך כלל 60-70% בבקר ^6,7, 65-75% בכבשים ^8,9,10,11, ו - 60-70% ב עיזים ^12,13,14,15. באופן דומה, שיעור ההריונות שהושגו לאחר העברת קפוא מופשר עוברי מבחנה מיוצר בדרך כלל 40-50% בבקר ^6,16, 25-35% ב ¹⁷ כבשים, ו -% 30-40 ב ¹⁸ עזים.

ble 1 "/>

טבלה 1. שיעורי ההריון הצפוי בעקבות העברת עוברים מוקפאים, מופשרים של מינים מקומיים בעלי חיים מעלה גירה נקבות הנמען סינכרוני.

Discussion

מכיוון עוברים מורכב בעיקר מים, חשוב כי עוברי preimplantation להיות מיובש כראוי ומקורר לאט בהתאם לפרוטוקול המתוארים כאן, כדי למנוע היווצרות תאיים גביש קרח. לאחר תהליך הקירור החלה, חשוב לשמור על שינוי טמפרטורה חד כיווני, כדי למנוע תנודות הטמפרטורה. ייזום של היווצרות גבישים קרח ("זריעה") בטמפרטורה מתאימה לפתרון רו"ח ספציפי הוא קריטי.

עשיית שינויים קירור זה איטי / שיטת הפשרה מהירה עבור cryopreservation העובר preimplantation כוללים את השיטה צעד אחד (שם העמודה האחרונה של המדיום נטען לתוך קש הוא סוכרוז במקום פתרון רו"ח) ¹⁹ ואת שיטת ההעברה הישירה (שם עוברים מוקפאים ב אתילן גליקול הם הפשירו והועברו ישירות אל הרחם של נקבה הנמען מבלי להסיר את אתילן גליקול מן העובר) ^20. כדי להפחית את עוצמת הקול של אתילן גליקול שהופקדו אל תוך הרחם של העברה ישירה (DT) נקבה הנמען, רצוי למלא את קש 0.25 מ"ל עם 6 ס"מ מחזיק בינוני לפני שתמשיך כפי שתואר לעיל. יצוין כי תקן וולונטרי שקיים בתוך תעשיית העברת מסחרי העובר כי עוברי preimplantation cryopreserved עבור DT צריך להיות קפוא צהוב בצבע קש ומאוחסנים בצבע צהוב גביעים של חנקן נוזלי דיואר. ענף מסחרי יש גם דרישות סימון ספציפיות עבור כל עוברי cryopreserved בה יש ללכת.

חלופה אחת לשיטה זו vitrification ^21, שיטה של שיווי משקל בלתי cryopreservation שם יותר מרוכז מאוד (6-8 מ ') רו"ח הפתרון הוא מקורר אולטרה במהירות גורם פתרון רו"ח לשנות מנוזל מדינה "זגוגיות" ללא קרח היווצרות גבישים. Vitrification סביר יותר מתאים cryopreservation של עוברים כי הם פחות מתקדמים יותר מבחינה התפתחותית morula קומפקטי עקב רגישות מוגברת שלהם הטמפרטורה.

טכניקה זו בקשה לשימור המשאבים הייחודיים germplasm ^22, כמו גם את תעשיית העברה בינלאומית מסחרית עובר שם יותר מ 55% של כ 500,000 עוברי preimplantation שור הועבר בשנה הקלנדרית 2008 היו cryopreserved. ²³

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
BioLife בינוני להקפיא	Agtech, Inc	C18, C18A	1.5 מ אתילן גליקול
אתילן גליקול Emcare להקפיא פתרון	ICPBio רפרודוקציה	IC8, IC10	1.5 מ אתילן גליקול
אתילן גליקול ViGro להקפיא פלוס	Bioniche לבריאות בעלי חיים	EVM835	1.5 מ אתילן גליקול
Emcare 10% גליצרול להקפיא פתרון	ICPBio רפרודוקציה	IC12	1.34 מ 'גליצרול
Emcare 1 M להפשיר סוכרוז	ICPBio רפרודוקציה	IC16	סוכרוז 1.0 M
ViGro צעד אחד ההפשרה	Bioniche לבריאות בעלי חיים	EVM247, EVM847	סוכרוז 1.0 M
ViGro להפשיר 1-2-3 פלוס	Bioniche לבריאות בעלי חיים	EVM248, EVM848	5%, 2.5%, 0% גליצרול עם 0.5, 0.5, סוכרוז 0.6%
Emcare CSU מפשיר ערכת	ICPBio רפרודוקציה	IC20	6%, 3%, 0% גליצרול עם סוכרוז 10.3%
BioLife מחזיק ובינוניים להעביר	Agtech, Inc	C15, C15A	שונה PBS BSA עם 0.4% (שור אלבומין)
Emcare פתרון מחזיק	ICPBio רפרודוקציה	IC2, IC4, IC6	0.4% BSA (אלבומין בסרום שור), מאגר מגבים (zwitterions אינרטי)
ViGro מחזיק פלוס	Bioniche לבריאות בעלי חיים	EVM024, EVM824
SYNGRO אחזקות בינוני	Bioniche לבריאות בעלי חיים	ESM024, ESM224, ESM828	מכיל hyaluronan; אין מוצרים מן החי
BioLife שונה D-PBS	Agtech, Inc	C06	פוספט שונה של Dulbecco שנאגרו מלוחים
BioLife BSA שבר V	Agtech, Inc	B09	lyophilized שור סרום אלבומין, חלק V
BioLife לאנטיביוטיקה antimycotic	Agtech, Inc	B01	amphotericin-B, פניצילין G, סולפט סטרפטומיצין
BioLife טריפסין ערכת	Agtech, Inc	C22A	25 גרם lyophilized טריפסין, מים סטריליים, סטרילי D-PBS

שם הציוד	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
Biol-Cool בקצב מבוקר במקפיא	FTS מערכות	BC-IV -40	אמבטיה מתנול במקפיא
להקפיא במקפיא מבוקר בקרת קצב	Cryologic	CL2200	חנקן נוזלי מקפיא