腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

要約

ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。

要約

急性腎臓損傷（AKI）が腎不全¹で絶頂に達する時間または数日の期間にわたる腎機能の悪化から、高い死亡率によって特徴づけられる。 AKIは、虚血、薬物ベースの毒性、または閉塞性傷害^1を含む多くの要因によって引き起こされる場合があります。体液と電解質の恒常性を維持することができないでこの結果。 AKIが何十年も観察されている一方で、効果的な臨床治療法はまだ開発されていない必要があります。興味深いことに、AKI患者の一部は、時間の経過だけrudimentally ^1,2を特徴としている不思議な現象が腎機能を回復する。 AKIの哺乳動物モデルを用いた研究は、虚血性または腎毒素、負傷した腎臓はネフロン細管^1,2、上皮細胞タイプ³の特殊な地域のシリーズ（セグメント）から構成されている腎臓の機能単位での上皮細胞の死を経験することが示されている。ネフロン内で、上皮細胞死は、近位尿細管細胞で最高です。細胞の破壊が脱分化、増殖、および完全に^1,2ネフロンを再生成することができます上皮細胞を、周囲の移行が続いている示唆するエビデンスがある。しかし、負傷した腎臓を再生するために人間の間で能力の幅広いバリエーションの理由にこれらのイベントを変調信号に至るまで腎上皮再生のメカニズムに関する多くの疑問が、あります。

幼生ゼブラフィッシュは、そのpronephric腎臓は^4,5哺乳類を含む高等脊椎動物で保存されているネフロンから構成されているとして、腎臓上皮再生を研究する優れたモデルを提供します。ゼブラフィッシュ幼生のネフロンが原因若いゼブラフィッシュ⁶の相対的な透過性の蛍光技術を用いて可視化することができます。これは、腎臓では、動物内で内在化、構造的に複雑なシステムであるため、ネフロンにアクセスできない哺乳類のモデルとは対照的に、画像セルとリアルタイムの分子変化するユニークな機会を提供します。最近の研究では、AKIとその後の腎不全の研究のための毒性原因物質としてアミノグリコシドのゲンタマイシンを採用している：ゲンタマイシンおよび他の抗生物質がヒトにAKIを引き起こすことが示されている、と研究者は、ゼブラフィッシュ⁷の腎臓の損傷を誘発するために、このエージェントを使用する方法を策定しました^、8。しかし、ゼブラフィッシュ幼生におけるアミノグリコシドの毒性の影響は壊滅的と致死であり、時間の経過とともに上皮再生と機能を研究する際に困難を提示れる。私たちの方法は、ゼブラフィッシュの上皮傷害の研究のための新たなツールとして、標的細胞のアブレーションの使用を示します。レーザーアブレーションは、研究者に細胞の限られた集団における細胞死を誘導する能力を与えます。細胞の様々な分野、形態学的位置、機能、あるいは特定の細胞表現型の発現に基づいてターゲットとすることができます。このように、レーザーアブレーションは、研究者が学ぶことができるものの特異性を増加し、腎上皮再生のメカニズムを解明するための強力な新しいアプローチすることができます。このプロトコルは、広く関心のコンテキストの任意の数の傷害と再生を研究するためにゼブラフィッシュ胚で他の臓器の細胞集団をターゲットに適用することができます。

プロトコル

1。ゼブラフィッシュ前腎近位尿細管上皮にラベルを付けるためにマイクロインジェクションの手順

この手順では、我々はその空気圧縮機（6月-エア、モデル6-4）、およびマイクロマニピュレータ装置（Narishege部品MN151、IP3、およびGJI）によって供給される加圧空気を、マイクロインジェクションシステム（ハーバードAppartus、PLI90）を使用あたりの製造業者の指示など、実体顕微鏡ステーション（ニコン、SMZ -ズーム645）で組み立て。デキストランコンジュゲートは、容易にこの上皮細胞集団⁹の優先的なラベリングを可能にする、ネフロン近位尿細管からエンドサイトーシスされています 。

