Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen

Zusammenfassung

Präimplantationsdiagnostik Embryonen können nach der Platzierung in eine hypertonische Lösung kryoprotektive kryokonserviert werden, um zelluläre Dehydratation führen. Nach Äquilibrierung, ist die Bildung von Eiskristallen in der Lösung um den Embryo induziert. Die weitere Entwässerung erfolgt wie der Embryo wird langsam auf Temperaturen unter Null vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff für die Lagerung gekühlt.

Zusammenfassung

Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen können kurz-oder langfristige Lagerung kryokonserviert werden. Präimplantationsembryonen bestehen überwiegend aus Wasser, und die Vermeidung von intrazellulären Bildung von Eiskristallen während der Kryokonservierung Prozess ist von entscheidender Bedeutung, um Embryo Lebensfähigkeit zu erhalten. Eines kryoprotektive Agent (CPA), wie Ethylenglykol (EG) oder Glycerin (Glycerin) zu einem osmotischen Gradienten, dass zelluläre Dehydratation erleichtert erstellen - Embryonen werden in einer hypertonischen Lösung (1,5 M 1,4) platziert. Nach Embryonen osmotische Gleichgewicht erreicht in der CPA-Lösung, werden sie einzeln in der hypertonischen CPA-Lösung in 0,25 ml Kunststoff-Strohhalme zum Einfrieren eingelegt. Die Embryonen werden in einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank bei einer Temperatur von -6 ° C platziert Bildung von Eiskristallen in der CPA-Lösung rund um den Embryo induziert, und die Kristallisation bewirkt eine Erhöhung der Konzentration von CPA außerhalb des Embryos, was zu weiteren zellulären Dehydrierung. Die Embryonen werden mit einer Rate von 0,5 ° C / min abgekühlt, so dass weitere Austrocknung, auf eine Temperatur von -34 ° C, bevor sie in flüssigem Stickstoff (-196 ° C) getaucht. Kryokonservierten Embryonen müssen vor aufgetaut werden, um an einen Empfänger (Surrogat-) Frau zu übertragen. Straws mit den Embryonen aus dem flüssigen Stickstoff-Dewar, in Raumtemperatur Luft für 3 bis 5 sec gehalten wird, entnommen und in einem 37 ° C Wasserbad für 25 bis 30 sec. Embryonen kryokonserviert in Glycerin werden in eine 1 M Lösung von Saccharose für 10 min zur Entfernung der CPA vor der Übertragung an einen Empfänger (Surrogat-) Frauen gelegt. Embryonen kryokonserviert in EG, jedoch auch direkt in die Gebärmutter eines Empfängers übertragen werden.

Protokoll

1. Auswertung Eignung von Embryos für die Kryokonservierung ¹

1. Proben aus der Fortpflanzungsorgane der einzelnen weiblichen Spendertieren geerntet sollte in einer isotonischen Embryo hält Medium für 10 Minuten vor der Auswertung mit einem Stereomikroskop gelegt werden. Seien Sie sicher, Embryonen aus jedem Spender weiblich getrennt voneinander, um die Identifizierung der Herkunft von Embryotransfer Nachkommen ermöglichen zu halten.
2. Mit geringer Vergrößerung (≤ 10-fach), Proben von einem einzelnen Spender Weibchen in getrennten Gruppen, bestehend aus unbefruchteten Eizellen sollten getrennt werden, degenerieren Embryonen oder übertragbar Qualität Embryonen. Nur Güteklasse 1 oder 2 Embryonen im kompakten Morula durch erweiterte Blastozyste Stadien der Entwicklung sind für die Kryokonservierung geeignet, und alle anderen zu verwerfen (es sei denn, Synchron-Empfänger Weibchen für die Güteklasse 3 Embryonen und eine Post-Transfer-Schwangerschaftsrate von ca. 25 stehen zur Verfügung -30% ist zulässig).
3. Überprüfen Sie Qualitätsstufe 1 und 2 kompakten Morula durch erweiterte Blastozystenstadium Embryonen bei einer Vergrößerung ≥ 50X, um sicherzustellen, dass die Zona pellucida des Embryos intakt ist und dass es kein Material (z. B. Zellen, Schleim) die Einhaltung der Zona pellucida. Jeder Embryo mit einem gerissenen oder fehlenden zona pellucida oder mit einer Glashaut mit Anhänger Material sollte von anderen Embryonen zu trennen und entweder verworfen oder verarbeitet werden getrennt.

