Rat mezenter Anjiyogenez Testi

Özet

Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Özet

Yetişkin sıçan mezenter pencere anjiyogenez tahlil biyolojik uygun ve son derece iyi, in vivo anjiyogenez çimlenme çalışma için uygundur, insan tümörleri ve tümör olmayan dokular anjiyogenez hakim formu davet incelemesi tartışılan [Derlemeler bakın. ] kağıtlar ^1,2. Membranöz mezenterik parça bir pro-anjiyo faktör intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile indüklenen Anjiyogenez subkutan (sc), intravenöz (iv) veya oral (po) tercih modifiye edici ajanlar ile tedavi modüle olabilir. Mezenter Her membranöz kısmında bir pencere gibi bir görünüm veren, saydam ve yağ dokusu tarafından çerçeveli.

Tahlil aşağıdaki avantajlı özelliklere sahiptir: (i) test doku seyrek olsa da, doğal olarak vaskülarize, ve son derece ince bir yana, mikrovasküler ağ, tüm ağ in situ mikroskobik olarak değerlendirilmesi gereken izin veren, neredeyse iki boyutlu ( ii) yetişkin sıçanlarda test dokusunun en normal erişkin memeli dokularında görülen önemli fizyolojik anjiyogenez yoksun; yerli vaskülarizasyon derecesine, ancak, ¹ de açıklandığı gibi yaş ile ilişkilidir; travma bağlı anjiyogenez (iii) ihmal edilebilir düzeyde (v) yüksek hassasiyet sağlar; anjiyogenez modülasyon test ilaçlar sistemik olarak uygulanan ve yanıtları metabolik,, hücresel ve moleküler değişiklikler tedavi ile indüklenen net etkisi yansıtacak gözlenir (iv) testinin, klinik durum çoğaltır;. böylece doz-etki ve moleküler yapı-aktivite ilişkileri sağlam istatistiksel analizler sağlayarak, testin yanı sıra çimlenme kapiller mikrovasküler mekansal uzantısı, yoğunluk ve ağ model oluşumu objektif, kantitatif, tarafsız değişkenleri değerlendirmelerini sağlar; ve (vi yetişkin sıçanlarda sağlam büyüdükçe) tahlil, fizyolojik vücut ağırlık artışı azalma oranı bakımından yüksek hassasiyet ile tedavilerin toksik veya zararlı etkileri ortaya koymaktadır.

Bu testte ^3,4 kullanarak mast hücre-aracılı anjiyogenez ilk gösterilmiştir. Modeli, doz-etki ilişkileri ve dahil olmak üzere sistemik kimyasal veya fonksiyonel olarak uygulanan yakından ilgili ilaçlar ve proteinler, ölçülen etkileri ile ilgili yüksek düzeyde bir ayrımcılık göstermektedir: (i) metronomically, farklı, ilaç özel efektler verimi standart kemoterapötikler uygulanan düşük doz, (yani, anjiyogenez baskılayıcı, nötr veya anjiyogenez-uyarıcı etkinlikler ^5), (ii) inhibe VEGF-A-aracılı anjiyogenez ⁶ uyarır doğal demir-doymamış insan laktoferrin, ve doğal demir-doymamış sığır laktoferrin, VEGF-A- aracılı anjiyogenez ^7, ve (iii), çeşitli ^yollarla 8,9 tarafından üretilen düşük molekül ağırlıklı heparin kesirler . Ayrıca, testin son derece eşzamanlı veya ardışık moda sistemik ajanlar anjiyogenez üzerinde kombine etkileri çalışmaları için uygundur.

Bu video yapma fikri o bizim laboratuvar ziyaret etti ve gösterilen metodoloji tanık merhum Dr. Yahuda Folkman kökenli.

İnceleme kağıtları (davet edildi) tahlil tartışılması ve değerlendirilmesi

Anjiyogenez in vivo modellerde Norrby, K.. J. Hücre. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, anjiyogenez modelleri ile K. Uyuşturucu testi. Uzman Opin. İlaç. Discov. 3, 533-549 (2008).

