אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Summary

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של התא ואת השינויים המולקולריים הקשורים התחדשות אפיתל ב נפרון את הכליה.

Abstract

נזק כלייתי אקוטי (AKI) מאופיין בשיעורי התמותה גבוהים בתפקוד הכלייתי על פני תקופה של שעות או ימים, כי מגיע לשיאו אי ספיקת כליות ^1. AKI יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים ביניהם רעילות, תרופה המבוססת על איסכמיה, או פגיעה חסימתית ^1. התוצאה היא חוסר יכולת לשמור על איזון נוזלים ואלקטרוליטים. בעוד AKI נצפתה במשך עשרות שנים, טיפולים קליניים יעילים טרם פיתחה. מסקרן, כמה חולים עם AKI להתאושש פונקציות כליות לאורך זמן, תופעה מסתורית התאפיינה רק rudimentally ^1,2. מחקרים באמצעות מודלים של יונקים AKI הראו כי הכליות איסכמי או nephrotoxin-פצועים לחוות מוות של תאים אפיתל ב נפרון tubules ^1,2, יחידות תפקודית של הכליה אשר מורכב מסדרה של אזורים מיוחדים (קטעים) של סוגי תאים אפיתל ³ . בתוך nephrons, מוות של תאים אפיתל היא הגבוהה ביותר בתאי אבובית הפרוקסימלי. יש ראיות לכך מציע הרס התא ואחריו dedifferentiation, התפשטות, הגירה של הסובבים לתאי האפיתל, אשר יכול לחדש את נפרון לחלוטין ^1,2. עם זאת, ישנן שאלות רבות ללא מענה על מנגנוני התחדשות של האפיתל כליות, החל את האותות לווסת את האירועים הללו כדי סיבות וריאציה רחב של יכולות בקרב בני אדם להתחדש הכליות נפגע.

דג הזברה הזחל מהווה מודל מצוין ללמוד התחדשות כליה אפיתל כמו כליות pronephric שלה מורכבת nephrons כי הם שמורים עם חוליות גבוהה כולל יונקים ^4,5. Nephrons זחלים של דג הזברה ניתן דמיינו עם טכניקות הקרינה בגלל השקיפות היחסית של דג הזברה צעיר ^6. זה מספק הזדמנות ייחודית לתא התמונה השינויים המולקולריים בזמן אמת, בניגוד מודלים יונקים שבו nephrons אינם נגישים בגלל הכליות הן מערכות מורכבות מבנית הפנימו בתוך החיה. מחקרים שנעשו לאחרונה המועסקים גנטמיצין aminoglycoside כסוכן סיבתי רעילים למחקר של AKI ואי ספיקת כליות הבאים: גנטמיצין ואנטיביוטיקה אחרים הוכחו לגרום AKI בבני אדם, החוקרים גיבשו שיטות להשתמש הסוכן לעורר נזק לכליות על דג הזברה ^{7 , 8.} עם זאת, ההשפעות הרעילות aminoglycoside ב הזחלים דג הזברה הם קטסטרופלי וקטלני, אשר מציג קושי כאשר לומדים התחדשות אפיתל לתפקד לאורך זמן. השיטה שלנו מציג את השימוש אבלציה תא ממוקדים ככלי הרומן לחקר פציעה אפיתל של דג הזברה. אבלציה לייזר מעניקה לחוקרים את היכולת לגרום מוות של תאים באוכלוסייה מוגבלת של תאים. באזורים שונים של תאים יכולים להיות ממוקדים המבוססים על מיקום פונקציה מורפולוגיים, או אפילו הביטוי של פנוטיפ סלולרית בפרט. לפיכך, אבלציה לייזר יגדיל את הספציפיות של מה שהחוקרים יכולים ללמוד, והוא יכול להיות גישה חדשה חזק כדי לשפוך אור על מנגנוני התחדשות אפיתל הכליה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב למקד אוכלוסיות תאים באיברים אחרים בעובר דג הזברה ללמוד פציעה והתחדשות בכל מספר בהקשרים של עניין.

