Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Riepilogo

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle cellule renali nefrone nel rene embrione zebrafish, o pronephros. Il nostro nuovo metodo può essere utilizzato per integrare nefrotossicità indotta modelli di AKI e ottenere un'immagine ad alta risoluzione comprensione delle alterazioni cellulari e molecolari che sono associati con la rigenerazione epiteliale nel nefrone renale.

Abstract

Danno renale acuto (AKI) è caratterizzata da elevati tassi di mortalità dal deterioramento della funzione renale in un periodo di ore o giorni che culmina con insufficienza renale ^1. AKI può essere causato da una serie di fattori tra cui l'ischemia, farmaco a base di tossicità, o lesioni ostruttive ^1. Ciò si traduce in una incapacità di mantenere l'omeostasi dei fluidi e di elettroliti. Mentre AKI è stata osservata per decenni, efficaci terapie cliniche sono ancora da sviluppare. Curiosamente, alcuni pazienti con danno renale acuto recuperare funzionalità renale nel corso del tempo, un fenomeno misterioso che è stato solo rudimentale caratterizzata ^1,2. La ricerca che utilizza modelli di mammiferi di AKI ha dimostrato che i reni nefrotossina ischemica o con lesioni esperienza di morte delle cellule epiteliali nel nefrone tubuli ^1,2, le unità funzionali del rene che sono costituiti da una serie di regioni specializzate (segmenti) di tipi di cellule epiteliali ³ . All'interno di nefroni, la morte delle cellule epiteliali è più alta in cellule del tubulo prossimale. Ci sono prove che suggeriscono la distruzione delle cellule è seguito da de-differenziazione, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali circostanti, che può rigenerare il nefrone interamente ^1,2. Tuttavia, ci sono molte domande senza risposta circa i meccanismi di rigenerazione dell'epitelio renale, che vanno dai segnali che modulano questi eventi per motivi di variazione gamma di capacità tra gli esseri umani per rigenerare reni feriti.

Il pesce zebra larvale fornisce un modello eccellente per studiare la rigenerazione dell'epitelio renale come il suo rene pronephric si compone di nefroni che si conservano con vertebrati superiori tra cui i mammiferi ^4,5. Il nefroni delle larve zebrafish possono essere visualizzati con tecniche di fluorescenza a causa della relativa trasparenza del giovane zebrafish ^6. Questo fornisce un'opportunità unica di cella di immagine e cambiamenti molecolari in tempo reale, in contrasto con i modelli dei mammiferi in cui nefroni sono inaccessibili perché i reni sono sistemi strutturalmente complessi internalizzati nel animale. Recenti studi hanno impiegato la gentamicina aminoglicoside come agente tossico causale per lo studio di AKI e conseguente insufficienza renale: gentamicina e altri antibiotici hanno dimostrato di provocare AKI negli esseri umani, ei ricercatori hanno formulato metodi da utilizzare per attivare questo agente danni renali in zebrafish ^{7 , 8.} Tuttavia, gli effetti di tossicità degli aminoglicosidi nelle larve di zebrafish sono catastrofiche e letale, che presenta una difficoltà quando si studia la rigenerazione epiteliale e la funzione nel tempo. Il nostro metodo presenta l'utilizzo di ablazione delle cellule bersaglio, come un nuovo strumento per lo studio delle lesioni epiteliali in zebrafish. Ablazione laser offre ai ricercatori la capacità di indurre la morte delle cellule in una popolazione limitata di cellule. Aree diverse di cellule possono essere mirati in base alla posizione morfologica, la funzione, o anche espressione di un particolare fenotipo cellulare. Così, ablazione laser aumenta la specificità di quello che i ricercatori possono studiare, e può essere un approccio nuovo ed efficace per far luce sui meccanismi di rigenerazione dell'epitelio renale. Questo protocollo può essere ampiamente applicata a popolazioni di cellule bersaglio in altri organi nell'embrione zebrafish per studiare lesioni e di rigenerazione in un qualsiasi numero di contesti di interesse.

Protocollo

1. Procedura di microiniezione per etichettare il pesce zebra pronephros epitelio tubulo prossimale

Per questa procedura, si usa un sistema di microiniezione (Appartus Harvard, PLI90), con l'aria compressa fornita da un compressore d'aria (Jun-Air, Modello 6-4), e apparecchi micromanipolatore (Narishege parti MN151, IP3, e GJI) che sono assemblato in una stazione stereomicroscopio (Nikon, SMZ-Zoom 645) le istruzioni per fabbricante. Coniugati destrano sono prontamente endocitato dal nefrone tubulo prossimale, consentendo l'etichettatura preferenziali di questa popolazione di cellule epiteliali ^9.

