Криоконсервация Предимплантационная Эмбрионы крупного рогатого скота, овец и коз

Резюме

Предимплантационная эмбрионы могут быть криоконсервированных после размещения в гипертонический раствор криопротекторных вызывать сотовых обезвоживание. После уравновешивания, ледовые образования кристаллов индуцируется в решении окружающих эмбрион. Дальнейшее обезвоживание происходит, как эмбрион медленно охлаждается до отрицательных температур до погружения в жидкий азот для хранения.

Аннотация

Предимплантационная эмбрионов крупного рогатого скота, овец, коз и может быть криоконсервированных для краткосрочного или долгосрочного хранения. Предимплантационная эмбрионы состоят преимущественно из воды, и избежании внутриклеточное образование кристаллов льда при криоконсервации процесс имеет первостепенное значение для поддержания жизнеспособности эмбриона. Эмбрионы помещаются в гипертонический раствор (1,4 - 1,5 М) криопротектор (CPA), таких как этиленгликоль (ЭГ) или глицерин (GLYC) для создания осмотического градиента, что облегчает сотовых обезвоживание. После эмбрионы достигают осмотического равновесия в решении CPA, они индивидуально загружалась в гипертонический раствор ВМС в 0,25 мл пластиковые соломинки для замораживания. Эмбрионы помещаются в морозильную камеру контролируемой скорости при температуре -6 ° C. Лед образования кристаллов индуцируется в решении CPA окружающих эмбрион, и кристаллизация приводит к увеличению концентрации CPA вне эмбриона, что приводит к дальнейшему сотовых обезвоживание. Эмбрионы охлаждали со скоростью 0,5 ° С / мин, что позволяет дальнейшее обезвоживание, при температуре до -34 ° C, прежде чем погрузился в жидкий азот (-196 ° C). Криоконсервированных эмбрионов должно быть талой до передачи получателю (суррогатные) женщин. Соломка содержащих эмбрионы удаляются с жидким азотом сосуд Дьюара, который состоялся в комнате температура воздуха от 3 до 5 сек, и помещается в 37 ° С водяной бане в течение 25 до 30 сек. Эмбрионы криоконсервированных в GLYC помещаются в 1 М растворе сахарозы в течение 10 мин для удаления ВМС до перевода получателю (суррогатные) женщин. Эмбрионы криоконсервированных в EG, однако, могут быть непосредственно переданы в матку реципиента.

протокол

1. Оценка пригодности для криоконсервации эмбрионов ¹

1. Образцы собраны из половых путей женщины индивидуальных доноров должны быть помещены в изотоническом эмбриона среда для проведения за 10 минут до оценки с использованием стереомикроскопа. Будьте уверены, чтобы сохранить эмбрионов от каждого донора женщины отдельно друг от друга, чтобы можно было установить происхождение эмбриона потомство передачи.
2. Использование малом увеличении (≤ 10 раз), образцы из отдельных женщин донора должны быть разделены на отдельные группы, состоящие из неоплодотворенных яйцеклеток, вырожденные эмбрионов, или передаче эмбрионов качества. Только качество класса 1 или 2 эмбрионов на компактные морулы через расширение этапах развития бластоцисты подходят для криоконсервации, а все остальные должны быть отброшены (если синхронную женщин получателя доступны для качества 3-м классе эмбрионов и после передачи беременности скоростью около 25 -30% считается приемлемой).
3. Проверьте качество класса 1 и 2 компактные морулы через расширение эмбрионов стадии бластоцисты при увеличении ≥ 50 раз, чтобы убедиться, что зона pellucida зародыша не поврежден и что нет материала (например, клеток, слизи) придерживаясь зона pellucida. Любой эмбрион с трещинами или отсутствует зона pellucida или зона pellucida имеющих приверженцем материалы должны быть отделены от других эмбрионов и либо быть уничтожены или обработаны по отдельности.

