עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

Summary

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

Abstract

העכברוש מבוגר mesentery חלון assay אנגיוגנזה מתאים מבחינה ביולוגית מתאים באופן יוצא מן הכלל ללימוד הנבטה אנגיוגנזה in vivo [ראו ניירות ביקורת], המהווה את טופס שולט של אנגיוגנזה בגידולים אנושיים שאינם סרטניים ברקמות, כפי שפורט ביקורת מוזמן ניירות ^1,2. אנגיוגנזה המושרית בחלקים mesenteric קרומי בזריקה (IP) intraperitoneal של גורם הפרו angiogenic יכול להיות מווסתת על ידי תת עורית (SC), תוך ורידי (iv) או דרך הפה (PO) טיפול עם סוכני שינוי של בחירה. כל חלק של קרומי mesentery הוא שקוף ממוסגר על ידי רקמת שומן, זה נותן מראה חלון דמוי.

Assay יש את התכונות יתרון הבאים: (i) את הרקמה הבדיקה vascularized מקורי, אם כי בדלילות, ומאז הוא דק מאוד, רשת microvessel הוא כמעט דו מימדי, אשר מאפשר את הרשת כולה כדי להעריך מיקרוסקופית באתרו: ( ii) בחולדות המבוגר רקמות מבחן חסר אנגיוגנזה פיזיולוגי משמעותי, המאפיינת נורמלי ביותר ברקמות יונקים בוגרים, מידת כלי הדם המקומיים, עם זאת, בקורלציה עם הגיל, כפי שפורט ¹ (iii) את רמת זניח של אנגיוגנזה טראומה הנגרמת מבטיחה רגישות גבוהה, (iv) assay משכפל את המצב הקליני, כפי אנגיוגנזה-ויסות תרופות הבדיקה ניתנות מערכתית ותגובות הנצפה משקף את ההשפעה נטו של כל חילוף החומרים, הסלולר, ושינויים מולקולריים הנגרמת על ידי הטיפול, (v) assay מאפשר הערכות אובייקטיביות, משתנים כמותיים משוחדת של הרחבה מרחבית צפיפות כלי הדם, דפוס הקמת הרשת, כמו גם של נימי הנבטה, ובכך מאפשרים ניתוחים סטטיסטיים חזקים של השפעה במינון מולקולרית מבנה פעילות יחסי; (ו ) assay מגלה עם רגישות גבוהה את ההשפעות הרעילות של טיפולים או מזיק במונחים של שיעור ירידה של הגוף לצבור משקל פיזיולוגי, כמו חולדות מבוגר לגדול וחסונה.

תורן תאים בתיווך אנגיוגנזה הודגם הראשון באמצעות assay זה ^3,4. המודל מדגים רמה גבוהה של הפליה לגבי המינון אפקט היחסים ואת ההשפעות של נמדדת באופן מערכתי כימית או תפקודית תרופות וחלבונים קשורה קשר הדוק, כולל: (i) במינון נמוך, מנוהל כמו מטרונום chemotherapeutics סטנדרטי תשואה מגוונים, תרופה ספציפית השפעות (כלומר, פעילויות אנגיוגנזה-מדכאים, ניטרלי או אנגיוגנזה מגרה ^5), (ii) טבעי ברזל בלתי רוויות לקטופרין אנושי, המעורר ^VEGF-A-6 אנגיוגנזה בתיווך, וטבעי ברזל בלתי רוויות שור לקטופרין, אשר מעכב VEGF-A- אנגיוגנזה בתיווך ^7; (iii) נמוך משקל מולקולרי שברים הפרין המיוצר על ידי אמצעים שונים ^8,9. יתר על כן, assay הוא מתאים מאוד מחקרים על ההשפעות המשולבות על אנגיוגנזה של סוכנים אשר מנוהלים בצורה מערכתית במקביל או רציפים.

הרעיון של הפיכת הווידאו הזאת שמקורה המנוח ד"ר יהודה פולקמן כאשר ביקר במעבדה שלנו עדים מתודולוגיה שמפגינים.

סקירת עיתונים (מוזמן) לדיון בהערכת assay

Norrby, ק במודלים vivo של אנגיוגנזה. J. Cell. מול. מד. 10, 588-612 (2006).

