쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

요약

physiologic angiogenesis 그 부족 일반 성인 vascularized 포유류의 조직은 학습하는 데 사용됩니다 수술 개입에 노출되지 않았습니다 (I) 개시 및 시험 요원의 intraperitoneal 관리 다음 angiogenesis의 개발, 그리고 체계적인 관리 아래와 angiogenesis의 (2) 수정 테스트 에이전트를 선택했습니다.

초록

성인 쥐 장간막 창 angiogenesis 분석은 생물학적으로 적합하고 매우 잘 생체내에 angiogenesis를 돋아의 연구에 적합, 인간 종양이 아닌 종양 조직에서 angiogenesis의 지배 형태로 초대 검토에서 논의 [검토 서류를 참조] 서류 ^1,2. 프로 angiogenic 요인의 intraperitoneal (IP) 주입에 의해 막의 mesenteric 부품에 유도 Angiogenesis은 피하 (SC), 정맥 주사 (IV) 또는 구두 (PO) 선택 수정 에이전트와 치료에 의해 변조된 수 있습니다. 장간막의 각 막의 부분은 그것을 윈도우와 같은 외관을주는 반투명 및 지방 조직에 의해 누명을 것입니다.

분석은 다음과 유리한 특징이 있습니다 (I) 시험 조직 띄엄띄엄이라도 기본적으로 vascularized이며, 매우 얇은이기 때문에, microvessel 네트워크는 전체 네트워크가 현장에서 미세 평가 수있는, 거의 2 차원이며 ( II) 성인 쥐에서 테스트 조직은 대부분의 정상 성인 포유 동물 조직을 특징 짓는 중요한 physiologic angiogenesis를 부족, 기본 vascularization의 정도는, 그러나, 같은 ¹ 논의 나이 상관이며 외상에서 비롯된 angiogenesis의 (3) 무시할 수준 높은 감도를 보장하며, angiogenesis - modulating 시험 약물이 systemically 실시하고 응답이 모든 신진 대사, 세포, 그리고 치료에 의해 유도된 분자 변경의 네트워크 효과를 반영 관찰 그대로 (4) 분석은 임상 상황을 복제, (V) 분석은이를 복용 효과와 분자 구조 - 활동 관계의 강력한 통계 분석 기능을 활성화뿐만 아니라 돋아 모세관의로, microvascular 공간 확장, 밀도 및 네트워크 패턴 형성의 목적, 양적, 편견 변수의 평가를 허용하며, (VI 성인 쥐가 견고하게 성장 등) 분석은 physiologic 바디 - 체중 증가의 감소 속도 측면에서 높은 감도와 함께 치료의 독성이나 유해한 효과를 보여줍니다.

마스트 세포 - 매개 angiogenesis는 먼저 분석 ^3,4을 사용하여 시연했다. 모델은 복용량 - 효과 관계와 포함하여 systemically 화학적 또는 기능 관리 밀접한 관련이 약물과 단백질의 측정 효과에 대한 차별의 높은 수준을 보여줍니다 : (I) 낮은 복용량, metronomically 다양한 마약 관련 효과를 얻을 표준 chemotherapeutics을 관리 (즉, angiogenesis - 진압, 중성 또는 angiogenesis - 자극 활동 ^5), (2) 억제 VEGF - A - 중재 angiogenesis ⁶ 자극 천연 철분 불포화 인간 락토페린, 자연 철 - 불포화 소 락토페린, VEGF - A - 중재 angiogenesis ^7, 그리고 (iii) 여러 가지 방법 ^8,9에 의해 만들어진 낮은 분자 - 중량 헤파린의 분수. 또한, 분석은 높은 동시 또는 순차적 방식으로 systemically 관리되는 에이전트의 angiogenesis에 결합 효과의 연구에 적합합니다.

그가 우리 연구실을 방문하여 설명하는 방법론을 목격 때이 비디오를 만드는 아이디어는 후반 박사 유다 Folkman에서 유래.

리뷰 논문 (초대) 토론과 분석을 평가

angiogenesis의 생체내 모델에 Norrby, K.. J. 셀. 몰. 메드. 10, 588-612 (2006).

Norrby, angiogenesis 모델 K. 약물 테스트. 전문가 Opin. 약물. Discov. 3, 533-549 (2008).