Protocol

1. הליך Microinjection לתווית דג הזברה כלית ראשית אפיתל אבובית הפרוקסימלי

עבור הליך זה, אנו משתמשים במערכת microinjection (Appartus הרווארד, PLI90), עם אוויר דחוס המסופק על ידי מדחס אוויר (יוני-Air, דגם 6-4), וכן מנגנון micromanipulator (Narishege חלקים MN151, IP3 ו GJI) כי הם התאספו בתחנת stereomicroscope (ניקון, SMZ-Zoom 645), כמו לכל הוראות היצרן. Conjugates dextran הם endocytosed בקלות על ידי נפרון אבובית הפרוקסימלי, המאפשר תיוג מועדף של אוכלוסייה זו תא אפיתל ^9.

1. חשיפה כחול מתילן יכול להדגיש את autofluorescence של שק החלמון ואת עושה ויזואליזציה של נפרון tubules קשה יותר.
2. הרם את העוברים מופרית על 28.5 ° C עד timepoint התפתחותי הפריה בין 48-55 שעות שלאחר (hpf). זהו השלב האידיאלי לבצע microinjections הזחלים בגלל הקלות שבה microinjection לשריר יכול להתבצע, ובגלל תפקוד כלייתי מתחילה בשלב זה.
3. הסר את כל סיסית של דג הזברה שלא נתבקעה בעזרת זוג מלקחיים בסדר. יש לשטוף את הלכלוך סיסית מצלחת פטרי ולמלא את המנה עם 30 MLS של פתרון שונה E3.
4. הכנת מגש זריקה כלפי העובר. עובש הזרקת המועדפת שלנו מורכב של 1.5% agarose/E3, שבו נוצרות שקעים משולש כזה העובר יכול להיות ממוקם בתוך להזרקה. כדי להפוך את התבנית זריקה, אנו לצוף תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז (מתואר בפירוט בעבר ¹¹⁾ בצלחת פטרי מלאות בסיס agarose של 1.5%.
5. הכן microinjection מחטים על ידי משיכת צינורות זכוכית נימי עם חולץ מחט, כפי שמתואר בספר דג הזברה ^10. בקיצור, למשוך את צינורות זכוכית נימי ואז להשתמש במלקחיים מתכת דק לחתוך את קצה המחט microinjection לעשות עם נקודת קצה חד בעת הצגת קצה מחט תחת stereomicroscope. חנות מחטים לחתוך מכוסה בצלחת פטרי ואת מיקומו על פלסטלינה כדי להגן על קצה לחתוך למנוע הצטברות אבק.
6. הכן את פתרון הזרקת לתווית אבובית הפרוקסימלי. ממיסים 40 KD-dextran והעמסת המצומד (Invitrogen, D1845) בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​במים מזוקקים.
7. כדי להרדים את הדג, מוסיפים 5 MLS של 0.2% Tricaine pH 7.0 כדי בצלחת פטרי שמכילה את הזחלים דג הזברה ב 30 MLS של E3. הדגים מורדמים כאשר הם כבר לא מציגים את התגובה למגע. זה חיוני כי הדגים מורדמים לגמרי או שהם יהיו עווית על ניסיון להזריק אותם.
8. מעבירים את הדג על מגש הרדים זריקה עובש באמצעות pipet העברת פלסטיק. מקם את חיה עם ראשו בחלק העמוק ביותר של דיכאון המשולש היטב, ובצד כזה גזע נח בצד זווית הבאר שלו.
9. בצע microinjection תוך שרירית. טען מחט לחתוך עם μL 2-3 של dextran והעמסת, ולהזריק את החיה somite גזע עם כ 1 NL של פתרון. כוון החלק העליון של somite, ולהימנע הרחבה שק החלמון. הדבר מבטיח כי tubules נפרון לא שיבשו באופן מכני על ידי תהליך microinjection.
10. העברת דג הזברה מוזרק כדי בצלחת פטרי נקי, ולהוסיף פתרון E3 שונה. יש לשטוף את החיות 3 פעמים עם E3 טרי כדי להסיר את כל עקבות של Tricaine. מכסים את מכסה צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום על מנת לספק אור הגנה על dextran, ולהחזיר את החיות של 28 ° C חממה לילה.