Norrby, בדיקות ק והתרופות עם מודלים אנגיוגנזה. מומחה Opin. והתרופות. וגיליתי. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. בעלי חיים

1. מכרסמים קטנים, כגון חולדות, עכברים, שרקנים, שימשו במודלים של בעלי חיים. למרבה הצער, עכברים בוגרים (זנים עכבר רבים כבר העריכו) נוטים חוסר או יש רק מספר נמוך מאוד של פוטנציאל הוריות microvessels (שממנה יכולה לנבוע אנגיוגנזה) בתוך חלונות mesenteric שלהם, מה שהופך את לימודי באמצעות עכברים אמין. לכן, assay פותחה בעיקר חולדות.
2. החולדות, אשר התאקלם לסביבה תקן לפחות 7 ימים לאחר הלידה מתוך המגדל, הם שוכנו בדרך כלל בכלוב סטנדרטי בזוגות תחת מחזור אור / חושך 12 שעות עם גישה חופשית למים כדורי. כל חיה מסומן. אנו משתמשים בעיקר חולדות מבוגרים צעירים (בדרך כלל 7-10 שבועות של גיל של זנים שונים, אך בדרך כלל זכר Sprague-Dawley חולדות; אצל חולדות צעירות יותר 5-6 שבועות של גיל מספר microvessels יליד נוטה להיות נמוך) המתקבל מגדלים שונים. בתקופה לפני הניסוי ובמהלך הניסוי, החיות הם שקלו כל יום שני, תמיד ביום של הקרבה. כאשר בעלי החיים מטופלים ip במקביל (לזירוז של אנגיוגנזה, ראה להלן) או sc iv או פו, הם שקלו כל יום. זה מאפשר הקמת קבוצות הניסוי והבקרה של משקל הגוף שווה בתחילת הניסוי, ומאפשר ניטור של השפעת הטיפול על הגוף, משקל לזכות במהלך הניסוי. מאז חולדות זכרים בוגרים לגדול וחסונה פיזיולוגית (צובר כ 40-60 גרם בשבוע, תלוי בסוג של מתח), משקל לזכות פיגור הוא סמן רגיש תחליף של רעילות, מערכתיות רווחה, אנורקסיה, וכישלון לשגשג.

אנחנו עובדים מתקן ברמה גבוהה טיפול בבעלי חיים מאמצים רבים נעשים כדי לצמצם את רמות הלחץ שחווים בעלי החיים. קווים מנחים אתיים הנוכחי הם אלה שהקימו וורקמן פ et al. (הנחיות לרווחת ואת השימוש בבעלי חיים בחקר הסרטן. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת גטבורג אישרה את המחקרים הללו.

2. Pro-angiogenic intraperitoneal טיפול

1. בעד מועמד angiogenic גורם להיבדק הוא מומס בדילול מלא מלוחים, רעלן פנימי חינם המשמש עירוי של חולים (אפילו ברמות נמוכות מאוד, הוא רעלן פנימי הפרו angiogenic). כל הפתרונות בנויים טרי ביום ההזרקה, סטרילי, מסוננים (Millipore 0.22-מיקרומטר סינון), בדק את ה-pH נייטרלי (7.1-7.3), והשתמש בטמפרטורת החדר.
   סוכן הבדיקה מוזרק בריכוזים נמוכים או נמוכים מאוד. לדוגמה, החולדה rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF; מו"פ מערכות אירופה בע"מ, Oxon, בריטניה), המהווה את VEGF-A השולט איזופורם בחולדות, הוא מדולל ל pmole 96 / מ"ל מלוחים רעלן פנימי חינם, קפוא ו מופשר נפח של 5 מ"ל מוזרק לתוך ה-IP החולדה. אנו משתמשים מזרק 5 מ"ל עם מחט 0.8 מ"מ (מחט ירוקים, 21G) להזרקה ip. טיפול זה, בהתחשב פעמיים ביום למשך 4.5 ימים, כלומר. מ שני בבוקר (יום 0) עד יום שישי בבוקר (יום 4), גורם לתגובה חזקה אנגיוגנזה הנבטה ברקמת מבחן mesenteric, שבשיאה הגיעה ל 21 יום מסביב.
   ניהול ה-IP הפתרון מבטיח כי נפח כולו מועבר לתוך חלל הצפק (ולא לתוך שלפוחית ​​השתן, המעיים או כל איבר אחר). הזרקה מהירה של 5 מ"ל מאפשר מישוש אישור על ידי המפעיל כי סילון הנוזל עבר דרך דופן הבטן לתוך חלל הבטן.
   בהמשך, לפני או במקביל לטיפול הפרו angiogenic ip, סוכן בכל מבחן של הבחירה יכול להינתן באופן מערכתי.