프로토콜

1. 동물

1. 이러한 쥐, 마우스, 그리고 기니 돼지와 같은 작은 설치류 동물은, 동물 모델로 사용되었습니다. 불행히도, 성인 마우스 (많은 마우스 변종이 평가되었습니다)는 신뢰할 수 쥐를 이용하여 연구를하게하는 그들의 mesenteric 창 내에서 잠재력 - 부모 microvessels만이 매우 낮은 숫자 (angiogenesis의 발원지 수있는)이 부족하거나 필요한 경우가 많다. 따라서 분석은 주로 쥐를 위해 개발되었습니다.
2. 개종에서 인도 다음과 같은 최소한 7 일 동안의 표준 환경을 acclimatized하는 쥐는, 일반적으로 물, 알약을 무료로 이용할 수있는 12 시간 어둠 / 빛이주기에 따라 표준 새장에 쌍 안에 보관되어있다. 각 동물이 표시됩니다. 다양한 브리 더스에서 얻은, 우리는 주로 젊은 성인 쥐 (세 5-6주 미만 쥐의 기본 microvessels의 숫자는 낮은 경향이 일반적으로 7-10 다양한 변종이 세 주지만, 일반적으로 남성 스프 라그 - 돌리 쥐)을 사용합니다. 이전 실험과 실험을하는 동안에 기간에서 동물은 매초마다 일 무게, 항상 희생 당일에 있습니다. 동물 동시에 IP 취급하는 경우 (angiogenesis의 유도를 위해, 아래 참조)과 SC 또는 IV 또는 PO, 그들은 매일 무게입니다. 이것은 실험의 시작 동등 체중의 실험 및 통제 집단의 설립을 가능하게하고, 실험 과정 중에 신체 - 체중 증가에 대한 치료의 영향의 모니터링을 허용합니다. 성인 남성이 쥐가 생리학적으로 견고하게 성장 이후 (변형의 종류에 따라 주당 약 40~60그램을 확보), 무게 이득 지체는 민감한 대체 웰빙 체계 독성의 마커, 거식증, 그리고 번창하고 실패합니다.

우리는 높은 수준 동물 보호 시설에서 업무와 상당한 노력이 동물에 의해 경험 스트레스의 수준을 최소화하기 위해 만들어집니다. 현재 윤리 지침은 워크맨 P. 외 설립들을 수 있습니다. (암 연구에 동물의 복지 및 사용에 대한 지침. 브랜치 도서관. J. 암 102, 1555년에서 1577년까지, 2010). 고튼버그 대학의 동물 윤리위원회는이 연구를 승인했습니다.

2. 프로 - angiogenic Intraperitoneal 치료

1. 테스트하는 후보 프로 angiogenic 요인이 해소 및 환자의 주입에 사용되는 내독소없는 호수에 희석된다 (도 매우 낮은 수준, 내독소는 프로 angiogenic입니다.) 모든 솔루션은, 주사 당일, 멸균 필터링 (Millipore 0.22 - μm의 여과)에 갓 만든 중성 PH (7.1-7.3)를 확인하고, 실온에서 사용됩니다.
   테스트 에이전트 낮거나 매우 낮은 농도로 주입됩니다. 예를 들어, 쥐의 rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, R & D 시스템 유럽, 회사, 옥슨, 영국) 지배 VEGF - A 쥐에 이소형이다, 냉동, 내독소없는 호수에서 96 pmole / ML로 희석합니다 그리고 해동 5 ML의 볼륨은 쥐를에 IP 주입니다. 우리는 IP 사출을위한 0.8 - mm 바늘 (녹색 바늘, 21G)과 5 - ML 주사기를 사용합니다. 월요일 아침 (주 0)부터 금요일 오전 (주 4) 4.5 일, 즉. 매일 두 번 주어진이 치료, 주변 일 21 peaking, mesenteric 테스트 조직에 강력한 돋아 angiogenesis 응답을 유도.
   솔루션 IP를 관리하면 전체 볼륨이 복막 캐비티 (아니라 창자, 방광이나 다른 장기로)로 전달됩니다 보장합니다. 5 ML의 급속한 주입은 액체 제트의 복강에 복벽 통과되었다는 운영자에 의해 촉각 확인하실 수 있습니다.
   다음, 이전의 IP 프로 angiogenic 치료 또는 동시에, 선택의 테스트 에이전트 systemically 시행하실 수 있습니다.