1. メチレンブルーへの曝露は、卵黄嚢の自家蛍光を強調し、ネフロンの可視化をより困難細管なることができます。
2. 28.5での受精胚を上げる° Cを48から55時間後に受精（HPF）との間の発達のタイムポイントに。これは、筋肉内マイクロインジェクションを実行させることのできる使いやすさの幼虫のmicroinjectionsを実行するために理想的な段階であり、腎機能は、この時点で開始されるため。
3. 細かいピンセットを使用して、任意の卵からかえっていないゼブラフィッシュから絨毛膜を取り除く。ペトリ皿と詰め替え変更E3ソリューションの30 MLSでディッシュから絨毛膜の破片を洗浄します。
4. 胚の注入トレイを準備します。私達の好まれた射出成形金型は、三角くぼみが胚を注入するための内部に配置することができるように形成されている、1.5％agarose/E3で作られています。射出成形金型を作るために、我々は、1.5％アガロースの基底で満たされたペトリ皿にくさび状の突起（以前¹¹に詳細に記載）でプラスチック金型をフロートさせます。
5. ゼブラフィッシュブック¹⁰に記載の、針の引き手とキャピラリーチューブを引いて、ガラスのマイクロインジェクションの針を準備します。簡単に言えば、実体顕微鏡下で針先を見ながら鋭い点で先端を作るためにマイクロインジェクションの針の先端をカットするために微細な金属の鉗子を使用してガラスキャピラリーチューブを引き出します。ペトリ皿で​​覆われ、面取り部を保護し、ほこりの蓄積を防ぐために、粘土に位置するカットの針を保管してください。
6. 近位尿細管にラベルを付けるために注射液を準備します。蒸留水で1 mg / mLの濃度で40kDのデキストランフルオレセインコンジュゲート（Invitrogen社、D1845）を溶かす。
7. 魚を麻酔するために、E3の30 MLSのゼブラフィッシュ幼生を含むペトリ皿に0.2％Tricaine pH 7.0の5 MLSを追加します。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚は麻酔する。それは魚が完全に麻酔をかけたり、それらを注入しようとする時にけいれんすることが重要です。
8. プラスチック製のトランスファーピペットを用いて射出成形金型のトレイに麻酔魚を移す。トランクがよくの傾斜面に沿って置かれていることなども三角形のくぼみの最深部に本社を持つ動物を置き、そしてその側に。
9. 筋肉内マイクロインジェクションを実行します。デキストランフルオレセインの2-3μLとカットの針をロードし、そしてソリューションの約1 NLとトランクの体節に動物を注入する。体節の上部を目指す、と卵黄嚢の拡張子を避ける。これは、ネフロンの尿細管が機械的にマイクロインジェクションのプロセスによって破壊されないようにします。
10. きれいなペトリ皿に注入したゼブラフィッシュを転送、および修正されたE3のソリューションを追加します。 Tricaineのすべてのトレースを削除するには、新鮮なE3での動物を3回すすいでください。デキストランのために光保護を提供し、一晩28℃インキュベーターに動物を戻すためにアルミ箔付きペトリ皿の蓋をカバーしています。

2。近位尿細管細胞の標的とレーザーアブレーション

この手順では、我々は、デキストランフルオレセイン明るく標識近位尿細管での動物をスコアとレーザーアブレーションのためにこれらを選択するには落射蛍光と実体顕微鏡を使用してください。その後、我々は、ネフロンのセルのアブレーションを行うために、化合物の顕微鏡（落射蛍光添付ファイル付きのニコンエクリプス80I）に接続されている、とあたりの製造業者の指示として使用するために校正されたパルスmicropointのレーザーシステム（フォトニックインスツル株式会社）を使用します。我々は、明視野照明の下で蛍光管の領域を表示するには、研究者を可能にするFITCフィルターを使用して、セルのアブレーションで最も成功を収めている。

この手順の事前に、0.02％tricaine/E3で1.5％のメチルセルロースを溶解することによりアブレーション用固定化担体を準備。室温ですぐに使用するためにメチルセルロースの店舗のアリコート、または4℃で長期保存のため。