3. Administation מערכתית של אנגיוגנזה-ויסות סוכנים

1. נתיב אחר מלבד דרך ה-IP יכולה לשמש, שכן טיפול ip עשוי להשפיע על תגובת angiogenic מתמשך באמצעות אינדוקציה של דלקת או אולי על ידי הפעלת תא הפיטום ברקמות הבדיקה, אשר יכול להוביל לתגובה הפרו angiogenic חזק. מלבד אוראלית או בהזרקה sc יחיד או iv, אנו מרבים להשתמש sc הממשל באמצעות minipumps אוסמוטי (אחד או יותר, עם כמויות משתנות ושאיבה פעמים) כדי לספק את הפתרון בקצב קבוע לתקופה של עד שנתיים או מספר שבועות.
2. אינפוזיה תת עורית ממושכת של סוכנים מבחן
   מילוי השתלת minipumps האוסמוטי
   בדרך כלל ב 5 יום, כלומר יום אחד לאחר סיום הטיפול VEGF ip, minipumps אוסמוטי (לדוגמה, דגם 2ML2, עם קצב שאיבה קבועה של 5.0 μl / שעה במשך 14-15 ימים; משאבות אוסמוטי Alzet, Mountain View, CA , ארה"ב) מלאים בתנאים סטריליים עם סוכן הבדיקה או את הרכב המתאים. לאחר אחסון סטריליים 0.9% (w / v) NaCl לילה בשעה 37 ° C, את המשאבה (ים) מושתל בניתוח sc על הגב (בצד של colu השדרהmn באזור השכמות) של חולדות שהיו בהרדמה באמצעות גז isoflurane (Isoba וטרינר, שרינג פלאו לבריאות בעלי חיים, Merck & Co, Inc, Whitehouse Station, ניו ג'רזי, ארה"ב), תחילה בחדר שקוף אטום ו לאחר מכן באמצעות מסכה (כדי לצמצם את הלחץ שנגרם לבעל החיים הבא, החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני שהוא בה שימוש חוזר). החתך בעור עשה עבור השתלת המשאבה הוא sutured מיד לאחר ההשתלה באמצעות חוט משי.
   מאז החיות במשקל פיזיולוגית במהלך תקופת הניסוי סוכני הבדיקה ניתנות בקצב קבוע, המינון שנבחר בפועל עבור התרופה מבחן לכל ק"ג משקל גוף גבוה יותר מאשר המינון הממוצע בתחילת התקופה עירוי נמוכה מאשר המינון הממוצע בסוף התקופה עירוי.
   עירוי רציף, כפי שתואר כאן, ניתן לראות בצורה ממושכת של טיפול מטרונום.

4. סיום הניסוי

1. חיה אחת בכל פעם מושם בתא אטום ושקוף, אשר סמוקות עם גז CO _2, אשר במהירות הורג את בעלי החיים. החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני בשימוש שוב.

5. רקמות דוגמאות קציר

1. כפי שניתן לראות ב-DVD, דופן הבטן היא פתחה את mesentery קטן בבטן מזוהה, כולל החלק הדיסטלי ביותר המגיעה שסתום ileo-cecal (בצומת של המעי הדק למעי הגס). ארבעה (או יותר) של רוב ממוקם distally "חלונות" ממוספרים, להפיץ על המטרה Superfrost מטופל רגיל פלוס שקופיות (DAKO דנמרק A / S, Glostrup, דנמרק). חשוב להימנע, במידת האפשר, זיהום עם דגימות דם, תוכן המעיים או נוזלי גוף אחרים, כמו חומרים אלה עשויים להיות מוכתם לא במיוחד, אם כי זה לא לפסול את להדמיה immunohistochemical הבאות של microvessels.
2. הדגימה לכל חלון mesenteric עם קטע מעי המצורפת קטן מתפשט בשקופית מיובשים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. ואז, גדם המעי מנותקת, ואילו דגימות שלם mesentery קרומי מאוחסנים ב -20 ° C לפרקי זמן ממושכים. זו מוצגת ב-DVD.

יצוין כי vasculature רקמות פטנט ניתן דמיינו לפני הקציר עם מיקרוסקופיה מועבר intravital אור.