2. אבלציה לייזר ממוקד של תאים אבובית הפרוקסימלי

עבור הליך זה, אנו משתמשים stereomicroscope עם epifluorescence להבקיע חיות עם dextran והעמסת tubules הפרוקסימלי במאור שכותרתו ובחר אלה עבור אבלציה לייזר. לאחר מכן, אנו משתמשים micropoint פעמו לייזר המערכת (מכשירים פוטוניים, Inc), כי כבר מחוברת למיקרוסקופ מתחם (ניקון Eclipse 80i עם קובץ מצורף epifluorescent), ו מכויל לשימוש הוראות היצרן לכל, לבצע אבלציה נפרון התא. היו לנו את ההצלחה הרבה ביותר ב אבלציה התא באמצעות מסנן FITC המאפשר חוקר כדי לראות את האזורים אבובית ניאון תחת brightfield תאורה.

לקראת הליך זה, להכין התקשורת immobilization עבור אבלציה ידי המסת methylcellulose 1.5% ב 0.02% tricaine/E3. Aliquots חנות של methylcellulose לשימוש מיידי בטמפרטורת החדר, או 4 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

1. להרדים דג הזברה 72 hpf ידי הוספת 5 MLS של 7.0 Tricaine 0.2% pH כדי בצלחת פטרי שמכילה את הזחלים דג הזברה ב 30 MLS של E3. הדגים מורדמים כאשר הם כבר לא מציגים את התגובה למגע. זה חיוני כי הדגים מורדמים לגמרי או שהם יהיו עווית על ניסיון לבצע אבלציה לייזר.
2. בדוק את החיות מוזרק תחת ההגדרה פלורסנט המתאים ובחרו חיות שבו אתה יכול בקלות לדמיין את tubules הפרוקסימלי.
3. העברת עוברים שנבחרו צלחת נפרדת המכילה tricaine. בעלי חיים יכול להיות מורדם למשך עד 30 דקות לפני ביצוע אבלציה התא. אם הציון> 15 החיות, להחזיר את צלחת נפרדת המכילה E3 שונה טריים בעודם ממתינים אבלציה כמו אבלציה כל תא לוקח כמה דקות.
4. כדי לבצע את אבלציה, העברה חד דג הזברה בהרדמה כדי בצלחת פטרי קטן המכיל 1.5% tricaine methylcellulose/0.02% למשך 2 דקות כדי לשטוף את העובר בתקשורת immobilization.
5. לאחר מכן, להעביר את העובר לשקופית זכוכית דיכאון המכיל ירידה של 1.5% methylcellulose/0.02% tricaine. בעדינות עמדת חיה עם בדיקה קנס כזה בצד הגחון שלה פונה שקופיות בצד הגבי הוא פונה כלפי מעלה.
6. הנח את השקף על הבמה מיקרוסקופ compund, ולהתמקד בצד הגבי של החיה. ביצוע אבלציה של תאים נפרון תחת להתמקד מדכא את דוושת רגל. אתה תראה פיזור הקרינה כמו בתאי אפיתל הכליה הם ablated (איור 1A).
7. בעדינות להעביר את החיה ablated אל באר צלחת גם 12 עבור culturing הבאים. שוטפים את E3 2-3 פעמים כדי לשטוף את methylcellulose.
8. לאחר הזריקה, להעלות את החיה timepoint הרצוי ולבצע ניתוח הרצוי לפי טכניקות היסטולוגית מולקולרית הוקמה עבור עוברי דג הזברה הצעירה (איור 2).

