פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

Summary

פלטפורמה עצמים ללא עדשה מיקרוסקופ על שבב ניאון הוא הוכיח כי אובייקטים בתמונה ניאון מעל אולטרה רחב בתחום לצפות-של של למשל יכול,> 0.6-8 CM2 עם רזולוציה 4μm <באמצעות דגימה דחיסה מבוסס אלגוריתם פענוח. כאלה לערוץ קומפקטי רחב בתחום ניאון על שבב הדמיה יכול להיות בעל ערך עבור cytometry תפוקה גבוהה, נדיר תאים מחקר microarray ניתוח.

Abstract

על שבב הדמיה עצמים ללא עדשה בכלל שואפת להחליף עדשה מגושם מבוססי מיקרוסקופים אופטיים עם עיצובים קומפקטית פשוטה יותר, במיוחד עבור תפוקה גבוהה יישומים ההקרנה. זו פלטפורמה טכנולוגית המתעוררים יש פוטנציאל לבטל את הצורך רכיבים אופטיים מגושם ו / או יקר בסיועו של תיאוריות רומן ואלגוריתמים שחזור דיגיטלי. לאורך אותם קווים, כאן אנחנו מדגימים מודליות על שבב במיקרוסקופ פלואורסצנטי שניתן להשיג למשל, <4μm ברזולוציה מרחבית על אולטרה רחב בתחום של נוף (FOV) של> 0.6-8 ס"מ ² ללא שימוש בעדשות כל , מכני או סריקת סרט דק מסננים הפרעות מבוסס. בטכניקה זו, עירור פלורסנט מושגת באמצעות ממשק פריזמה או חצי כדור זכוכית מואר על ידי מקור מבולבל. לאחר אינטראקציה עם נפח את האובייקט כולו, לאור זאת נדחית על ידי עירור השתקפות מוחלטת, פנימית (TIR) ​​תהליך זה מתרחש בחלק התחתון של השבב מדגם מיקרו fluidic. פליטת פלורסנט מן האובייקטים נרגש נאסף מכן על ידי לוחית סיבים אופטיים או להתחדד והוא מועבר מערך חיישן אופטו כגון מכשיר תשלום מצמידים (CCD). באמצעות דגימה דחיסה מבוסס אלגוריתם פענוח, רכשה את התמונות lensfree פלורסנט הגלם של המדגם יכול להיות מעובד במהירות כדי להניב למשל, <4μm ברזולוציה מעל FOV של> 0.6-8 ס"מ ^2. יתר על כן, מוערמים אנכית ערוצים מיקרו כי מופרדות למשל, 5-10 מיקרומטר יכול להיות גם צילמו בהצלחה באמצעות lensfree אותו על שבב פלטפורמת מיקרוסקופית, אשר מגביר את התפוקה הכוללת של שיטת זו. זו פלטפורמה קומפקטית על שבב דימות פלואורסצנטי, עם מפענח דחיסה מהירה מאחורי זה, יכול להיות יקר למדי cytometry תפוקה גבוהה, נדיר תאים מחקר microarray ניתוח.

Protocol

בחלק זה נסקור את שיטות ניסיוניות של פלטפורמת עצמים ללא עדשה על השבב שלנו במיקרוסקופ פלואורסצנטי ^1-4. כדי להדגים את היכולות של טכניקה זו, אנו נראה על שבב תוצאות ההדמיה עבור מיקרו חלקיקים פלורסנט שכותרתו כדוריות הדם הלבנות. אמנם לא דנו כאן, פלטפורמת מיקרוסקופיה אותו lensfree פלורסנט יכול לשמש גם תמונה קטנה חיות מודל כגון מהונדס ג elegans דגימות ^3.

1. עיצוב של פלטפורמת On-Chip עצמים ללא עדשה הדמיה

על שבב פלטפורמת עצמים ללא עדשה שלנו הדמיה כוללת מספר רכיבים אופטיים כולל מערך חיישן דיגיטלי (למשל, שבב ה-CCD), מקור תאורה מבולבל, מנסרה, מסנן הקליטה, לוחית סיבים אופטיים או להתחדד סיבים אופטיים. כפי שמוצג תמונה 1, רכיבים אלה מורכבים עם מיקרו fluidic התקנים כדי להשיג הדמיה הניאון של נפח דגימה גדול על שבב, ללא שימוש של עדשות, סורקים מכני או סרט דק מסננים הפרעות מבוסס.