6. פרוטוקול מכתים immunohistochemical של Microvessels

1. יום 0
   דגימות מותר להפשיר מ -20 ° C לטמפרטורת החדר, מיובשים בארון ב 60 ° C עבור 1 שעה, ושמרו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
2. יום 1
   מניחים את השקופיות מכתים מחזיקי שקופיות (במסלול בכל שנייה) בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.8) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון הוא מושלך ובמקומו לפתרון הבא, וכן הלאה עבור כל השלבים הבאים.
3. טריפסין טיפול
   מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם פתרון טריפסין (25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). מחק את הפתרון ואת לדגור פעמיים עם פתרון סוכרוז 2.5% (בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל פעם). מחק את הפתרון ולשטוף כמה פעמים אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות כל אחד).
4. חסימת
   מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם 0.5% H ₂ O ₂ ב מתנול (בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות). מחק את הפתרון ולשטוף עם אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות). מחק את הפתרון ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) (בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות בכל פעם).
5. דגירה
   Incubations כל בתא humidified בטמפרטורת החדר. כ 150 μl של כל אחד הפתרונות המפורטים להלן משמשים לכל שקופית. השקופיות ממוקמים בתא humidified ואת הפתרונות הם pipetted אל דגימות (הלא קרומי חלקים לא צריך להיות מכוסה על ידי הפתרונות).
   עבור כל אחת מהפעולות הבאות, בזהירות להתנער כל פתרון לפני הפתרון לאחר מכן הוא הוסיף.
   1. דגירה עם רגיל (חסימה) בסרום (סוס) (ABC בערכה) 3 טיפות פתרון צהוב / 10 מ"ל דילול חיץ במשך 20 דקות.
   2. דגירה עם נוגדן ראשוני ARU0181, אשר תוויות וסקולרית עכברוש לתאי אנדותל. הנוגדן הוא מדולל 1:600 ​​עם חיץ דילול (Biosource) (100 μl מדולל פי 40 [קפוא] בתוספת 900 חיץ דילול μl) ו הדגירה מתרחשת בן לילה ב 4 ° C.
6. יום 2
   מגלשות יוסרו מן החדר humidified, הנוגדן העיקרי נמחקת, וגם את השקופיות ממוקמים בעל מכתים שקופיות, אשר שקוע בצנצנת מכתים ושטף פעמיים עם כפות(PH 7.8) במשך 8 דקות.
   1. דגירה עם נוגדן biotinylated (ABC ערכת)
      השקופיות מונחות אופקית בתא humidified ו מודגרות עם ירידה של 1 פתרון כחול / 10 מ"ל דילול חיץ במשך 30 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות בעל מכתים שקופיות שקוע בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות.
   2. דגירה עם ריאגנט ה-ABC
      מגלשות ממוקמות שוב אופקית בתא humidified ואת הפתרונות הבאים pipetted על החלקים קרומי דגימות: 2 טיפות של תמיסת כתום בתוספת 2 טיפות של חום פתרון / 10 מ"ל כפות (pH 7.4) במשך 30 דקות. מערבבים היטב 30 דקות לפני השימוש! מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות.
7. מכתים עם DAB (0.05%)
   צעד זה חייב להתבצע במנדף כימי מאוורר!
   מניחים את שקופיות ולהוסיף את 3,3-diaminobenzidine (DAB; סיגמא אולדריץ ') פתרון בעזרת פיפטה: פתרון DAB 0.1% ב TBS (pH 7.4) [קפוא] הוא מדולל 01:01 בתערובת של 10 μl H ₂ O ₂ ו - 7.5 מ"ל כפות (pH 7.4). פתרון זה רק סטרילית, מסוננים לפני השימוש (לחסל את כל חלקיקי שעלולים לטשטש את התמונה המיקרוסקופית). הכתם דגימות במשך 8 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית מכתים שקוע בצנצנת מכתים. לשטוף תחת זרם מי ברז ולאחר מכן אקווה DEST במשך כמה דקות.
8. התייבשות
   מגלשות נשמרים מחזיק את השקופית מכתים. שטפו על ידי השלכת ומילוי מכתים את הצנצנת המכילה אקווה DEST / אתנול: אקווה DEST, אלכוהול 70%, 95% אלכוהול, אלכוהול מוחלט, עם 2 דקות כל פתרון.

7. הדמיה הערכת רשת כלי הדם של הדגימה כל חלון mesenteric לאחר מכתים immunohistochemical של כלי הדם לתאי אנדותל

כפי שמוצג בסרט, microvessels הם מיקרוסקופית דמיינו באתרו ברקמה ללא פגע.