3. נציג התוצאות:

הנתונים מוצגים באיור 1 מצביעים על timecourse אבלציה. לאחר זריקה תוך שרירית עם dextran-conjugates, אבובית הפרוקסימלית מתויג מועדף. הזרקת dextran-FITC שימש התווית כליה עבור אבלציה לייזר, וחיות ablated היו reinjected עם dextran-rhodamine ב אבלציה one timepoint נוספים הבאים Reimage האוכלוסייה אבובית הפרוקסימלי. ניתוח טכניקות ביטוי כמו הכלאה באתרו ניתן להשתמש כדי לנתח את השינויים דגימות קבוע timepoints יחיד הבאים אבלציה התא, כפי שמוצג באיור 2.

איור 1: אבלציה הליך לייזר מלווה התחדשות מהירה של האפיתל אבובית (AC) Timecourse שינויים הסלולר במהלך ואחרי אבלציה לייזר של tubules הזחל דג הזברה הפרוקסימלית בזמן של אבלציה (יום 3, לוח א '), או אחד או שלושה. בימים שלאחר אבלציה (יום 4, פאנל B; יום 7, פנל C). (למעלה) שרטוטים להראות המיקום של נפרון, עם dextran-FITC (ירוק) ו-dextran rhodamine (אדום), ו (התחתון) תמונות חיות של שליטה לייזר ablated (לוס אנג'לס) nephrons.

איור 2:. ניתוח של ביטוי גנים לאחר אבלציה לייזר בעקבות אבלציה לייזר יום 3, עוברים נקבעו ועובדו על הר שלם הכלאה באתרו לזהות תעתיקי עבור slc20a1a, אשר סימן את הקטע הפרוקסימלי אבובית מפותלת של נפרון. (א) העובר לשלוט זה לא היה נתון אבלציה לייזר, (ב) העובר בו קטע גדול של האפיתל אבובית היה ablated, ו (ג) העובר בו הפסקה קצרה של האפיתל אבובית היה ablated. הקו השחור מציין את מידת אבובית הפרוקסימלית ב לספק התייחסות, קווים כחולים מציינים את מידת אבלציה לייזר לוחות לפני הספירה, * מציין את הביקורת (הלא ablated) נפרון הנגדי בפאנלים לפנה"ס.

Discussion

דג הזברה הוא אורגניזם מודל נפוץ ברחבי היבטים רבים של המדע, של יישומים אשר צומחות ^6. התעסוקה של מערכת מודל דג הזברה במחקר של מחלות כליה כמו AKI הוביל תצפיות חשוב תמשיך להיות מודל טוב ללמוד פגיעה בכליות ^7,8. עם הגנום כי כבר רצף ופרוטוקולים מולקולריים רבים במקום, זה הפך להיות קל יותר ויותר לבצע מחקר דג הזברה מתוחכם אשר מנצל מודלים מהונדס, מציאה גן ומחקרים misexpression. דג הזברה יש מחזור חיים קצר עם גדלים דור גדול מוגדרים היטב שלבי ההתפתחות. יתר על כן, דג הזברה בשלבים עובריים הזחל הם שקופים במידה רבה, מה שהופך בדיקות הדמיה אפשרי בלי דיסקציה של האורגניזם. לאורך שלבים עובריים הזחל, דג הזברה יש כליה pronephric מורכבת משני nephrons, אשר נשארים גלויים במהלך אלה timepoints התפתחותית. דג הזברה nephrons pronephric הם מקביל במבנה ותפקוד עמיתיהם יונקים שלהם, מה שהופך אותו מודל טוב אי ספיקת כליות חריפה מחקרים ^4,5.