Protokol

1. Hayvanlar

1. Gibi, fare, sıçan, ve kobaylar gibi küçük kemirgenler, hayvan modellerinde olarak kullanılmaktadır. Ne yazık ki, yetişkin farelerde (birçok fare suşlarının değerlendirilmiştir) güvenilmez fareler kullanılarak çalışmalar yapar, kendi mezenterik pencereleri içinde potansiyel ebeveynli mikrodamarlar sadece çok düşük bir sayı (anjiyogenez köken aldığı) eksikliği ya da sahip olmak eğilimindedir. Bu nedenle tahlil öncelikle sıçanlar için geliştirilmiştir.
2. Sıçanlar, damızlık teslim edildikten sonra en az 7 gün boyunca standart bir ortama alışmanız genelde su ve pelet ücretsiz erişim ile 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında standart bir kafes çiftleri yerleştirilmiştir. Her hayvan işaretlenir. Çeşitli yetiştiriciler elde edilen; Biz çoğunlukla genç erişkin sıçan (yaş 5-6 hafta daha genç sıçanlarda yerli mikrodamarlar sayısının düşük olma eğilimi çeşitli suşları yaşı genellikle 7-10 hafta ancak genellikle erkek Sprague-Dawley rat). Önce deney ve deney boyunca dönemde, hayvanların her ikinci gün tartılır ve her zaman fedakarlık günü. Hayvanlar, eş zamanlı olarak ip tedavi edildiğinde (anjiyogenez indüksiyonu için aşağıya bakınız) ve sc veya iv veya po, onlar her gün tartılır. Bu deney başlangıcında eşit vücut ağırlığının deney ve kontrol grupları kurulmasını sağlar ve deney sırasında vücut ağırlığı-kazanç tedavi etkisinin izlenmesine olanak sağlar. Erişkin erkek sıçanlarda fizyolojik güçlü bir büyümeye (gerilme tipine bağlı olarak haftada yaklaşık 40-60 g kazanıyor), kilo alımı geriliği hassas bir yerine refahı sistemik toksisite işaretleyici, iştahsızlık, gelişme geriliği.

Biz, yüksek standart bir hayvan bakım tesisi çalışma ve önemli çabalar, hayvanların yaşadığı stres düzeyini en aza indirmek için yapılır. Geçerli etik kurallar Workman P. ve arkadaşları tarafından kurulmuş olan (kanser araştırma hayvanların refah ve kullanımı için rehber. Br. J. Kanser 102, 1555-1577, 2010). Göteborg Üniversitesi Hayvan Etik Kurul, bu çalışmalar onayladı.

2. Pro-anjiyogenik İntraperitoneal Tedavi

1. Test edilecek aday pro-anjiyo-faktör çözülür ve hastaların infüzyon için kullanılan endotoksin içermeyen tuzlu su içinde seyreltilmesi (son derece düşük seviyelerde bile, endotoksin pro-anjiyogenik). Tüm çözümler, enjeksiyon gününde, steril filtrelenmiş (Millipore 0.22 mikron filtrasyon) taze yapılmış, nötr pH (7,1-7,3) kontrol ve oda sıcaklığında kullanılır.
   Test aracı, düşük ya da çok düşük konsantrasyonlarda enjekte edilir. Örneğin, sıçan rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, Ar-Ge Systems Europe Ltd, Oxon, Birleşik Krallık) baskın VEGF-A sıçanlarda izoformu, dondurulmuş, endotoksin ücretsiz salin 96 pmole / ml seyreltilir çözülmüş ve sıçan 5 ml'lik bir hacim içine ip enjekte edilir. Biz ip enjeksiyon için 0.8 mm iğne ile (yeşil iğne, 21G) 5 ml şırınga kullanın. Pazartesi sabahı (Gün 0) Cuma sabahı (4. Gün) 4.5 gün, yani günde iki kez verilen bu tedavi, etrafında Gün 21 pik, mezenterik testi dokusu sağlam bir çimlenme anjiyogenez tepki neden olur.
   Çözüm ip yönetme tüm hacim periton boşluğuna (ve bağırsak, mesane ya da diğer herhangi bir organı içine) teslim olmasını sağlar. 5 ml, sıvı jet karın boşluğuna karın duvarı üzerinden geçtiğini operatör tarafından hızlı enjeksiyon dokunsal onay sağlar.
   Takiben, önce ip pro-anjiyogenik tedavi ile ya da eş zamanlı olarak, herhangi bir test aracı seçim sistemik uygulanan olabilir.