1. E3 30 MLSのゼブラフィッシュ幼生を含むペトリ皿に0.2％Tricaine pH 7.0の5 MLSを追加することで、72 HPFのゼブラフィッシュを麻酔。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚は麻酔する。それは魚が完全に麻酔をかけたり、レーザーアブレーションを実行しようとする時にけいれんすることが重要です。
2. 適切な蛍光灯の設定の下に注入された動物を調べて、簡単に近位尿細管を可視化できる動物を選択します。
3. tricaineを含む別の皿に、選択した胚を移す。最大30分間細胞アブレーションを実行する前に、動物は麻酔することができます。あなたが> 15匹を獲得した場合、各セルのアブレーションには数分かかるとして、アブレーションを待っている間に新しい改変E3を含む別の皿にこれらを返す。
4. アブレーションを実行するには、固定化担体で胚を洗浄するために2分間、1.5％methylcellulose/0.02％tricaineを含む小さなペトリ皿一つ麻酔ゼブラフィッシュを転送する。
5. 次に、1.5％methylcellulose/0.02％tricaineのドロップを含むガラスのうつ病のスライドに胚を移す。静かにその腹側はスライドと背側が上を向いて対向するように微細なプローブを用いて動物を配置します。
6. compund顕微鏡のステージ上でスライドを配置し、動物の背側に焦点を当てます。フットペダル操作でのフォーカスの下ネフロン細胞の切除を行います。腎上皮細胞（図1A）アブレーションされているように、蛍光の分散が表示されます。
7. ゆっくりとその後の培養用12ウェルディッシュにウェルに切除動物を譲渡する。メチルセルロースを洗い流すためにE3を2〜3回すすいでください。
8. 注入後は、希望するタイムポイントに動物を上げ、若いゼブラフィッシュの胚（図2）のための確立された組織学的および分子生物学的手法に従って、目的の分析を行う。

3。代表的な結果：

図1に示されているデータは、アブレーションのtimecourseを示している。デキストランコンジュゲートと筋肉内注射した後、近位尿細管が優先的にラベルが付いています。デキストラン- FITCの注入は、レーザーアブレーションのための腎臓を標識するために使用され、切除動物が近位尿細管の人口を再イメージする一つの追加タイムポイント以下のアブレーションでデキストラン-ローダミンを再注入した。 in situハイブリダイゼーションのような発現解析の手法は、図2に示すように細胞のアブレーションに続く単一の時点においての固定サンプルの変化を、分析するために使用することができます。

図1：レーザーアブレーションの手順は、尿細管上皮の迅速な再生が続きます （AC）の間に細胞の変化のTimecourseとアブレーションの時間（3日目、パネルA）におけるゼブラフィッシュ幼生近位尿細管のレーザーアブレーションに続いて、または1つまたは3つ。日後のアブレーション（4日目、パネルB、7日目、パネルC）。 （トップ）の回路図には、デキストラン- FITC（緑）とデキストラン-ローダミン（赤）と、ネフロンの位置を示し、（底部）の制御とレーザーアブレーション（LA）ネフロンのライブ映像。

図2：レーザーアブレーションは、次の遺伝子発現の解析 3日目で、次のレーザーアブレーションは、胚は、ネフロンの近位尿細管のセグメントをマークslc20a1aための転写産物を検出するin situハイブリダイゼーション全体マウントによって固定し、処理した。 （A）レーザーアブレーションを受けていなかったコントロール胚では、尿細管上皮の大規模なストレッチがアブレーションされた（B）胚、および尿細管上皮の短い間隔がアブレーションされた（C）胚。黒のラインが基準を提供するために近位尿細管の程度を示す、ブルーのラインは、パネルBCでのレーザーアブレーションの程度を示す、*は対照​​（非切除）のパネルBCの対側ネフロンを示している。