1. L'esposizione al blu di metilene può accentuare l'autofluorescenza del sacco vitellino e rende la visualizzazione del nefrone tubuli più difficile.
2. Sollevare il embrioni fecondati a 28,5 ° C ad un timepoint sviluppo tra 48-55 ore dopo la fecondazione (HPF). Questo è il palcoscenico ideale per eseguire microiniezioni larve a causa della facilità con cui microiniezione intramuscolare può essere eseguita, e perché la funzione renale ha inizio in questo momento.
3. Rimuovere il corion da qualsiasi zebrafish unhatched usando un paio di pinze fine. Sciacquare i detriti corion dalla capsula di Petri e riempire il piatto con 30 ml di soluzione modificato E3.
4. Preparare un vassoio di iniezione per gli embrioni. I nostri stampi ad iniezione preferito è fatta di 1,5% agarose/E3, in cui si formano depressioni triangolare in modo che l'embrione può essere posizionato all'interno per l'iniezione. Per fare lo stampo di iniezione, si galleggiare uno stampo di plastica con protuberanze a forma di cuneo (descritto in dettaglio in precedenza ¹¹⁾ in una piastra di Petri riempita con una base di 1,5% di agarosio.
5. Preparare aghi microiniezione vetro tirando tubi capillari con un estrattore ago, come descritto nel libro Zebrafish ^10. In breve, tirare i tubi di vetro capillari quindi utilizzare pinze di metallo sottile per tagliare la punta dell'ago microiniezione di fare una punta con una punta mentre si visualizza la punta dell'ago sotto uno stereomicroscopio. Conservare gli aghi taglio coperto da una capsula di Petri e posizionato su plastilina per proteggere il bordo di taglio e di prevenire l'accumulo di polvere.
6. Preparare la soluzione di iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Sciogliere 40 kD destrano-fluoresceina coniugato (Invitrogen, D1845) ad una concentrazione di 1 mg / ml in acqua distillata.
7. Per anestetizzare il pesce, aggiungere 5 ml di 0,2% Tricaine pH 7,0 alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E 'fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di iniettare loro.
8. Trasferire il pesce anestetizzato per un vassoio di stampo ad iniezione utilizzando una pipetta di plastica di trasferimento. Posizionare l'animale con la testa nella parte più profonda della depressione triangolare bene, e su un fianco in modo che il tronco è a riposo lungo il lato inclinato del pozzo.
9. Eseguire microiniezione intramuscolare. Caricare un ago tagliato con 2-3 ml di destrano fluoresceina, e iniettare l'animale in un somite tronco con circa 1 nL di soluzione. Obiettivo per la parte superiore del somite, e di evitare l'estensione del sacco vitellino. Ciò assicura che i tubuli nefrone non sono meccanicamente interrotta dal processo di microiniezione.
10. Trasferimento zebrafish iniettato per un piatto pulito Petri e aggiungere modificato soluzione E3. Lavare gli animali 3 volte con E3 dolce per rimuovere ogni traccia di Tricaine. Coprire il coperchio della capsula di Petri con un foglio di alluminio per fornire luce protezione per il destrano, e tornare gli animali per i 28 ° C durante la notte incubatore.

2. Laser ablazione mirata di cellule del tubulo prossimale

Per questa procedura, si usa uno stereomicroscopio con epifluorescenza a segno animali con destrano fluoresceina vivaci marcato tubuli prossimali e selezionare questi per ablazione laser. Quindi, usiamo un sistema laser pulsato Micropoint (Strumenti fotonici, Inc) che è stato collegato a un microscopio composto (Nikon Eclipse 80i con attacco epifluorescente), e calibrata per l'uso come istruzioni del produttore, per eseguire l'ablazione delle cellule nefrone. Abbiamo avuto più successo di ablazione delle cellule utilizzando un filtro FITC che consente al ricercatore di visualizzare le regioni tubulo fluorescenti in campo chiaro illuminazione.