3. Sistemik administation Anjiyogenez modülasyon Ajanlar

1. Ip tedavisi devam eden güçlü bir pro-anjiyo-yanıt yol açabilir test doku mast hücreleri aktive ederek inflamasyon veya muhtemelen indüksiyon yoluyla anjiyogenik tepki etkileyebilir ip rota dışında herhangi bir rota kullanılabilir. Oral yoldan ya da tek bir enjeksiyon sc veya iv yanı sıra, sık sık, iki ya da birkaç hafta kadar sabit bir hızda çözüm sunmak için (bir veya daha fazla, hacimleri ve pompalama kez değişen) osmotik minipumps kullanarak sc uygulama.
2. Sürekli subkutan infüzyon test ajanların
   Osmotik minipumps Dolum ve implantasyon
   Alzet Osmotik Pompalar, Mountain View, CA; Genellikle 5. Gün, yani ip VEGF tedavisi, ozmotik minipumps (örneğin, Model 2ML2, 14-15 gün süreyle 5.0 ul / h sabit pompalama hızı ile sona erdikten sonra bir gün , ABD) steril koşullar altında test aracı ya da uygun bir araç ile doldurulur. ° C, pompa (lar) 37 steril% 0.9 (w / v) NaCl gecede depolama sonra cerrahi (spinal colu kenarındaki sırtında sc implante.mn) isofluran gaz (Isoba veteriner kullanarak anestezi edilmiş sıçanlarda scapulaların bölgede, hava geçirmez bir şeffaf odasında başlangıçta, Schering-Plough Hayvan Sağlığı, Merck & Co, Inc, Whitehouse Station, NJ, ABD) ve bir maske ile (daha sonra yeniden kullanılmadan önce aşağıdaki hayvana kaynaklanan stresi en aza indirmek için, oda hava ile temizlendi). Implantasyon sonrası hemen ipek iplik kullanarak pompa implantasyonu için yapılan cilt insizyonu sütüre edilir.
   Deney süresince hayvanların fizyolojik kilo ve test ajanlar sabit bir hızla uygulandığında bu yana, kg vücut ağırlığı başına bir test ilaç için seçilen gerçek doz infüzyon döneminin başında ortalama doz daha yüksek ve daha düşük infüzyon süresi sonunda ortalama doz daha.
   Sürekli infüzyon, burada açıklandığı gibi, uzun bir metronom tedavi biçimi olarak görülebilir.

4. Deney sona erdirme

1. Bir kerede bir hayvan, hayvan hızla öldürür _{CO 2} gaz ile temizlendi şeffaf bir hava geçirmez odası, yerleştirilir . Odasına tekrar kullanılabilir edilmeden önce hava ile temizlendi.

5. Hasat Doku Örnekleri

1. DVD 'de gösterildiği gibi, karın duvarı açılır ve bağırsak çekal valfi (ince bağırsak ve kalın bağırsağın birleştiği) ulaştığı en distal bölümü de dahil olmak üzere, küçük bağırsak mezenter tanımlanır. En distalde yer alan "windows" dört (veya daha fazla) sayılı ve objektif standart tedavi edilmezse SuperFrost Plus-slayt (DAKO Danimarka A / S, Glostrup, Danimarka) üzerine yayılır. Non-spesifik olarak bu malzemelerin lekeli olabilir mikrodamarlar sonraki immünohistokimyasal görselleştirme geçersiz olmamakla birlikte, mümkünse kan, bağırsak içeriği veya diğer vücut sıvıları ile numunelerin kirlenmesine neden olan, önlemek için önemlidir.
2. Bağlı küçük bir bağırsak segmenti Her mezenterik pencere örnek bir slayt üzerine yayılmış ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulur. Ardından, bağırsak güdük, bozulmadan membranöz mezenter örnekleri uzun süre için -20 ° C'de saklanır, kapalı kesilir. Bu DVD gösterilmiştir.

Bu doku ve patent damarsal iletilen ışık intravital mikroskobu ile hasat öncesi görülebilmesi belirtilmelidir.