1. חיישן מערך דיגיטלי: תצורה הדמיה עצמים ללא עדשה שלנו מנצל מערך חיישן אופטו כדי להקליט את פליטת פלורסנט מהיעד מיקרו אובייקטים. במצע זה, לגילוי של האות הקרינה, סוגים שונים של חיישן מערכים ניתן להשתמש, כגון CCDs (למשל, מודלים: כף-8300, KAI-11002, 39000, כף, כולם מן KODAK) משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה, הדמיה (CMOS, למשל, דגם: MT9T031C12STCD, מ Micron Technologies). הפרמטרים העיקריים של הריבית עבור חיישן מערכים אלה כוללים את גודל פיקסל (למשל, 5.4 מיקרומטר, 9 מיקרומטר, 6.8 מיקרומטר ו 3.2 מיקרומטר עבור כף-8300, קאי 11,002, 39,000 ו-כף MT9T031C12STCD, בהתאמה) ואזור הדמיה פעילה ( למשל, 2.4 ס"מ ^2, 8 ס"מ, ^2, 18 ס"מ ² ו 32 מ"מ ² עבור כף-8300, קאי 11,002, 39,000 ו-כף MT9T031C12STCD, בהתאמה). עבור lensfree על שבב הדמיה, חיישני CCD יכול בכלל להיות מועדף על מנת להשיג תפוקה גבוהה יותר (אזור פעיל יותר) ורגישות יותר, בעוד חיישני CMOS ניתן המועדפת עיצובים משקל קל יחסית זול (למשל, לשימוש בשדה).
2. מקורות אור: ב הפלטפורמה שלנו, מקור האור מבולבל, למשל, פשוט דיודה פולטת אור (LED, למשל, מן Thorlabs, M455L2-C2 ו LEDD1B), יכול לשמש עירור פלואורסצנטי. בשנת הניסוי הגדרת באיור. 1, רב מצב כבל סיבים אופטיים (Thorlabs, BFH37-1000) עם גודל הליבה 1 מ"מ בתחת מצמידים למקור LED (ללא שימוש או עדשות אופטיקה צימוד) והאור עירור מועבר לאחר מכן מדגם נפח דרך פתח היציאה של סיבים זה. במערכת זו, את רמת הכוח הנדרש עירור פלואורסצנטי צריך להיות סביב mW 0.2-5 ~ עבור FOV של 2-8 ס"מ> ² ביציאה של סיבים תאורה, אולם, נוריות צריך להיות מסוגל פלט ~ 5mW-1W רמות הספק כגישה התחת צימוד הוא lossy ניכרת אשר מקטין את כוח עירור במוצא של הסיב. כדי להשיג עירור של צבעים שונים, נוריות בצבע אחר יכול להיות גם multiplexed באמצעות מצמד סיבים אופטיים.
   בנוסף הדמיה על שבב ניאון, lensfree תמונות הולוגרפיות שידור המדגם אותו ניתן להשיג עם פלטפורמה זו על ידי ניצול מקור תאורה אנכי כמוצג באיור. 2. בניגוד סיבים עירור פלואורסצנטי, לרכישת תמונה הולוגרפית, כבל סיבים אופטיים שונים עם גודל הליבה קטנה יותר (למשל, ~ 5-40 מיקרומטר) הוא בדל מצמידים מקור אחר LED (Mightex, FCS-0625-000). זה אור הארה אנכית, לאחר היציאה סיבים סוף, מתחיל לרכוש קוהרנטיות מרחבית חלקית כפי שהיא מתפשטת לכיוון המדגם. הקוטר של האזור הזה קוהרנטית מרחבית הוא יחסי המרחק שהאור עובר ואת עומדת ביחס הפוך לגודל הצמצם יציאה של סיבים. כל עוד זה בקוטר קוהרנטיות מרחבית על המטוס מדגם גדול יותר מגודל עקיפה של המדגם על כל מטוס החיישן, האור מפוזר מאובייקט אחד יכול בנאמנות להפריע האור ברקע, יצירת lensfree in-line הולוגרמה של המדגם. אלה הולוגרמות lensfree רכשה אז יכול להיות מעובד במהירות באמצעות איטרטיבי התאוששות גישות שלב לשחזר בהיר שדה שידור תמונה של נפח מדגם ^5-7. לשם כך תאורה הולוגרפית, אורך גל ארוך יותר LED (כלומר, ~ 625-700 ננומטר) נבחרה מאז מסנני קליטה המשמשות כדי לחסום את האור הם עירור גבוהה לעבור מסננים עם חתך אורכי גל האופייניים למשל, 500-600nm , המאפשרת רכישה של שידור ב-line הולוגרמות של דגימות ללא בעיה.