2. Стиральная эмбрионов для уменьшения вероятности передачи заболевания ²

1. Перемещение зона pellucida-нетронутыми эмбрионов в минимальном объеме изотонического эмбриона проведения среду в первой скважины эмбриона промыванием (например, фосфатно-солевым буфером дополнены антибиотиков и бычий сывороточный альбумин, новорожденных телячьей сыворотки или поливинилового спирта). Держите эмбрионов от каждого донора женщины отдельно, и не пытайтесь мыть более 10 эмбрионов в одно время. Перемещение эмбрионов в минимальном объеме среды в каждой последующей стирки для достижения серийного разведения ≥ 1:100, и быть уверенным, использовать стерильную эмбриона обработки советы, которые изменились между каждой последующей стирки.
2. Перемещение через эмбрионов еще 4 моет, как описано в пункте 2.1.
3. Если заражения вирусными заболеваниями вызывает беспокойство, мыть эмбрионов два раза в 0,25% раствора трипсина, в общей сложности общее время воздействия трипсина не более 90 секунд.
4. После двух моет трипсина, мыть эмбрионов в 5 раз больше в зародыше стиральной среду, как описано в пункте 2.1.
5. После последней промывки зародыша, эмбриона место в изотонический эмбриона проведение среды.

3. Кондитерские эмбрионов Криоконсервация До ³

1. Эмбрионы должны быть переданы в минимальном объеме изотонического среда проведения эмбриона в гипертонический раствор (1,4-1,5 Молярная концентрация) криопротектор (CPA), таких как этиленгликоль или глицерин.
2. Разрешить эмбрионов, чтобы сидеть в морозную среду (гипертонический раствор CPA), пока не достигнут осмотического равновесия. Поскольку этиленгликоль пронизывает эмбриональные клетки быстрее, чем глицерин, уравновешивание раз, как правило, меньше эмбрионов в этиленгликоль (5 мин), чем в глицерин (10 мин). Часть этого времени равновесие может быть достигнуто во время и после эмбрионов загружаются в соломинки (описанные в следующем шаге).

4. Загрузка Эмбрионы в 0,25 Солома Пластиковые мл для криоконсервации

1. Приложите конец ватный тампон из 0,25 мл пластиковых соломы (11,5 см рабочую длину), чтобы устройство загрузки эмбриона, и аспирата около 1,3 см гипертонический раствор ВМС в соответствующую маркировку соломы. Различные процедуры маркировки существует, в том числе использование этикетки прикреплены к любой плагин уплотнения соломы или другой соломы связано с соломой адаптера.
2. Удалить из соломы решение CPA, и аспирата примерно 0,15 см воздуха для создания крошечных воздушных пузырьков внутри соломой.
3. Аспирируйте одного эмбриона в примерно 0,8 см гипертонический раствор ВМС в соломе.
4. Удалить из соломы решение ВМС и аспирации примерно 0,15 см воздуха, чтобы создать второй крошечный пузырек воздуха в пределах соломы (пузырьки воздуха служат для физически изолировать эмбрион в течение соломы).
5. Аспирируйте примерно 9,1 см раствора CPA, чтобы полностью заполнить соломы, будучи уверенным, чтобы привлечь в достаточном объеме раствора CPA, чтобы увлажнить поливинилхлорида (ПВХ) порошок, который существует в конце ватный тампон из соломы. Решение CPA причины порошка ПВХ в гель и печатью, что конец соломы.
6. Печать другом конце соломы с ПВХ порошок, пластмассовые пробки уплотнения соломы, или тепло герметик.

5. Размещение Эмбрионы в контролируемой машины эмбрионов Замораживание Оценить

1. Либо ванны метанол или жидкие машин парах азота замораживания может быть запрограммирован для криоконсервации эмбрионов предимплантационной.
2. Нагрузка соломинки содержащие Эмбри ОС в замораживании машину, температура которого была охлаждена от температуры окружающей среды до -6 ° С. Нагрузка соломинки ватный тампон в конечном итоге (если пластик соломы герметичные заглушки или соломы адаптеров используются, и в этом случае ватный тампон конце помещается вниз).
3. Разрешить эмбрионов сидеть при этой температуре не менее 2 минут перед началом работы.

6. Посев

1. Как только эмбрионы не остынет до -6 ° C, используйте щипцы переохлажденного в жидкий азот (или хлопка наконечником палки, погруженной в жидкий азот), чтобы вызвать образование кристаллов льда в решении CPA внутри соломой, касаясь щипцы (или хлопка наконечником палки) на колонку раствора выше или ниже эмбриона.
2. Воды в растворе ВМС будет кристаллизоваться в регионе воздействию жидкого азота, а кристаллы льда будет распространяться на колонке решение CPA непосредственно вокруг эмбриона.
3. Держите эмбрионов при посеве температуре в течение 10 минут перед дальнейшим охлаждением.