6. Mikrodamarlar İmmünohistokimyasal Boyama Protokolü

1. Gün 0
   Numuneler -20 ° C oda sıcaklığında, 1 saat için 60 ° C'de bir kabin kurutulur Çözülme izin ve gece boyunca oda sıcaklığında tutulur.
2. 1. Gün
   Slaytları slayt sahipleri (her saniye bir parça) boyama boyama kavanoza yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika TBS (pH 7.8) ile iki kez yıkayın. Çözüm atılır ve sonraki çözümü ile değiştirilir ve bu nedenle aşağıdaki adımları için.
3. Tripsin tedavisi
   Tripsin çözüm (25 ° C'de 20 dakika) ile boyama slayt sahibi olacak Limana boyama kavanoza doldurun. Çözüm atın ve% 2.5 sakkaroz solüsyonu (her seferinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığı) ile iki kez kuluçkaya yatmaktadır. Çözüm atın ve su dest kez bir çift (bir kaç dakika her biri için oda sıcaklığında) durulayın.
4. Engelleme
   % 0.5 H ₂ O ₂ metanol (30 dakika boyunca oda sıcaklığı) ile boyama slayt sahibi olacak Limana boyama kavanoza doldurun. Çözüm atın ve su dest (bir kaç dakika oda sıcaklığında) ile durulayın. Çözüm atın ve TBS (pH 7.4) (her defasında 8 dakika boyunca oda sıcaklığında) ile iki kez yıkayın.
5. Kuluçka
   Tüm inkübasyonlar oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odasında. Aşağıda listelenen çözümleri her biri yaklaşık 150 ul slayt başına kullanılır. Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında yerleştirilir ve çözümleri örnekleri (non-membranöz parça çözümler ile kaplı olması gerekmez) üzerine pipetlenir.
   Sonraki çözüm eklenmeden önce her biri için aşağıdaki adımları dikkatli bir şekilde çözüm silkeleyin.
   1. Normal (engelleme) serum (at) (ABC kiti) 3 Kuluçka sarı çözüm / 20 dakika için 10 ml seyreltme tamponu düşer.
   2. Kuluçka sıçan damar endotel hücreleri etiketler İlköğretim antikor ARU0181. Antikor seyreltme tamponu (Biosource) (100 ul seyreltilmiş 40 kat [dondurulmuş] artı 900 ul seyreltme tamponu) ve inkübasyon 1:600 ​​seyreltilir 4 geceleme gerçekleşir ° C
6. 2. Gün
   Slaytlar nemlendirilmiş odasından çıkarılır, birincil antikor atılır ve slaytlar bir boyama slayt tutucu, boyama kavanoza batık ve TBS ile iki kez yıkanır konur8 dakika (pH 7.8).
   1. Biotinlenmiş antikor ile inkübasyon (ABC kiti)
      Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında yatay olarak yerleştirilmiş ve 1 damla mavi çözüm / 30 dakika için 10 ml seyreltme tamponu ile inkübe edilir . Çözüm atın ve boyama kavanoz içinde batık bir boyama slayt sahibi slaytlar ve 8 dakika TBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
   2. ABC reaktifi ile inkübasyonu
      Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında tekrar yatay olarak yerleştirilmiş ve aşağıdaki çözümleri örneklerinin membran parçalarının üzerine pipetlenir: 2 damla artı 30 dakika kahverengi çözüm / 10 ml TBS (pH 7.4) 2 damla portakal çözüm. 30 dakika kullanmadan önce dikkatlice karıştırın! Çözüm atın ve boyama kavanoz slaytlar slayt tutucu ve 8 dakika TBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
7. DAB (% 0.05) ile boyanarak
   Bu adım havalandırılan bir kimyasal kaput yapılmalıdır!
   Slaytları yerleştirin ve 3,3 diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich) ekleyebilirsiniz pipet kullanarak çözüm: TBS içinde% 0.1 DAB solüsyonu (pH 7.4) [dondurulmuş] 10 ul H ₂ O karışımı ile 1:1 seyreltilir ₂ ve 7.5 ml TBS (pH 7.4). Bu çözüm, (herhangi bir parçacık mikroskobik resmi gizleyebilir ortadan kaldırmak için) hemen önce steril filtre edilir. 8 dakika örneklerdir Leke. Çözüm atın ve boyama kavanoza batık boyama slayt sahibinin slaytlar. Birkaç dakika sonra su dest çalışan ve musluk suyu altında durulayın.
8. Kurutma
   Slaytları boyama slayt sahibi tutulur. Atarak yıkayın ve dolum su dest / etanol içeren boyama kavanoz: 2 dakika her çözüm, su dest,% 70 alkol,% 95 alkol, mutlak alkol.

7. Vasküler Endotelyal Hücre İmmünohistokimyasal Boyama sonra Görüntüleme ve Her Mezenterik Pencere Numune Mikrovasküler Ağ Değerlendirilmesi

Filmde gösterildiği gibi, mikrodamarlar sağlam doku in situ mikroskobik görselleştirildiği .