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、科学の多くの側面全体に広く使用されているモデル生物^、6を成長しているのアプリケーションです。 AKIのような腎疾患の研究ではゼブラフィッシュのモデルシステムの採用は重要な観測につながっていると腎臓の傷害^7,8を研究する良いモデルであり続けるだろう。配列決定されたゲノムと場所で多くの分子のプロトコルで、それはトランスジェニックモデル、遺伝子のノックダウンとmisexpressionの研究を利用する洗練されたゼブラフィッシュの研究を実行することがますます容易になっています。ゼブラフィッシュは、大規模な世代のサイズと明確に定義された発達段階で短いライフサイクルを持っています。さらに、ゼブラフィッシュ胚および幼虫期は、生物の解剖せずにイメージング研究を可能にし、大部分が透明です。胚と幼生段階を通じて、ゼブラフィッシュは、これらの発達のタイムポイントの間に表示されたままにtwoネフロンから構成されるpronephric腎臓を持っています。ゼブラフィッシュpronephricネフロンは^、4,5急性腎不全研究のための良いモデル作り、構造およびそれらの哺乳類の対応と機能的に似ています。

腎臓は、液体の代謝物の体を清潔に器官として、人間と他の脊椎動物の生存に不可欠です。このクレンジングの機能は、血液をフィルタリングし、分泌するための窒素廃棄物を収集するためにろ液を修正し、同時に体液と電解質バランスを維持するために腎臓のネフロンの能力にかかっている。ネフロンは、ダクト内の血液フィルター、上皮尿細管、およびドレインで構成されています。すべての3つの部分の構造的および機能的完全性は、ネフロンの機能に不可欠です。 nephrotoxinsへの曝露、虚血、または尿の流出路の閉塞を含む腎臓への様々な侮辱は、AKI ¹で発生する可能性があります。 AKIの病理学は、しばしば急性尿細管壊死の^1,2に関連付けられています。臨床研究は、腎不全をその後のことは70〜80パーセントから腎不全の原因とコンテキストに応じて任意の場所の範囲で指定できます死亡率を持っていることが示されている。しかし、AKIの根本原因の迅速な診断と反転がますます壊死ネフロンの尿細管の再生を経由して回復に関連付けられています。最近の運命のマッピングの研究は、損傷したネフロンの尿細管を再生成し、主要細胞集団が隣接し、無傷の領域¹²から由来する上皮細胞であることが示されている。これらの知見は、腎幹細胞/前駆細胞のプロセスに参加する可能性を排除していない、と独立した報告書では、骨髄由来の細胞は腎臓の再生¹³に貢献できることが示唆されている。それは、継続的な調査がよりよい腎上皮再生の細胞源を解決するために求められていることは明らかである。

ネフロンの再生と開発を共有する間葉と上皮表現型との間の細胞の状態でスイッチの現象の両方。ネフロンの開発中に、間葉系前駆細胞は、尿細管上皮^3を形成する基底膜に付着、静止表現型に分化する。急性腎不全は、次の上皮細胞の推測回遊現象は、間葉表現型への分化が必要となる。興味深いことに、最近の研究では、損傷した腎臓で間葉系細胞が開発¹⁴の間葉系細胞と同様の発現プロファイルを示すことを示唆している。さまざまなレポートは、細胞接着分子、マトリックスタンパク質、サイトカインやケモカインの変化を検出した。上皮への移行提案間葉に続いて、細胞が基底膜に再組み立てし、尿細管上皮の活動を再起動してください。このプロセスで重要な遺伝子を決定することは私たちの研究室や他の人のための研究のテーマであり続けている。ずっとこのプロセスの主要な要因を解明する作業が行われるのままですが、フィールド内の重要な進展は、ゲンタマイシンの影響の研究が歓迎されている。