2. Washing Embryonen Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Krankheit Getriebe ²

1. Bewegen zona pellucida-intakten Embryonen in einem minimalen Volumen von isotonischen Embryo hält Medium in der ersten Vertiefung Embryo Waschen Medium (zB Phosphat-gepufferte Salzlösung ergänzt mit Antibiotika und Rinderserumalbumin, Neugeborenen Kälberserum, oder Polyvinylalkohol). Keep Embryonen aus jedem Spender weiblich getrennt, und versuchen Sie nicht mehr als 10 Embryonen auf einmal zu waschen. Bewegen Embryonen in einem minimalen Volumen von Medium in jeder nachfolgenden waschen, um eine serielle Verdünnung ≥ 1:100 zu erreichen, und sicher sein, sterile Embryo Handling Tipps, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden waschen geändert verwenden.
2. Bewegen Embryonen durch 4 weitere Wäschen wie in 2.1 beschrieben.
3. Falls die Übertragung von Viruserkrankungen von Belang ist, waschen Embryonen zweimal in einer 0,25% Trypsin-Lösung, für einen gesamten kombinierten Belichtungszeit von nicht mehr als 90 Sekunden Trypsin.
4. Nach den beiden Trypsin wäscht, waschen Embryonen 5-mal mehr in Embryo Waschmedium wie in 2.1 beschrieben.
5. Nach dem letzten Embryo zu waschen, statt Embryonen in isotonische Embryo hält Medium.

3. Dehydratisierende Embryonen vor der Kryokonservierung ³

1. Embryonen in einem minimalen Volumen von isotonischen Embryo hält mittelfristig in eine hypertone Lösung (1,4 bis 1,5 Molare Konzentration) eines kryoprotektive Agent (CPA), wie Ethylenglykol oder Glycerin übertragen werden.
2. Lassen Embryonen in Einfriermedium (hypertone CPA-Lösung) zu sitzen, bis sie osmotische Gleichgewicht erreicht ist. Da Ethylenglykol durchdringt embryonale Zellen schneller als im Glycerin, sind Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung in der Regel weniger für Embryonen in Ethylenglykol (5 min) als in Glycerin (10 min). Ein Teil dieses Gleichgewichts Zeit kann während und nach erreicht werden Embryonen in Strohhalmen (beschrieben in nächster Schritt) geladen werden.

4. Loading Embryonen in einer 0,25 ml Kunststoff-Strohhalm für Kryokonservierung

1. Befestigen Sie den Wattebausch Ende einer 0,25 ml Kunststoff-Strohhalm (11,5 cm Arbeitslänge) zu einem Embryo Ladevorrichtung, und saugen Sie ca. 1,3 cm von hypertoner CPA-Lösung in einen korrekt etikettierten Stroh. Eine Vielzahl von Verfahren zur Kennzeichnung vorhanden ist, einschließlich der Verwendung von Etiketten angebracht, um entweder einen Strohhalm Verschlussstopfen oder zu einem anderen Stroh mit Stroh-Adapter angeschlossen.
2. Entfernen Sie das Stroh aus der CPA-Lösung, und saugen ca. 0,15 cm Luft zu einem winzigen Luftblase im Stroh zu schaffen.
3. Absaugen eines einzigen Embryos in ca. 0,8 cm von hypertoner CPA-Lösung in das Stroh.
4. Entfernen Sie das Stroh aus der CPA-Lösung und saugen ca. 0,15 cm der Luft auf eine zweite kleine Luftblase im Stroh (Luftblasen dienen physisch zu isolieren des Embryos im Stroh) zu schaffen.
5. Saugen Sie ca. 9,1 cm von CPA-Lösung vollständig zu füllen das Stroh, dass bestimmte, in einem ausreichenden Volumen von CPA-Lösung zu ziehen, die aus Polyvinylchlorid (PVC)-Pulver, die innerhalb der Wattestopfen Ende des Stroh existiert befeuchten. Die CPA-Lösung bewirkt, dass die PVC-Pulver zu Gel und Siegel, das Ende des Strohs.
6. Seal das andere Ende des Strohs mit PVC-Pulver-, Kunststoff-Stroh Verschlussstopfen oder ein Folienschweißgerät.