1. Öncelikle, biz beyaz kağıt kalem büyütme aralığı 14 ila 34 (Leica Vahşi M 3Z) ile tüm pencere alanı, mezenterik pencere başına tüm vaskülarize alanı (VA) yanı sıra bir çizim mikroskobu kullanın. VA, tüm bölgenin bir yüzdesi olarak, kolay bilgisayarlı veya non-bilgisayarlı planimetri (ya da sadece tüm pencere resim ve görüntüleri tüm vaskülarize parça kesme ve ağırlık) ile ölçülür.
2. Kullanarak kolayca tespit başka bir çizim mikroskobu, bireysel mikrodamar profilleri, rastgele seçilen alanlar içinde 80 büyütme beyaz kağıt üzerine siyah mürekkeple çizilir. Bu temelde mikrovasküler yoğunluk ölçümü mikrovasküler uzunluğu sonraki bilgisayarlı morfometrik değerlendirmesi (MVL), başlangıç ​​noktasıdır.
3. İsteğe bağlı olarak, mikrovasküler desen oluşumu ile ilgili değişkenlerin yanı sıra, bireysel mikrovasküler lahanası (No SP ve Le SP, sırasıyla) mikrovasküler lahanası ve uzunluk sayısı değerlendirme için bu tespit edilebilir . Tasvir siyah damar yapıları ve beyaz arka plan, en ticari morfometrik bilgisayar programları, görüntülerin detaylı analizi kolaylaştırır arasında optimum kontrast.
4. Çoğu durumda, en önemli değişkenler birlikte çarpılır, toplam mikrovasküler uzunluğu (TMVL) oluşturmak VA ve MVL .

8. İstatistiksel Analiz

Biz genellikle eşleştirilmemiş (iki uçlu) gözlemleri analiz etmek için standart non-parametrik Mann-Whitney U testi kullanın. Ortalama hayvan başına dört mezenterik pencereleri mezenterik penceresinin her değişken için bağımsız olarak veri noktası kullanılır. Kriter istatistiksel anlamlılık için p ≤ 0.05.

Tartışmalar

Tahlil 1986 ³ yılında ortaya çıkmıştır ve gittikçe daha da geliştirildi ve laboratuvarımızda ^7,10-12 rafine olmuştur. Derlemeler (davet edildi) ^{1, 2} tartışıldığı, tahlil, özellikle yetişkin testi doku gibi önemli özellikleri bakımından diğer memeli in vivo anjiyogenez tayininde iyi karşılaştırır, doğal vaskülarize ve fizyolojik anjiyogenez yoksun; minimal travma, eğer varsa, verdirdiler doku üzerine gerçekten kantitatif değişkenler ölçülür, doz-yanıt ve moleküler-aktivite çalışmaları ile ilgili ses istatistiksel analiz sağlar; çimlenme anjiyogenez, normal dokularda ve tümörlerde hakim olduğu ortaya çıkar ve toksisite verileri kolayca sağlam büyümek sıçanlarda biriken fizyolojik yetişkinlik. Fareler için pek uygun olduğunu; real-time/serial gözlemler izin vermez; Dezavantajlı özellikleri, özellikle bireysel mikrodamar segment ve mikrovasküler lahanası sayısı ve uzunluğu değerlendirilmesi, tahlil, nispeten zaman alıcı olduğunu gerçeği içerebilir farelerde çok sayıda mezenterik pencereler potansiyel ebeveyn mikrodamarlar eksikliği bu yana yeni kılcal damarların kaynaklı olabilir.

Ancak, gerçek zamanlı gözlemler, hayvan, ¹ tartışılan anestezi ise exteriorized ama sağlam mezenterik pencereler mikroskop aşamasında üzerinden dışarı yayvan intravital mikroskobu ile etkindir.

Anjiyogenez araştırma faydalı ama sonuçta sınırlı araçlar kornea micropocket, civciv chorioallantoic membran ve sc Matrigel fiş testleri gibi modelleri kullanarak, geçmiş yıllarda önemli gelişmeler elde edilmiştir. Antianjiyojenik ve pro-anjiyogenik tedavilerin gelecekte klinik uygulamalarda raporda açıklanan biri olarak daha duyarlı ve biyolojik ilgili, gerçekten kantitatif klinik öncesi modelleri, kurulması ve doğrulanması zorunlu kılmaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Katalog #	ARU0181
Klon #	MRC OX-43