7. Продолжая обезвоживание эмбрионов

1. Прохладный эмбрионов со скоростью 0,5 ° С / мин до температуры -34 ° C. Это скорость охлаждения важно для обеспечения постоянного обезвоживания эмбриона.
2. Держите эмбрионов на -34 ° С в течение 10 минут перед погружением эмбрионов в жидком азоте (-196 ° C).
3. Место криоконсервированных эмбрионов в соответствующей маркировкой кубок (с жидким азотом), подключенных к соответствующим ярлыком тростника, и место тростника в канистру жидким азотом сосуд Дьюара для короткого или длительного хранения.

8. Размораживание криоконсервированных эмбрионов

1. Вытяните канистру в шею жидким азотом сосуд Дьюара, гарантируя, что канистра остается ниже промерзания в сосуд Дьюара.
2. Найдите тростника содержащие эмбриона можно разморозить, а также быстро и осторожно удалите соломы из кубка, будучи заведомо не теплый других соломинку в бокал.
3. Держите соломы на воздухе в течение 3-5 секунд (для снижения заболеваемости трещины зона pellucida ^4), ​​а затем погружаться в 37 ° С водяной бане в течение дополнительных 25-30 секунд.
4. Удалить из соломы водяной бане, протрите соломы (будьте осторожны, чтобы не размазать эмбриона идентификации на соломе), использование соломы резки отхватить без ватный тампон конце соломы (если запечатанных с использованием тепла или ПВХ порошок ), или осторожно удалите пластиковую крышку уплотнения, и либо:
   1. нагрузки солому в устройство переноса эмбрионов и передачу как можно быстрее, чтобы синхронных получателя эмбриона (но только если эмбрион криоконсервированных использовании этиленгликоля как CPA), или
   2. провести открытый конец соломы на блюдо с 1,0 Молярная концентрация сахарозы (без пронизывающей соединения), а также использовать ножницы, чтобы отрезать конец ватный тампон из соломы. Содержание солома должна свободно течь в растворе сахарозы, но нажатия небольшой столб воздуха через соломинку может потребоваться, если какой-либо остаточной среде существует внутри соломой. Разрешить эмбрионов оставаться в растворе сахарозы в течение 10 минут, а затем передать эмбрионов в изотонический эмбриона проведения среду в течение 10 минут. Оценка эмбрионов после оттепели, загрузить в новой соломы, и трансфер в подходящих женщин получателя.

9. Представитель Результаты:

Целый ряд факторов может повлиять на беременность и жить рождаемости в результате перевода замороженных размороженные эмбрионы предимплантационной синхронной женщин получателя ^5. Эмбрионы на стадии развития менее развитых, чем компактные морулы или более продвинутыми, чем расширил бластоцисты часто не выживают криоконсервации процесса, а также эмбрионов на компактные морулы, ранние бластоцисты, бластоцисты, и расширил бластоцисты стадиях эмбрионального развития. Эмбрионы качества класса 1 и 2 дают более высокий пост-оттаивания наступления беременности, чем качество эмбрионов 3-й степени (который обычно не криоконсервированных из-за низкой ставки-оттаивания беременности). Эмбрионы неправильно во время замораживания эмбрионов или эмбриона оттаивания процедуры, скорее всего, проявлять сниженным ставкам беременности. Эмбрионы передается получателю женщин которого эстрального цикла не синхронизированы с донорской женщины обычно производят более низкие ставки беременности. Эмбрионы производятся в пробирке или каким-то образом (например, биопсии или пополам) обычно дают более низкие ставки беременности. При оптимальных условиях, частота наступления беременности, полученные после перевода замороженных талых в естественных производных эмбрионов, как правило, 60-70% у крупного рогатого скота ^6,7, 65-75% у овец ^8,9,10,11, и 60-70% у коз ^12,13,14,15. Аналогичным образом, частота наступления беременности, полученные после перевода замороженных талых в пробирке эмбрионы производятся, как правило, 40-50% у крупного рогатого скота ^6,16, 25-35% у овец ^17, и 30-40% у коз ^18.

BLE 1 "/>

Таблица 1. Ожидаемая частота наступления беременности после перевода замороженных-размороженные эмбрионы из отечественных видов жвачных животных в синхронных женщин получателя.

Обсуждение

Поскольку эмбрионы состоят преимущественно из воды, очень важно, чтобы предимплантационной эмбрионов быть адекватно обезвоженной и медленно охлаждают в соответствии с протоколом, описанные здесь, чтобы избежать внутриклеточное образование кристаллов льда. После охлаждения процесс уже начался, очень важно для поддержания однонаправленного изменения температуры и избежать колебания температуры. Начало формирование кристаллов льда ("посева") в соответствующей температуры для конкретного решения CPA имеет решающее значение.