In anticipo di questa procedura, preparare i media immobilizzazione per l'ablazione, sciogliendo 1,5% di metilcellulosa a 0,02% tricaine/E3. Aliquote negozio di metilcellulosa per l'uso immediato a temperatura ambiente, oppure a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

1. Anestetizzare il pesce zebra 72 HPF aggiungendo 5 ml di 0,2% pH 7,0 Tricaine alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E 'fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di eseguire l'ablazione laser.
2. Procede all'esame degli animali iniettato sotto l'impostazione appropriata fluorescenti e selezionare gli animali in cui è possibile visualizzare facilmente i tubuli prossimali.
3. Trasferimento degli embrioni selezionati per un piatto separato contenente tricaine. Gli animali possono essere anestetizzati fino a 30 minuti prima di eseguire l'ablazione delle cellule. Se il vostro punteggio> 15 animali, di ritorno a queste un piatto separato contenente fresca E3 modificati in attesa ablazione in quanto ogni cella di ablazione richiede diversi minuti.
4. Per eseguire l'ablazione, il trasferimento di uno zebrafish anestetizzati ad una piccola scatola di Petri contenente 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine per 2 minuti per lavare l'embrione nei media immobilizzazione.
5. Poi, il trasferimento dell'embrione a una diapositiva depressione di vetro contenente un calo del 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine. Delicatamente la posizione dell'animale con una sonda sottile in modo che il suo lato ventrale si affaccia sul vetrino e lato dorsale è rivolto verso l'alto.
6. Mettere il vetrino sul microscopio compund palco, e concentrarsi sul lato dorsale dell'animale. Eseguire l'ablazione delle cellule nefrone sotto fuoco premendo il pedale. Vedrete la dispersione della fluorescenza come le cellule epiteliali renali sono ablazione (figura 1A).
7. Delicatamente trasferire l'animale ablato di un pozzo in un 12 ben piatto per la coltura successiva. Sciacquare la E3 2-3 volte per lavare via la metilcellulosa.
8. Dopo l'iniezione, aumentare l'animale al timepoint desiderato ed eseguire l'analisi desiderata come stabilito per le tecniche istologiche e molecolari per gli embrioni di pesce zebra giovani (Figura 2).

3. Rappresentante dei risultati:

I dati che sono riportati nella Figura 1 indicano il periodo di tempo ablazione. Dopo l'iniezione intramuscolare con destrano-coniugati, il tubulo prossimale è preferenzialmente etichettati. L'iniezione di destrano-FITC è stato usato per etichettare il rene per l'ablazione laser, e gli animali sono stati ablato reiniettate con destrano-rodamina in una sola ablazione aggiuntivi timepoint seguenti re-imaging della popolazione tubulo prossimale. Tecniche di analisi di espressione come ibridazione in situ può essere usata per analizzare i cambiamenti nei campioni fissati a timepoints singolo dopo ablazione delle cellule, come mostrato nella Figura 2.

Figura 1: procedura di ablazione laser è seguita da una rapida rigenerazione dell'epitelio del tubulo (AC) Timecourse di cambiamenti cellulari durante e dopo ablazione laser di tubuli larva zebrafish prossimali al momento della ablazione (giorno 3, pannello A), o uno o tre. giorni dopo l'ablazione (giorno 4, pannello B; giorno 7, pannello C). (Top) schemi mostrano la posizione del nefrone, con destrano-FITC (verde) e destrano-rodamina (rosso), e (in basso) immagini dal vivo di controllo e di laser-ablazione (LA) nefroni.

Figura 2:. Analisi di espressione genica dopo ablazione laser Dopo ablazione laser al giorno 3, gli embrioni sono stati fissati e trattati da montare tutto ibridazione in situ per rilevare trascrizioni per slc20a1a, che segnano il segmento contorto tubulo prossimale del nefrone. (A) Un embrione di controllo che non è stato sottoposto ad ablazione laser, (B) un embrione in cui è stato asportato un ampio tratto di epitelio dei tubuli, e (C) un embrione in cui un breve intervallo di epitelio dei tubuli è stato ablato. Linea nera indica l'entità del tubulo prossimale in A per fornire riferimento, le linee blu indicano il grado di ablazione laser in pannelli aC, e * indica il controllo (non ablato) nefrone controlaterale in pannelli aC.