AKIとゲンタマイシンによって引き起こされる腎障害は医学¹⁵で使用した腎毒性化合物の有病率考えると関係があります。グラム陰性細菌感染症の治療薬として使用される、アミノグリコシドの投与は症例の10〜25％の急性傷害につながる。薬は一緒に多くの尿細管細胞のアポトーシスや壊死の結果、陰性細胞効果の茄多を引き起こす。研究では、エンドサイトーシスに関与しているメガリンとcubulinによって形成される複合体に優先的に結合する薬剤を発見した。彼らはこれらの細胞での発現に限定されるものではないものの、これらの分子は、近位尿細管の上皮細胞に豊富に見出される。酸化ストレスの誘導、血管収縮薬の放出、細胞内のATP、酸素の枯渇、ホスホリパーゼの阻害をもたらす細胞内シグナル伝達を介して、ゲンタマイシンと同じような抗生物質が原因となる上皮細胞のアポトーシスと壊死。さらに、抗生物質は、糸球体濾過率の低下が得られ、否定的に血流をフィルタリングする腎臓の能力を変えること、ネフロン血液フィルター（糸球体）にメサンギウム収縮を誘発する。活性酸素種の産生、免疫刺激分子、およびホスホリパーゼの活性化は、急性腎不全につながる致命的な病理を作成し、ネフロンの拡散効果を持っている。

ゲンタマイシンと類似の抗生物質の研究がされており、腎臓の再生研究のための重要なツールであり続けるだろうが、彼らは特定の質問への対応に役立てることができます精度を欠いている。このプロトコルで説明されているレーザーアブレーション法と一緒にゼブラフィッシュを用いての私たちのシステムは、このような精密な研究のツールの必要性に答える。レーザーアブレーションは、（2-3）小から他に類を見ない精度を持つ大規模な（> 50-100）集団、に至るまで、研究者は尿細管の重点分野における細胞破壊を誘導することができます。このプロトコルでは、我々は優先的に近位尿細管上皮集団にラベルを付けるためにデキストランコンジュゲートへの暴露の前に開発された手法を利用する。また、尿細管のいずれかまたは複数の領域に緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの行は使用することができる。例えば、cadherin17：EGFPトランスジェニックゼブラフィッシュは、遠位尿細管の地域（ただし、近位集団で弱い）で強い蛍光を示し、他の尿細管のセグメント¹⁶で再生の研究に貴重かもしれない。ネフロンの可視性は、時間をかけて細胞の変化のタイムラプスビデオ録画が可能になります。 in situハイブリダイゼーションや免疫組織化学の全体マウントなどの遺伝子発現研究と組み合わせることで、研究者は時間をかけてネフロンにおける分子の変化を検出することができます。一緒になって、そのような戦略は、腎上皮細胞が破壊されるときに蒸散するイベントのよりダイナミックな理解を策定し始めることができます。

私達のレーザーアブレーションモデルの主な注意点は、それが人間のAKIで蒸散生理的条件の部分的な側面を再現できることです。瞬間的な物理的な損害を与えて誘発される細胞死は細胞で壊死につながるイベントのカスケードとは異なり、これらの異なる微小環境におけるそのような液性因子は同一ではない可能性がある。さらに、そこに腎臓の傷害時に誘導されるアポトーシスの証拠が存在し、それはそのような結果は、レーザーを使用して、次の侮辱を蒸散かどうかは不明である。しかし、細胞培養がより良い答えを高度に制御された環境を必要といくつかの質問に、そのツールであるのと同様に、レーザーアブレーションは非常にAKIのin vivoモデルでの制御として機能します。このように、ゼブラフィッシュで腎上皮アブレーションの研究から獲得洞察は、おそらく他の腎損傷の調査に適用し、潜在的にヒトのより良い診断メッセージを作成するために使用できる基本的な洞察の発見を推進していきます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
胚の料理	ファルコン	35から1005
解剖の鉗子	Roboz	RS - 5010
注射針	サターインストゥルメント	BF100 - 50から10
超高純度のアガロース	インビトロジェン	16500-500
40キロダルトン（kD）のデキストランフルオレセイン	インビトロジェン	D1845
プラスチック製のトランスファーピペット	サムコサイエンティフィック、フィッシャー	204、13-711-23
Tricaine	シグマ	E10521
メチルセルロース	シグマ	M0262
うつ病のスライド	フィッシャー	S175201
12ウェルディッシュ	コー​​ニング	3512