כליות הוא קריטי להישרדות של בני אדם ובעלי חוליות אחרים, משמש איבר זה מנקה את הגוף של פסולת מטבולית נוזלי. פונקציה זו טיהור נשענת על היכולת של הכליות nephrons לסנן את הדם, ולאחר מכן לשנות את תסנין לאסוף פסולת חנקני להפרשת נוזל ובד בבד לשמור על איזון אלקטרוליטי. Nephrons מורכב מסנן דם, אבובית אפיתל, ומסננים לתוך צינור. שלמות מבניים ותפקודיים של כל שלושת החלקים הוא חלק בלתי נפרד פונקציה נפרון. עלבונות שונים לכליה, כולל חשיפה nephrotoxins, איסכמיה, או חסימה של דרכי השתן יצוא יכול לגרום AKI ^1. פתולוגיה של AKI קשורה לעיתים קרובות עם ^1,2 חריפה נמק צינורי. מחקרים קליניים הראו כי שהתפתח אי ספיקת כליות יש שיעור תמותה זה יכול לנוע בכל מקום בין 70-80% בהתאם לגורם והקשר של כישלון כליות. עם זאת, אבחנה היפוך מהיר של הגורם הבסיסי של AKI קשורה יותר ויותר עם התאוששות דרך התחדשות של tubules נפרון נמקי. מחקרים אחרונים מיפוי גורל הראו כי אוכלוסיית התאים העיקריים ומאכלס אותה מחדש tubules נפרון פגום בתאי האפיתל שמקורם, באזורים סמוכים וללא כל פגע ^12. ממצאים אלה לא ביטלו את האפשרות כי כליות גזע / ובתאים יכול להשתתף בתהליך, דוחות עצמאיים הראו כי תאים שמקורם במוח העצם יכול לתרום כליה התחדשות ^13. ברור כי יש צורך בחקירות המשיך בצורה טובה יותר לפתור מקורות הסלולר של התחדשות אפיתל הכליה.

שניהם התחדשות נפרון ופיתוח לשתף את התופעה של מתגים במצב הסלולר בין פנוטיפים mesenchymal ו אפיתל. במהלך הפיתוח נפרון, ובתאים mesenchymal להתמיין פנוטיפ נייח, מצרף אל קרום במרתף כדי ליצור את האפיתל צינורי ^3. תופעת הנדידה משערים של תאים אפיתל בעקבות אי ספיקת כליות חריפה מחייבת dedifferentiation לתוך פנוטיפ mesenchymal. מעניין לציין, כי מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תאים mesenchymal בכליות פגום תערוכה פרופיל ביטוי דומה לתא mesenchymal במהלך הפיתוח ^14. דיווחים שונים גילו שינויים במולקולות הדבקה התא, חלבונים מטריקס, ציטוקינים chemokines. בעקבות mesenchymal המוצע המעבר אפיתל, תאים מחדש על קרום המרתף reinitiate פעילויות אפיתל צינורי. קביעת הגנים חשוב בתהליך זה ממשיך להיות נושא מחקר במעבדה שלנו ואחרים. רוב העבודה על מנת להבהיר את גורמי מפתח בתהליך זה נותר להיעשות, אבל התקדמות משמעותית בתחום כבר בישרו על ידי חקר את ההשפעות של גנטמיצין.

AKI ואי ספיקת כליות הנגרמת על ידי גנטמיצין רלוונטי בהתחשב בשכיחות של תרכובות nephrotoxic בשימוש ברפואה ^15. משמש כטיפול גרם שליליים, זיהומים חיידקיים, הממשל של aminoglycosides מוביל לפגיעה חריפה 10-25% מהמקרים. התרופה גורמת שפע של השפעות שליליות הסלולר, יחד והתוצאה אפופטוזיס או נמק בתאי צינורי רבים. מחקרים מצאו את התרופה להיקשר מעדיפים לקומפלקס שנוצר על ידי megalin ו cubulin כי הוא מעורב אנדוציטוזה. מולקולות אלה נמצאים בשפע בתאי האפיתל של אבובית הפרוקסימלית, אם כי הם לא רק ביטוי בתאים אלה. באמצעות איתות הסלולר וכתוצאה מכך אינדוקציה של סטרס חמצוני, שחרור vasoconstrictors, דלדול הסלולר ATP, היפוקסיה, עיכוב phospholipases, אנטיביוטיקה גנטמיצין דומים לגרוםאפופטוזיס ו נמק בתאי האפיתל. בנוסף, אנטיביוטיקה ההדק התכווצות mesangial את הדם פילטר נפרון (glomerulus), וכתוצאה מכך ירידה בשיעור סינון גלומרולרי ו שלילי לשנות את היכולת של הכליות לסנן את הדם. הייצור של מינים החמצן מגיב, מולקולות immunostimulatory, והפעלה של phospholipases יש תופעות מפוזר בכל נפרון, יצירת פתולוגיה קטסטרופלי שמוביל אי ספיקת כליות חריפה.