Модификации этого медленного охлаждения / быстрое таяние метод криоконсервации эмбрионов предимплантационной включают один шаг метода (где последняя колонка среднего загружаются в соломенной является сахароза, а не решение CPA) ¹⁹ и прямого метода передачи (где эмбрионы заморожены в этиленгликоль размораживают и передаются непосредственно в матку женщины получателя без предварительного удаления этиленгликоля из эмбриона) ^20. Для уменьшения объема этиленгликоля на хранение в матку прямой передачи (DT) получателя женщина, желательно, чтобы заполнить 0,25 мл соломы с 6 см проведения среду, прежде чем продолжить, как описано выше. Следует отметить, что добровольный стандарт существует в индустрии коммерческого переноса эмбрионов, что предимплантационной эмбрионов для криоконсервации DT должны быть заморожены в желтый цвет соломки и хранится в желтый цвет кубки в жидкий азот дьюара. Коммерческой промышленности также имеет специфические требования к маркировке для всех криоконсервированных эмбрионов, которые должны быть соблюдены.

Один из вариантов этого метода является стеклования ^21, неравновесные методом криоконсервации, где более высокая концентрация (6-8 М) CPA раствор охлаждают ультра-быстро вызывает решение CPA изменить из жидкого состояния в "стеклянный" государство без льда образование кристаллов. Витрификация, вероятно, лучше подходит для криоконсервации эмбрионов, которые являются менее умственно развитыми, чем компактные морулы из-за их повышенной температурной чувствительности.

Этот метод имеет применение для сохранения уникальных ресурсов зародышевой плазмы ^22, а также для международных коммерческих промышленности переноса эмбрионов, где более 55% приблизительно 500.000 бычьего эмбрионов предимплантационной переданы в календарном 2008 году были криоконсервированных ^23.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
BioLife заморозить среда	Agtech, Inc	C18, C18A	1,5 М этиленгликоль
Emcare этиленгликоля заморозить решение	ICPBio репродукции	IC8, IC10	1,5 М этиленгликоль
ViGro этилен гликоля плюс заморозить	Bioniche здоровья животных	EVM835	1,5 М этиленгликоль
Emcare 10% раствор глицерина заморозить	ICPBio репродукции	IC12	1,34 М глицерина
Emcare 1 М сахарозы оттепель	ICPBio репродукции	IC16	1,0 М сахарозы
ViGro один шаг оттепель	Bioniche здоровья животных	EVM247, EVM847	1,0 М сахарозы
ViGro оттепели 1-2-3 плюс	Bioniche здоровья животных	EVM248, EVM848	5%, 2,5%, 0% глицерина с 0,5, 0,5, 0,6% сахарозы
Emcare ХСС оттаивания комплект	ICPBio репродукции	IC20	6%, 3%, 0% глицерина с 10,3% сахарозы
BioLife холдинга и теплоносителя	Agtech, Inc	C15, C15A	изменение PBS с 0,4% BSA (бычий сывороточный альбумин)
Emcare холдинг решение	ICPBio репродукции	IC2, IC4, IC6	0,4% BSA (бычий сывороточный альбумин), MOPS буфера (инертные zwitterions)
ViGro проведение плюс	Bioniche здоровья животных	EVM024, EVM824
SYNGRO Холдинг среда	Bioniche здоровья животных	ESM024, ESM224, ESM828	содержит гиалуронана, нет продуктов животного происхождения
BioLife изменение D-PBS	Agtech, Inc	C06	фосфат изменение Дульбеко солевой буфер
BioLife БСА доля V	Agtech, Inc	B09	лиофилизированный бычий сывороточный альбумин, фракция V
BioLife противогрибковым антибиотикам	Agtech, Inc	B01	амфотерицин-В, пенициллин G, стрептомицина сульфат
BioLife трипсина комплект	Agtech, Inc	C22A	25 г лиофилизированной трипсина, стерильная вода, стерильная D-PBS

Наименование оборудования	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Biol-Cool контролируемой скоростью морозильнике	ФСТ системы	До н.э.-IV -40	Морозильник Метанол ванны
Замораживание управления контролируемой скоростью морозильнике	Cryologic	CL2200	Жидкий азот морозильнике