1. ראשית, אנו משתמשים במיקרוסקופ ציור עם טווח הגדלה 14-34 (Leica M Wild 3Z) כדי עפרון על נייר לבן את אזור החלון כולו, כמו גם את האזור כולו vascularized (VA) לכל חלון mesenteric. VA, כאחוז האזור כולו, נמדדת בקלות באמצעות planimetry ממוחשב או לא ממוחשב (או פשוט על ידי חיתוך החוצה שקלול את התמונה של החלון כולו, את התמונות של כל vascularized שלה חלקים).
2. באמצעות מיקרוסקופ עוד ציור, פרופילים microvessel בודדים, אשר מזוהים בקלות, מצוירים בדיו שחור על נייר לבן בהגדלה 80 בתוך שדות שנבחרו באקראי. זוהי נקודת המוצא של הערכה שלאחר מכן morphometric ממוחשב של אורך כלי הדם (MVL), אשר היא בעצם מדידת צפיפות כלי הדם.
3. לחלופין, משתנים הקשורים להיווצרות דפוס כלי הדם, כמו גם להערכה של מספר נבטים כלי הדם ואורך נבטים כלי הדם היחיד (מס 'SP ו-Le. SP, בהתאמה) ניתן לקבוע. -הניגוד אופטימלי בין המבנים המתוארים כלי שחור על רקע לבן מקל ניתוחים מפורטים של התמונות מסחרי תוכניות ממוחשבות morphometric ביותר.
4. ברוב המקרים, את המשתנים העיקריים הם VA ו MVL, אשר מוכפל כאשר יחד ליצור את אורך כלי הדם הכולל (TMVL).

8. ניתוח סטטיסטי

בדרך כלל אנו משתמשים בתקן הלא פרמטרית Mann-Whitney U-מבחן לנתח מזווג (שני זנב) תצפיות. ממוצע של ארבעה חלונות mesenteric לכל חיה משמש העצמאי נתונים נקודות עבור כל משתנה של חלון mesenteric. הקריטריון של מובהקות סטטיסטית הוא P ≤ 0.05.

Discussion

Assay הוצג בשנת 1986 ויש לו ³ ברציפות פותחה עוד ומעודן במעבדה שלנו ^7,10-12. כפי שנאמר בעיתונים ביקורת (מוזמן) ^{1, 2,} assay משווה גם עם יונקים אחרים assay אנגיוגנזה vivo ביחס במיוחד תכונות חשובות כגון רקמת המבחן למבוגרים הוא מקורי vascularized וחסר אנגיוגנזה פיזיולוגי; טראומה מינימלית, אם בכלל, היא שנגרם לרקמות; משתנים כמותיים נמדדים באמת, המאפשר ניתוח סטטיסטי קול לגבי מנה תגובה ופעילות מולקולרית מחקרים; אנגיוגנזה נביטה מתרחשת, אשר predominating ברקמות גידולים רגילים; נתוני רעילות מצטברים בקלות חולדות לגדול וחסונה פיזיולוגית בבגרות. תכונות נחות עשוי לכלול את העובדה assay הוא יחסית זמן רב, במיוחד כאשר בהערכת מספר ואורך מקטעי microvessel הפרט נבטים microvessel, כי הוא אינו מאפשר תצפיות real-time/serial, וכי הוא מתאים כמעט עבור עכברים מאז חלונות mesenteric רבים בעכברים חוסר microvessels הורה פוטנציאל נימים חדש שממנו יכול לנבוע.

בזמן אמת תצפיות, עם זאת, מופעל על ידי מיקרוסקופיה intravital שבו חלונות mesenteric exteriorized אבל שלמים הם פרושות מעל הבמה מיקרוסקופ בעוד החיה מורדמת, כפי שפורט ^1.

התקדמות משמעותית במחקר אנגיוגנזה הושגו בעשורים האחרונים באמצעות מודלים כגון micropocket הקרנית, קרום חומוס chorioallantoic ו sc מבחני Matrigel תקע, אשר הם כלי שימושי אבל בסופו של דבר מוגבל. יישומים קליניים עתידיים של טיפולים אנטי angiogenic ופרו angiogenic מחייבים הקמת ואימות של יותר רגיש ורלוונטי מבחינה ביולוגית, טרום קליניים במודלים כמותיים באמת, כמו זה המתואר בדו"ח הנוכחי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
קטלוג #	ARU0181
Clone #	MRC OX-43