בעוד שמחקרים אנטיביוטיקה גנטמיצין ודומה היה וימשיך להיות כלי חשוב למחקר התחדשות בכליות, הם חוסר דיוק זה יכול להיות שימושי בהתמודדות עם שאלות מסוימות. המערכת שלנו באמצעות דג הזברה בשילוב עם שיטת לייזר אבלציה המתואר בפרוטוקול זה עונה על הצורך של כלי כזה מחקר מדויק. אבלציה לייזר מאפשר לחוקרים לגרום להרס תאים באזורים מוקד של אבובית הכליה, החל קטן (2-3) עד (> 5-10) אוכלוסיות גדולות, עם דיוק ללא תחרות. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים שיטה שפותחה בעבר החשיפה dextran-conjugates מעדיפים תווית אוכלוסיות אבובית הפרוקסימלי אפיתל. לחלופין, מהונדס קווי דג הזברה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק אחד או יותר אזורים של אבובית יכול לשמש. לדוגמה, cadherin17: eGFP מהונדס דג הזברה התערוכה הקרינה חזקה באזורים אבובית דיסטלי (אם כי באוכלוסיות חלשות הפרוקסימלי), ויכול להיות בעל ערך עבור מחקרים של התחדשות במגזרים אחרים אבובית ^16. הנראות של נפרון יאפשר זמן לשגות הקלטת וידאו של שינויים הסלולר לאורך זמן. בשילוב עם ביטוי במחקרים הגן כגון הר שלם הכלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה, החוקרים יכולים לזהות שינויים מולקולריים נפרון לאורך זמן. יחדיו, אסטרטגיות כאלה יכולים להתחיל לנסח הבנה דינמית יותר של האירועים להתרחש כאשר תאים אפיתל הכליה נהרסים.

החיסרון העיקרי של המודל שלנו לייזר אבלציה היא שזה יכול לשחזר היבטים חלקיים של התנאים הפיזיולוגיים להתברר בבית AKI האדם. מוות של תאים המושרה דרך נזק פיזי מיידי שונה מפל של אירועים שמובילה נמק של תאים, ובתור שכזה גורמי הלחות אלה microenvironments אחר לא יכול להיות זהה. בנוסף, קיימת עדות של אפופטוזיס המושרה במהלך פגיעה בכליות, והוא לא ידוע אם תוצאות כאלה להתרחש עלבון הבאה עם לייזר. עם זאת, בדיוק כמו התרבות תאים הוא כלי טוב יותר תשובות לכמה שאלות המחייבים סביבה מבוקרת מאוד, אבלציה לייזר ישמש מבוקר מאוד במודל vivo של AKI. ככזה, התובנות שליקטתי מתוך כליות מחקרים אבלציה אפיתל של דג הזברה צפוי לקדם את הגילוי של תובנות היסוד, כי ניתן להחיל על חקירות של פציעות כליות אחרים המשמשים פוטנציאל ליצור אבחון טוב יותר בבני אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
העובר מנות	בז	35-1005
Dissection מלקחיים	Roboz	RS-5010
הזרקת מחטים	סאטר Intruments	BF100-50-10
Ultrapure agarose	Invitrogen	16500-500
40 kilodalton (KD) dextran-והעמסת	Invitrogen	D1845
העברת פלסטיק pipet	Samco מדעי, פישר	204, 13-711-23
Tricaine	סיגמא	E10521
Methylcellulose	סיגמא	M0262
דיכאון שקופית	דיג	S175201
12 גם צלחת	קורנינג	3512