5. Platzieren Embryonen in einer kontrollierten Geschwindigkeit Embryo Freezing-Maschine

1. Entweder Methanol-Bad oder in flüssigem Stickstoff Dampf Einfrieren Maschinen können für die Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen programmiert werden.
2. Legen Sie die Halme mit der Embry os zu einem Einfrieren Maschine, deren Temperatur von Raumtemperatur bis -6 ° C abgekühlt worden Legen Strohhalme Wattestopfen landen (es sei denn, Kunststoff-Strohhalm Verschlussstopfen oder Stroh Adapter verwendet wird, in welchem ​​Fall Wattestopfen Ende nach unten platziert ist).
3. Lassen Embryonen bei dieser Temperatur für mindestens 2 Minuten, bevor Sie fortfahren sitzen.

6. Seeding

1. Einmal Embryonen bis -6 ° C abgekühlt, verwenden Sie eine Zange in flüssigem Stickstoff (oder ein Wattestäbchen-Stick in flüssigen Stickstoff getaucht) unterkühlt, um die Bildung von Eiskristallen in der CPA-Lösung in das Stroh zu induzieren, indem Sie die Zange (oder Baumwolle Trinkgeld-Stick) auf die Säule der Lösung entweder oberhalb oder unterhalb des Embryos.
2. Das Wasser in der CPA-Lösung wird in der Region ausgesetzt flüssigem Stickstoff zu kristallisieren, und Eiskristalle werden, um die Spalte der CPA-Lösung in unmittelbarer Umgebung des Embryos zu verbreiten.
3. Halten Embryonen Impftemperatur für 10 Minuten, bevor eine weitere Abkühlung.

7. Continuing Dehydratisierung von Embryonen

1. Coole Embryonen mit einer Rate von 0,5 ° C / min bis zu einer Temperatur von -34 ° C. Diese Abkühlgeschwindigkeit ist wichtig, weiterhin Austrocknung des Embryos zu gewährleisten.
2. Halten Embryonen bei -34 ° C für 10 Minuten vor dem Eintauchen Embryonen in flüssigem Stickstoff (-196 ° C).
3. Legen Sie kryokonservierten Embryonen in einen entsprechend gekennzeichneten Becher (gefüllt mit flüssigem Stickstoff), die an einem entsprechend gekennzeichnet Zuckerrohr, und setzen Sie den Stock in einen Kanister von einem Flüssig-Stickstoff-Dewar für kurz-oder langfristige Lagerung.

8. Auftauen kryokonservierten Embryonen

1. Ziehen Sie den Kanister in den Hals des flüssigen Stickstoffs Dewar, sicherzustellen, dass die Kanister unten bleibt der Frostgrenze in den Dewar.
2. Suchen Sie das Rohr mit dem Embryo aufgetaut werden, und zwar schnell und vorsichtig das Stroh aus dem Kelch, dass bestimmte nicht auf andere Strohhalme in den Becher warm.
3. Halten Sie das Stroh in der Luft für 3-5 Sekunden (die Häufigkeit eines gerissenen zona pellucida ^{4 zu} reduzieren), und dann tauchen in eine 37 ° C Wasserbad für weitere 25-30 Sekunden.
4. Entfernen Sie das Stroh aus dem Wasserbad, wischen Sie das Stroh (darauf achten, daß der Embryo Identifikation auf dem Stroh wisch), verwenden Sie einen Strohhalm Schneideinrichtung zu snip off der Nicht-Wattestopfen Ende des Strohs (wenn versiegelt mit Wärme-oder PVC-Pulver ), oder entfernen Sie vorsichtig die Kunststoff-Verschlussstopfen, und entweder:
   1. Last das Stroh in einen Embryo-Transfer-Gerät und den Transfer so schnell wie möglich, um eine synchrone Embryo Empfänger (aber nur, wenn der Embryo wurde kryokonserviert mit Ethylenglykol als CPA), oder
   2. Halten Sie das offene Ende des Strohs über eine Schale mit einer 1,0 molaren Konzentration von Saccharose (ein nicht-durchdringenden Verbindung), und verwenden Sie eine Schere abzuschneiden Wattestopfen Ende des Strohs. Inhalt des Strohs sollte frei in die Saccharose-Lösung fließen, aber schiebt einen kleinen Luftsäule durch das Stroh kann es notwendig sein, wenn alle Reste des Mediums besteht in dem Stroh. Lassen Embryonen in Saccharose-Lösung 10 Minuten lang, und dann-Embryonen in isotonische Embryo hält Medium für 10 Minuten. Bewerten Embryonen nach dem Auftauen, laden Sie in ein neues Stroh, und in einem geeigneten Empfänger Weibchen.