3. רכיבים אופטיים אחרים: במצע על שבב זה מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שתי שיטות עירור שונה סינון משמשים במקביל כדי ליצור את הרקע הדרוש כהה בשדה כפי שמוצג Fig.2. ראשית, פריזמה זכוכית (למשל, אדמונדאופטיקה, מעוין או מנסרות יונה), או כוס חמי כדור משמש ליצירת מסך פנימית השתקפות (לאור עירור) על פני השטח התחתון של שבב מיקרו fluidic אשר מארח את דגימות של עניין. במקביל לכך, מסנן קליטה זול (למשל, מ Roscolux) משמש להסיר את אור עירור מפוזרים חלושות שלא לציית תהליך טיר. לאחר דחייה מוצלח של עירור באמצעות שני מנגנונים אלה, רק פליטת ניאון של הדגימות נרכש המטוס גלאי. שים לב כאן כי חלק מסוים של האות ניאון הנפלטים גם חוויות TIR בממשק זהה. עם זאת, זה רק מגביל את הצמצם זיהוי המספרי של lensfree זה על שבב גישה הדמיה ~ 1.0, כזה שרק קרני אלכסונית מעל הצמצם כזה גילוי גבוה המספרי להישאר לכודים בתוך מיקרו שבב בעוד שאר קרני ניאון עדיין יכול פגע באזור הפעיל של מערך חיישנים כדי להיות שנדגמו על ידי פיקסלים שלה.
   למרות הצמצם כזה גדול מספרי זיהוי, כתמים פלורסנט גלם בכל מערך החיישן להיות רחב למדי (למשל, ~ 150-200 מיקרומטר) מאז פליטת ניאון לא כיוונית ולכן במהירות סוטה. כדי מהנדס שליטה טובה יותר בהפצת המרחבי של האות הזה ניאון פלטפורמה עצמים ללא עדשה, אנו מנוצל רכיב אופטי מישוריים, כלומר לוחית סיבים אופטיים (לדוגמה, אדמונד אופטיקה, NT55-142), אשר ממוקם בין האובייקט לבין חיישן מטוסים. לוחית סיב אופטי מורכב מערך 2D של סיבים אופטיים כבלים הנושאות מידע עוצמת אופטי מצד אחד של המכשיר השני. הפונקציה העיקרית של lensfree שלנו על שבב מיקרוסקופיה הגדרת הוא לזוג חופשי בחלל מצבי הפליטה פלורסנט מהכרך מדגם לתוך גלים אופטיים מודרך נסיעה ללא מרחבית מתפשטת בתוך כל סיב, אשר יכול חלקית לצמצם את נקודת פלורסנט lensfree התפשטות-הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטינים) בין האובייקט לבין מטוסים גלאי. זה מגדיל עוד יותר יחס אות לרעש שלנו (SNR) וכן ברזולוציה מרחבית כי יכולה להיות מושגת באמצעות פלטפורמה עצמים ללא עדשה שלנו.
   כחלופה לוחית קבוע, אנו יכולים לנצל גם במצע שלנו על שבב הדמיה של "קוני" סיבים אופטיים לוחית בעלת צפיפות משמעותית גדולה יותר של סיבים אופטיים כבלים על הפן העליון שלה לעומת התחתונה. כזה לוחית קוני לא רק לעזור לנו להשיג כוחות הביטחון הפלסטינים טוב יותר, אבל גם יכול להציג הגדלה במצע שלנו (למשל, <2-3X) אשר נוסף עוזר לנו לשפר את הרזולוציה עצמים ללא עדשה שלנו למטה למשל, <4 מיקרומטר. אנחנו צריכים גם לשים לב כי שדה הראייה של עיצוב כזה קוני הוא מופחת על ידי הכיכר לפחות של גורם הגדלה הציג לעומת מערכת הדמיה מבוססת לוחית קבועה, אשר יכול להוות צמצום למשל, מ ~ 8 ס"מ ² FOV בתחילה (CCD: KAI-11002) עד 2 ס"מ ^<2 עם להתחדד.