Discussione

Il pesce zebra è un organismo modello molto utilizzato in tutto molti aspetti della scienza, le applicazioni di cui sono in crescita ^6. L'impiego del sistema modello Danio rerio nello studio delle malattie renali, come AKI ha portato ad importanti osservazioni e continuerà ad essere un buon modello per studiare danno renale ^7,8. Con un genoma che è stato sequenziato e molti protocolli molecolari in atto, è diventato sempre più facile da eseguire ricerche sofisticate zebrafish che utilizza modelli transgenici, knockdown genica e studi misexpression. Il pesce zebra ha un ciclo di vita breve con dimensioni di generazione di grandi dimensioni e fasi di sviluppo ben definito. Inoltre, il pesce zebra fasi embrionale e larvale sono in gran parte trasparente, rendendo gli studi di imaging possibile senza dissezione dell'organismo. In tutto le fasi embrionale e larvale, il pesce zebra ha un rene pronephric composto da due nefroni, che rimangono visibili nel corso di questi punti temporali di sviluppo. Zebrafish nefroni pronephric sono analoghe per struttura e funzione ai loro omologhi nei mammiferi, il che rende un buon modello per studi di insufficienza renale acuta ^4,5.

Il rene è cruciale per la sopravvivenza degli esseri umani e altri vertebrati, che funge da organo che purifica il corpo di scorie metaboliche liquido. Questa funzione di pulizia si basa sulla capacità dei nefroni rene di filtrare il sangue, e quindi modificare il filtrato per raccogliere i rifiuti azotati per la secrezione e contemporaneamente mantenere il bilancio idro-elettrolitico. Nefroni sono costituiti da un filtro del sangue, tubulo epiteliale, e in un condotto di scarico. L'integrità strutturale e funzionale di tutte le tre parti è parte integrante della funzione nefrone. Insulti vari al rene, compresa l'esposizione a nefrotossine, ischemia, o di ostruzione delle vie del flusso urinario può provocare AKI ^1. La patologia di AKI è spesso associata a necrosi tubulare acuta ^1,2. Gli studi clinici hanno dimostrato che la conseguente insufficienza renale ha un tasso di mortalità che può variare 7-80% a seconda della causa e il contesto del insufficienza renale. Tuttavia, una diagnosi rapida e l'inversione della causa sottostante di AKI è sempre più associato con il recupero attraverso la rigenerazione dei tubuli nefrone necrotico. Recenti studi di mappatura destino hanno dimostrato che la popolazione di cellule principali che ripopola tubuli nefrone danneggiate sono cellule epiteliali che hanno origine da adiacenti, aree illeso ^12. Questi risultati non hanno eliminato la possibilità che renale cellule staminali / progenitrici possono partecipare al processo, e le relazioni indipendenti hanno suggerito che le cellule del midollo osseo derivate possono contribuire alla rigenerazione renale ^13. E 'chiaro che le indagini costante per risolvere meglio le fonti di cellulare renale rigenerazione epiteliale.

Sia la rigenerazione e lo sviluppo nefrone condividere il fenomeno degli switch allo stato cellulare tra fenotipi mesenchimali ed epiteliali. Durante lo sviluppo nefrone, le cellule progenitrici mesenchimali si differenziano in un fenotipo stazionaria, allegando una membrana basale a formare l'epitelio tubolare ^3. Il fenomeno migratorio ipotizzato di cellule epiteliali seguenti insufficienza renale acuta necessita di una de-differenziazione in un fenotipo mesenchimale. È interessante notare che studi recenti suggeriscono che le cellule mesenchimali nel rene danneggiato esibiscono un profilo di espressione simile a una cellula mesenchimale durante lo sviluppo ^14. Diversi rapporti hanno rilevato cambiamenti nelle molecole di adesione cellulare, proteine ​​della matrice, citochine e chemochine. Dopo la mesenchimali proposto di transizione epiteliali, le cellule rimontare su una membrana basale e riavviare tubolare attività epiteliali. Determinare i geni importanti in questo processo continua ad essere un argomento di ricerca del nostro laboratorio e altri. Gran parte del lavoro per chiarire i fattori chiave in questo processo resta ancora da fare, ma i progressi significativi nel campo è stato annunciato dallo studio degli effetti di gentamicina.