9. Repräsentative Ergebnisse:

Eine Vielzahl von Faktoren beeinflussen die Schwangerschaft und Lebendgeburt Preise, die sich aus der Übertragung der aufgetauten Präimplantationsembryonen um synchrone Empfänger Weibchen ^5. Embryonen im Entwicklungsstadium weniger weit fortgeschritten als kompakte Morula oder weiter fortgeschritten als erweiterte Blastozyste oft nicht überleben die Kryokonservierung Prozess sowie Embryonen im kompakten Morula, Blastozyste früh, Blastozyste und erweiterte Blastozyste Stadien der embryonalen Entwicklung. Embryonen der Güteklasse 1 und 2 höheren Ausbeute nach dem Auftauen Schwangerschaftsraten als sie Güteklasse 3 Embryonen (die typischerweise nicht wegen der geringen nach dem Auftauen Schwangerschaftsraten kryokonserviert). Embryonen misshandelt während der Embryo Einfrieren oder Auftauen Embryo Verfahren sind wahrscheinlich reduziert Schwangerschaftsraten aufweisen. Transferierten Embryonen bis zum Empfänger Weibchen, deren Ovarialzyklen sind nicht mit der des Spenders weiblichen synchronisiert erzeugen typischerweise niedrigeren Schwangerschaftsraten. In vitro produzierten Embryonen oder manipuliert in irgendeiner Weise (zB Biopsie oder halbiert) liefern in der Regel niedrigere Schwangerschaftsraten. Unter optimalen Bedingungen Schwangerschaftsraten nach Transfer von aufgetauten in vivo gewonnene Embryonen ist in der Regel 60-70% bei Rindern ^6,7, 65-75% bei Schafen ^8,9,10,11, und 60-70% bei Ziegen gewonnen ^12,13,14,15. Ebenso Schwangerschaftsraten nach der Übertragung der gewonnenen aufgetauten in vitro erzeugten Embryonen ist in der Regel 40-50% bei Rindern ^6,16, 25-35% bei Schafen ^17, und 30-40% bei Ziegen ^18.

belle 1 "/>

Tabelle 1. Erwartete Schwangerschaftsraten nach Transfer von aufgetauten Embryonen aus heimischen Wiederkäuern Tierarten, um synchrone Empfänger Weibchen.

Diskussion

Da Embryonen überwiegend aus Wasser bestehen, ist es entscheidend, dass Präimplantationsembryonen ausreichend entwässert und langsam in Übereinstimmung mit dem Protokoll gekühlt werden hier beschrieben, um die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen zu vermeiden. Nach der Kühlung begonnen hat, ist es wichtig, unidirektionale Temperaturänderung aufrecht zu erhalten und Temperaturschwankungen zu vermeiden. Initiation der Bildung von Eiskristallen ("Seeding") bei einer geeigneten Temperatur für die spezifischen CPA-Lösung ist von entscheidender Bedeutung.