3. Angiogenesis - modulating 에이전트의 체계적 Administation

1. IP 치료 강한 프로 - angiogenic 반응을 초래할 수있는 테스트 조직에서 마스트 세포를 활성화하여 염증이나 가능성의 유도를 통해 지속 angiogenic 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 IP 경로 이외의 경로는 사용할 수 있습니다. 구두 관리 또는 단일 사출 SC 또는 IV 게다가, 우리는 종종 두 개 또는 몇 주 최대 일정한 속도로 솔루션을 제공합니다 (하나 이상의, 볼륨 변화와 시간을 양수 포함) 삼투 minipumps를 사용하여 SC 관리를 사용합니다.
2. 시험 요원의 지속적인 피하 주입
   삼투 minipumps의 필링 및 주입
   Alzet 삼투 펌프, 마운틴 뷰, CA, 보통 5 일, 즉, IP VEGF 처리, 삼투 minipumps (예를 들어, 모델 2ML2, 14-15일에 대한 5.0 μl / h의 일정한 펌핑 속도의 끝 이후에 하루에 미국)은 테스트 에이전트 또는 해당 차량과 무균 조건 하에서 채워지게된다. 37 무균 0.9 % (W / V) NaCl 하룻밤에 저장 후 ° C, 펌프 (들) 수술 (척추 colu의 측면에 실려 SC 이식 아르isoflurane 가스 (Isoba 수의사 사용 anesthetized되었습니다 쥐의 scapulae의 지역에서 MN); 밀폐 투명 챔버에서 초기 셔링 - 플로 동물 건강, 머크 & 주식 회사, 주식 회사, 화이트 하우스 스테이션, 뉴저지, 미국)와 후 마스크를 통해 (그것이 재사용되기 전에 다음과 같은 동물에 의한 스트레스를 최소화하기 위해, 의회는 공기와 플러시됩니다.) 펌프 주입을 위해 만든 피부 절개는 즉시 사후 주입 실크 스레드를 사용하여 봉합합니다.
   동물 실험 기간 동안 생리학 체중이 증가하고 테스트 에이전트가 일정한 속도로 관리되기 때문에, 체중의 kg 당 시험 약물에 대해 선택한 실제 복용량은 주입 기간의 시작 부분에 평균 복용량보다되며 낮은 주입 기간의 끝에 평균 복용량보다.
   여기에 설명된 연속 주입은, metronomic 치료의 확장된 형태로 볼 수 있습니다.

4. 실험 종료

1. 한 번에 한 동물은 급속하게 동물을 죽이고, CO ₂ 가스와 플러시하는 투명한 밀폐 챔버에 배치됩니다. 챔버 다시 사용되기 전에 공기와 플러시됩니다.

5. 수확 조직 샘플

1. DVD에 표시된 바와 같이, 복벽가 열립니다와 작은 창자 장간막이 ileo - cecal 밸브 (소장과 대장의 교차점)에 도달 가장 말초 부분을 포함하여 식별됩니다. 가장 distally있는 "창"의 네 (또는 이상) 번호와 객관적인 표준 치료 Superfrost 플러스 - 슬라이드 (DAKO 덴마크 A / S, Glostrup, 덴마크)에 전염됩니다. 이러한 자료가 아닌 구체적으로 물들일 수 있으므로이 microvessels의 후속 immunohistochemical 시각화를 무효화하지 않습니다하지만 그것은, 가능하면 혈액, 굿 내용이나 체액이 묻어있는 샘플을 오염, 방지하는 것이 중요합니다.
2. 연결된 작은 굿 세그먼트와 각 mesenteric 윈도우 표본은 슬라이드에 전파하고 20 분 실온에서 건조합니다. 그대로 막의 장간막의 표본은 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 저장하는 동안 다음, 창자 그루터기는 차단됩니다. 이것은 DVD에 표시됩니다.

이것은 조직과 특허 vasculature가 전송된 빛을 intravital 현미경과 수확하기 전에 시각 수 언급해야합니다.