   לבסוף, אנחנו צריכים גם לציין כי השימוש של לוחית סיבים אופטיים או להתחדד מעוות את הולוגרמות lensfree המדגם בגלל מצבי אופטיים שונים של מערך סיבים אופטיים ^3. בעוד כגון דפוסי lensfree מעוות על המערך גלאי עדיין יכול להיות שימושי עבור יישומים מסוימים ביחס cytometry, לשיקום הולוגרפי של תמונות השידור, מערך סיבים אופטיים (למשל, לוחית או להתחדד) צריך להסיר את הרכבה על שבב במחיר של רזולוציה מרחבית מופחת מעט ³ במצב פלורסנט.
4. Micro-fluidic צ'יפס: מיקרו fluidic שבבים המשמשים פלטפורמה שלנו מיוצרים באמצעות PDMS (polydimethylsiloxane) קירות דגש על שקופיות הזכוכית יצירת ערוצים מיקרו הדרושים הדמיה על שבב. כדי לפברק אלה מיקרו fluidic ערוצי אנו להמשיך את המתכון הבא:
   1. PDMS A ו-B אלסטומרים מעורבבים באופן אחיד ובחש עם יחס נפח 1:10.
   2. ברגע זה פתרון הטרוגני הוא שפך על צלחת פטרי, הוא ריפא ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
   3. באמצעות סכין X-acto, גודל וצורה הנדרשים של מיקרו fluidic ערוץ הקיר מופק צלחת פטרי.
   4. מליטה המכשיר מושגת לאחר מכן על ידי שימוש בתדירות גבוהה פלזמה גנרטור (אלקטרו טכני מוצרים בע"מ, BD-10AS), אשר צריך לחשוף גם את זכוכית לכסות שקופיות אזור PDMS מליטה.
   5. לאחר טיפול זה פלזמה, המכשיר ממוקם בתוך תנור במשך 40-50 דקות ~ 70 ° C כדי לחזק את מליטה.
5. העצרת ויישור של פלטפורמת שבב עצמים ללא עדשה מיקרוסקופ:
   הליכי הרכבה עבור פלטפורמת lensfree על השבב שלנו הדמיה ניתן כמפורט:
   1. כיסוי הזכוכית של מערך חיישנים אלקטרוניים-Opto מוסר.
   2. באמצעות עט ואקום (אדמונד אופטיקה, NT57-636), מסנן הקליטה דק ממוקם בעדינות על החלק העליון של אזור גלאי פעיל.
   3. לוחית סיבים אופטיים או להתחדד ממוקם על גבי f זה קליטהilter.
   4. מפוברק מיקרו fluidic שבב אז הוא ממוקם ישירות על החלק העליון של מערך סיבים אופטיים.
   5. פריזמה זכוכית או חמי בתחום מורכב מעל שבב מיקרו fluidic באמצעות נפט מדד ההתאמה (Cargille, שמן טבילה סדרה 300) כזה מקדם השבירה של ממשק מותאמת מקדם השבירה זכוכית.
   6. תאורה סיבים סייד הוא התקרב פריזמה (או חמי בתחום) ואת הזווית שלה מותאם על מנת להבטיח כי השתקפות פנימית מוחלטת, מתרחש ממשק זכוכית האוויר המתאים המצע התחתון של שבב מיקרו fluidic. תאורה אנכי (עבור שידור lensfree הדמיה) מיושר להיות בניצב מערך גלאי והוא מרוכז על הרצוי בשדה להציג-של.
   7. הלוואי ואנכי אור מקורות מופעלים ברצף on / off על מנת להשיג שתי הדמיה ניאון בהיר שדה הדמיה הילוכים באמצעות פלטפורמה זהה על שבב.
   8. תמונות Lensfree הגלם נרכשים אז באמצעות ממשק מותאם אישית שפותחה LabVIEW באמצעות מחשב (למשל, מעבד 3.2 GHz, Intel Core).