Änderungen an diesem langsamen Abkühlen / Auftauen schnelle Methode zur Präimplantationsdiagnostik Kryokonservierung von Embryonen sind die Ein-Schritt-Methode (wobei die letzte Spalte des Mediums in das Stroh beladenen Saccharose anstelle von CPA-Lösung) ¹⁹ und den direkten Transfer-Methode (in dem die Embryonen in Ethylenglykol eingefroren aufgetaut und direkt in die Gebärmutter eines Empfängers Weibchen übertragen, ohne zuerst die Ethylenglykol aus dem Embryo) ^20. Zur Reduzierung des Volumens von Ethylenglykol hinterlegt in die Gebärmutter der einen direkten Transfer (DT) Empfänger weiblich, ist es ratsam, die 0,25 ml Stroh mit 6 cm Medium für die Aufbewahrung, bevor Sie fortfahren wie zuvor beschrieben zu füllen. Anzumerken ist, dass ein freiwilliger Standard in der kommerziellen Embryotransfer Industrie, Präimplantationsembryonen für DT kryokonserviert in gelb-bunten Strohhalmen eingefroren werden sollen und in gelben Bechern in den flüssigen Stickstoff-Dewar besteht. Die gewerbliche Wirtschaft hat auch spezifische Kennzeichnungsvorschriften für alle kryokonservierten Embryonen, die befolgt werden sollten.

Eine Alternative zu dieser Methode ist, Verglasung ^21, ein Nicht-Gleichgewichts-Methode der Kryokonservierung, wo eine höher konzentrierte (6-8 M) CPA Lösung abgekühlt ultra-schnell wodurch die CPA-Lösung von Flüssigkeit zu einem "gläsernen" Staates ohne Eis zu ändern ist Kristallbildung. Vitrification ist wahrscheinlich besser geeignet für die Kryokonservierung von Embryonen, die weniger fortgeschritten als entwicklungspolitisch kompakten Morula aufgrund ihrer erhöhten Temperaturempfindlichkeit sind.

Diese Technik hat sich die Anwendung für die Erhaltung der einzigartigen Keimplasma Ressourcen ^22, sowie auf die internationalen Handels-Embryo-Transfer-Industrie, wo mehr als 55% der rund 500.000 Rinder Präimplantationsembryonen im Kalenderjahr 2008 übertragen wurden kryokonserviert. ²³

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BioLife einfrieren Medium	Agtech, Inc.	C18, C18A	1,5 M Ethylenglykol
Emcare Ethylenglykol freeze-Lösung	ICPBio Reproduction	IC8, IC10	1,5 M Ethylenglykol
Vigro Ethylenglykol freeze plus	Bioniche Tiergesundheit	EVM835	1,5 M Ethylenglykol
Emcare 10% Glycerin-Lösung einfrieren	ICPBio Reproduction	IC12	1,34 m Glycerin
Emcare 1 M Saccharose Tauwetter	ICPBio Reproduction	IC16	1,0 M Saccharose
Vigro Ein-Schritt-Tau-	Bioniche Tiergesundheit	EVM247, EVM847	1,0 M Saccharose
Vigro Tauwetter 123 plus	Bioniche Tiergesundheit	EVM248, EVM848	5%, 2,5%, 0% Glycerin mit 0,5, 0,5, 0,6% Saccharose
Emcare CSU Auftauset	ICPBio Reproduction	IC20	6%, 3%, 0% Glycerin mit 10,3% Saccharose
BioLife Halten und Übertragungsmedium	Agtech, Inc.	C15, C15A	modifizierten PBS mit 0,4% BSA (Rinderserumalbumin)
Emcare Holding-Lösung	ICPBio Reproduction	IC2, IC4, IC6	0,4% BSA (Rinderserumalbumin), MOPS-Puffer (inert Zwitterionen)
Vigro Holding sowie	Bioniche Tiergesundheit	EVM024, EVM824
SYNGRO Halten Medium	Bioniche Tiergesundheit	ESM024, ESM224, ESM828	enthält Hyaluronsäure, keine Erzeugnisse tierischen Ursprungs
BioLife modifizierten D-PBS	Agtech, Inc.	C06	modifizierten Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
BioLife BSA Fraktion V	Agtech, Inc.	B09	lyophilisiert Rinderserumalbumin Fraktion V
BioLife Antibiotika-Antimykotikum	Agtech, Inc.	B01	Amphotericin-B, Penicillin G, Streptomycin-Sulfat
BioLife Trypsin-Kit	Agtech, Inc.	C22A	25 g lyophilisierte Trypsin, steriles Wasser, sterile D-PBS

Bezeichnung des Geräts	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Biol-Cool kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank	FTS-Systeme	BC-IV -40	Methanol Bad Gefrierfach
Freeze-Control gesteuert Rate Gefrierschrank	Cryologic	CL2200	Flüssiger Stickstoff Gefrierschrank