6. Microvessels의 Immunohistochemical 스테 이닝을위한 프로토콜

1. 주 영
   표본은 1 시간 60 ° C에서 캐비닛에 건조 상온, -20 ° C에서 해동하도록 허용하고, 밤새 실온에서 보관됩니다.
2. 1 일
   얼룩 병 속에 슬라이드 홀더 (매초마다 트랙) 얼룩에 슬라이드를 삽입하고 실온에서 10 분 TBS (산도 7.8)로 두 번 씻는다. 솔루션은 폐기하고 다음 솔루션으로 교체하고, 그래서 다음과 같은 모든 단계에 있습니다.
3. 트립신 처리
   트립신 용액 (25 ° C 20 분)로 얼룩 슬라이드 홀더 항구됩니다 얼룩 용기를 채우십시오. 솔루션을 삭제하고 2.5 %의 자당 솔루션 (각 시간을 10 분 동안 실내 온도)와 두 번 품어. 솔루션을 삭제하고 아쿠아 dest 안에는 시간 (몇 분 각 실온)의 몇 린스.
4. 블로킹
   0.5 % 메탄올에서 H ₂ O ₂ (30 분 실내 온도)와 얼룩 슬라이드 홀더 항구됩니다 얼룩 용기를 채우십시오. 솔루션을 삭제하고 아쿠아 이명 령 (몇 분 동안 실내 온도)와 헹굼. 솔루션을 삭제하고 TBS (산도 7.4) (각 시간 팔분을위한 실내 온도)와 두 번 헹굼.
5. 잠복
   모든 incubations 실온에서 humidified 챔버에 있습니다. 아래의 솔루션을 각각의 약 150 μl은 슬라이드마다 사용됩니다. 슬라이드는 humidified 챔버에 배치되며 솔루션은 표본 (비 막의 부분은 솔루션이 적용 될 필요가 없습니다)에 pipetted 있습니다.
   이후 솔루션이 추가되기 전에 다음과 같이 각각에 대해 신중하게 솔루션을 모두 지워.
   1. 일반 (차단) 혈청 (호스) (ABC 키트) 3 부화는 노란색 솔루션 / 20 분 10 ML 희석 버퍼를 방울.
   2. 쥐의 혈관 내피 세포를 라벨 차 항체 ARU0181와 부화. 항체는 희석 버퍼 (Biosource) (100 μl 희석 40 배 [냉동] 플러스 900 μl 희석 버퍼)와 부화와 1:600​​ 희석는 4 박 이루어진다 ° C.
6. 날 2
   슬라이드가 humidified 챔버에서 제거됩니다, 기본 항체가 삭제되고 슬라이드는 얼룩 용기에 빠져들와 TBS와 함께 두 번 씻어서있는 얼룩 슬라이드 홀더에 배치됩니다팔분에 대한 (산도 7.8).
   1. biotinylated 항체와 배양 (ABC 키트)
      슬라이드는 humidified 챔버에 수평으로 배치 및 파랑 솔루션 / 30 분 10 ML 희석 버퍼 1 방울과 함께 incubated 있습니다. 솔루션을 삭제하고 얼룩 용기에 빠져들 얼룩 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입 8 분 TBS (산도 7.4)로 두 번 헹굼.
   2. ABC 시약과 인큐베이션
      슬라이드 다시 humidified 챔버에 수평으로 배치됩니다 다음과 같은 솔루션은 표본의 막의 부분에 pipetted 위치 : 오렌지 용액 2 방울 플러스 30 분 브라운 솔루션 / 10 ML TBS (산도 7.4) 2 방울. 삼십분 사용하기 전에 신중하게 믹스! 솔루션을 삭제하고 얼룩 용기에 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입 8 분 TBS (산도 7.4)로 두 번 헹굼.
7. DAB로 얼룩 (0.05 %)
   이 단계는 통풍이 화학 후드에서 수행되어야합니다!
   슬라이드를 삽입하고 3,3 - diaminobenzidine (DAB, 시그마 - 알드리치) 추가 피펫을 사용하여 솔루션 : TBS에서 0.1 %의 DAB 솔루션 (산도 7.4) [냉동] 10 μl H ₂ O의 혼합물로 1시 1분를 희석합니다 ₂ 7.5 ML TBS (산도 7.4). 이 솔루션은 단지 사용 (미세 사진을 가리 수있는 입자를 제거하기 위해)하기 전에 무균 - 필터링합니다. 팔분에 대한 표본 얼룩. 솔루션을 삭제하고 얼룩 용기에 빠져들 얼룩 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓으십시오. 몇 분 동안 아쿠아 dest 안에는 다음 수돗물을 실행하고 아래 린스.
8. 탈수
   슬라이드는 얼룩 슬라이드 홀더에 보관됩니다. 폐기로 씻어 아쿠아 이명 령 / 에탄올을 포함하고있는 얼룩 병 충진 : 각 솔루션에 이분과 함께, 아쿠아 이명 령, 70 % 알코올, 95 % 알코올, 절대 알코올.