AKI e insufficienza renale causata da gentamicina è rilevante considerando la prevalenza dei composti nefrotossici utilizzato in medicina ^15. Usato come trattamento per le infezioni batteriche gram-negativi, la somministrazione di aminoglicosidi produce la lesione acuta nel 10-25% dei casi. Il farmaco provoca una pletora di effetti negativi cellulare, insieme con conseguente apoptosi o necrosi in molte cellule tubulari. Gli studi hanno trovato il farmaco di legarsi preferenzialmente ad un complesso formato da megalin cubulin e che è coinvolto in endocitosi. Queste molecole si trovano in abbondanza nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale, anche se non si limitano a espressione in queste cellule. Attraverso la segnalazione cellulare con conseguente induzione di stress ossidativo, il rilascio di vasocostrittori, esaurimento di cellulare di ATP, l'ipossia, l'inibizione della fosfolipasi, antibiotici gentamicina e simili causanoapoptosi e necrosi in cellule epiteliali. Inoltre, gli antibiotici innescare contrazione mesangiale nel sangue nefrone filtro (glomerulo), con un conseguente calo della velocità di filtrazione glomerulare e negativamente alterare la capacità del rene di filtrare il sangue. La produzione di specie reattive dell'ossigeno, molecole immunostimolante, e l'attivazione di fosfolipasi hanno effetti diffusi nel nefrone, creando un catastrofico patologia che porta a insufficienza renale acuta.

Mentre gli studi di antibiotici gentamicina e simili sono stati e continueranno ad essere strumenti importanti per la ricerca rigenerazione del rene, non hanno una precisione che può essere utile per affrontare alcune questioni. Il nostro sistema di utilizzare il pesce zebra in combinazione con un metodo di ablazione laser descritto in questo protocollo risponde alla necessità di un tale strumento di ricerca precisa. Ablazione laser permette ai ricercatori di indurre la distruzione delle cellule in zone focali del tubulo renale, che vanno da un piccolo (2-3) di grandi dimensioni (> 50-100) le popolazioni, con una precisione senza eguali. In questo protocollo, utilizziamo un metodo sviluppato in precedenza di esposizione al destrano-coniugati per etichettare preferenzialmente popolazioni epiteliali del tubulo prossimale. In alternativa, le linee transgeniche zebrafish che esprimono la proteina fluorescente verde in una o più regioni del tubulo potrebbero essere utilizzati. Per esempio, cadherin17: eGFP zebrafish transgenico presentano fluorescenza forte nelle regioni tubulo distale (ma debole nelle popolazioni prossimale), e potrebbe essere prezioso per gli studi di rigenerazione in altri segmenti del tubulo ^16. La visibilità del nefrone consentirà time-lapse registrazione video di cambiamenti cellulari nel corso del tempo. Quando accoppiato con studi di espressione genica come montare tutto ibridazione in situ o immunoistochimica, i ricercatori in grado di rilevare alterazioni molecolari nel nefrone nel tempo. Nel loro insieme, tali strategie può cominciare a formulare una comprensione più dinamica degli eventi che traspaiono quando cellule epiteliali renali vengono distrutti.

L'avvertenza importante del nostro modello di ablazione laser è che si può ricapitolare aspetti parziali delle condizioni fisiologiche che traspaiono nel umana AKI. La morte cellulare indotta attraverso istantanee danno fisico è diversa da quella cascata di eventi che porta alla necrosi delle cellule, e come tale i fattori umorali in questi microambienti diversi non può essere identico. Inoltre, esiste evidenza di apoptosi indotta durante il danno renale, e non è noto se tali conseguenze trasparire insulto seguente con un laser. Tuttavia, proprio come la coltura cellulare è uno strumento che meglio risponde ad alcune domande che necessitano di un ambiente altamente controllato, ablazione laser, servirà come altamente controllato modello in vivo di AKI. Come tale, la intuizioni ottenuto da studi ablazione dell'epitelio renale in zebrafish probabilmente promuovere scoperta di intuizioni fondamentali che possono essere applicati alle indagini delle altre lesioni renali e potenzialmente usato per creare una migliore diagnostica negli esseri umani.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Embrione piatti	Falco	35-1005
Dissezione forcipe	Roboz	RS-5010
Aghi per iniezione	Sutter STRUMENTI	BF100-50-10
Ultrapura agarosio	Invitrogen	16500-500
40 kilodalton (KD) destrano-fluoresceina	Invitrogen	D1845
Trasferimento pipetta di plastica	Samco scientifico, Fisher	204, 13-711-23
Tricaine	Sigma	E10521
Metilcellulosa	Sigma	M0262
Depressione scivolo	Pescatore	S175201
12-ben piatto	Corning	3512