7. 혈관 내피 세포의 스테 이닝 Immunohistochemical 후 이미징 및 각 Mesenteric 창 표본에서 Microvascular 네트워크를 평가

으로 영화에 나타난 microvessels는 미세 손상 조직의 현장에서 시각입니다.

1. 첫째, 우리는 흰 종이에 연필 14에서 34 (와일드 Leica M 3Z)에 배율 범위 전체 창 지역뿐만 아니라, mesenteric 창 당 전체 vascularized 지역 (VA)을 그림 현미경을 사용합니다. VA는 전체 면적의 백분율로 쉽게 컴퓨터 또는 비 전산 planimetry (또는 단순히 전체 윈도우의 이미지 및 모든 vascularized 부품의 이미지를 밖으로 절단 및 가중치에 의해)을 사용하여 측정됩니다.
2. 를 사용하여 쉽게 확인할 수 있습니다 또 다른 그림 현미경, 개별 microvessel의 프로필, 무작위로 선택된 분야 내에서 80 배율에서 하얀 종이 위에 검은 잉크로 그려져있다. 이것은 기본적 microvascular 밀도의 측정이다 microvascular 길이의 후속 컴퓨터 morphometric 평가 (MVL)에 대한 출발점이 될 것입니다.
3. 선택, microvascular 패턴 형성에 관련된 변수뿐만 아니라 개인 microvascular 콩나물 (제 SP와 르. SP, 각각)의 microvascular 콩나물과 길이의 숫자의 평가에 대한 것과 같은이 결정하실 수 있습니다. 묘사된 검은 선박 구조와 흰 배경 대부분의 상용 morphometric 컴퓨터 프로그램의 이미지에 대한 자세한 분석을 용이 사이 최적의 명암.
4. 대부분의 경우, 주요 변수가 함께 곱한 때 총 microvascular 길이 (TMVL)를 생성 VA과 MVL입니다.

8. 통계 분석

우리는 일반적으로 unpaired (2 꼬리) 관찰 분석하는 표준이 아닌 파라메 트릭 만 - 휘트니 U - 테스트를 사용합니다. 동물 당 4 개의 mesenteric Windows의 의미는 mesenteric 윈도우의 각 변수의 데이터 포인트 독립으로 사용됩니다. 통계적 중요성에 대한 기준은 P가 ≤ 0.05입니다.

토론

분석은 1986 ³ 도입되었으며 연속 더욱 개발하고 우리 연구실 ^{7,10-12에서} 세련되었습니다. 으로 검토 서류 (초대) ^{1, 2에서} 논의, 분석, 특히 같은 성인 테스트 조직과 같은 중요한 기능에 관해서는 생체내의 angiogenesis 분석의 다른 포유 동물과 잘 비교 기본적으로 vascularized하고 physiologic angiogenesis 부족, 최소한의 외상있는 경우입니다 조직에 쏜, 진정으로 양적 변수는 측정, 투약 - 반응과 분자 - 활동 연구에 관한 소리가 통계 분석을 허용하는, 돋아 angiogenesis는 정상 조직과 종양에 predominating되는 발생 및 독성 데이터는 쉽게 견고하게 성장 쥐에 축적 아르 생리학 성인 인치 이 생쥐에 대한 거의 적합 것을하고, 그것이 real-time/serial 관찰을 허용하지 않는, 불리한 기능은 개별 microvessel 세그먼트와 microvessel 콩나물의 수와 길이를 평가 특히 분석은 비교적 시간이 많이 걸리는있다는 사실을 포함할 수 생쥐 많은 mesenteric Windows가 잠재적인 부모 microvessels 부족 이후 새로운 모세 혈관이 발생한 수있는.

실시간 관찰은, 그러나 동물로 ¹ anesthetized 논의 중에 exteriorized지만 그대로 mesenteric Windows가 현미경 단계에 걸쳐 splayed 아르 intravital 현미경으로 활성화되어 있습니다.

angiogenesis 연구에 큰 진보는 그러한 유용하지만, 궁극적으로 제한 도구 각막 micropocket, 병아리, chorioallantoic 막, 그리고 SC Matrigel 플러그 assays, 같은 모델을 사용하여 과거 수십 년간에 달성되었습니다. 안티 angiogenic 및 프로 angiogenic 요법의 미래 임상 응용 프로그램은 설치와 같은 현재의 보고서에서 설명한 것과 같이 더 민감하고 생물학 관련, 정말 양적 사전 임상 모델의 유효성 검사를 할거에요.

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