2. לדוגמא הכנה

השתמשנו פלורסנט מיקרו חרוזים (למשל, Invitrogen, Fluospheres) כדי לכייל פלטפורמת ההדמיה שלנו, על ידי מדידת מערכת lensfree שלה נקודה להפיץ פונקציה (כוחות הביטחון הפלסטינים). לאחר המדידה הראשונית נעשית על כוחות הביטחון הפלסטינים, תאים שונים או חיות מודל קטן (למשל, מהונדס C. elegans דגימות) ניתן הדמיה באמצעות פלטפורמת אותו על שבב.

החל משנה הבאה בסעיף, נספק פרטים נוספים על הכנת המדגם שלנו צעדים.

1. פלורסנט מיקרו חרוזים:
   1. Raw פתרונות חרוז ניאון בשילוב עם מים די כדי לייעל את הריכוז של הדגימות.
   2. ~ 10 μL של פתרון פלורסנט חרוז הוא מעורבב עם 40 μL, 5 מ"ל, 20 מ"ל מים DI עבור 10 מיקרומטר, 4 מיקרומטר ו 2 חרוזים בקוטר מיקרומטר, בהתאמה. פתרונות הטרוגניות של חרוזים שונים (למשל, אי - ניאון ניאון) ערוכים כנדרש על ידי ערבוב של פתרונות שונים חרוז אחד עם השני.
   3. הפתרון הסופי מדגם מוזרק מכן לתוך שבב מיקרו fluidic מהקירות PDMS צד באמצעות מחט מזרק חד (פישר סיינטיפיק, BD מחטים PrecisionGlide, 14-826 סדרה)
2. תא דם לבן סימון:
   1. נפח הדם 100 ~ כל μL מעורבב עם 1 מ"ל של תא אדום ~ חיץ lysing דם (eBioscience).
   2. לאחר הדגרה 3 דקות ~, הפתרון דם lysed הוא centrifuged ואת השכבה גלולה הוא resuspended ב μL 200 ~ של PBS (פוספט שנאגרו מלוחים).
   3. כדי התווית חומצות גרעין של תאים עם צבעים פלואורסצנציה, 5 μL של 1mm SYTO 16 מתווסף μL 200 של resuspension, שלאחריו המדגם הוא מודגרות למשך 30 דקות ~ בחושך בטמפרטורת החדר.
   4. Centrifuging השני מוחל על מדגם זה מסומן, שבו supernatant מוסר כדי להקטין את רעש הרקע עקב פליטה של ​​צבעי ניאון מאוגד.
   5. כדוריות הדם הלבנות גלולה שכבת resuspended ב-PBS, כי אז יכול להיות מועברים שבב מיקרו fluidic עבור lensfree על שבב דימות פלואורסצנטי (ראו למשל, איור 7).

3. עיבוד דיגיטלי של תמונות רכשה פלורסנט עצמים ללא עדשה

במצע זה הדמיה עצמים ללא עדשה, שני אלגוריתמים שונים משמשים דיגיטלית להגדיל את הרזולוציה של המערכת, כלומר deconvolution לוסי-ריצ'רדסון דגימה דחיסה מבוסס פענוח. באמצעות שימוש בשיטות עיבוד דיגיטלי, אנו לכמת את שיפור הרזולוציה כי ניתן להשיג עם כל גישה של פתרון בצפיפות חרוז זוגות (ראה תאנים. 5-6). התמונות משוחזר פלורסנט lensfree אז יכול להיות pseudocolored (אם רוצים), כדי להבליט את הצבע הטבעי של מיקרו אובייקטים, אשר ללא ספק דורש ידע מוקדם של הגל אות ניאון, אלא אם כן צבע (למשל, RGB: אדום, ירוק וכחול CCD / CMOS) חיישן שבב משמש. עבור אלה שיטות עיבוד דיגיטלי, אישית שפותחה אלגוריתמים משמשים שרק דורשים CPU (למשל, מעבד 3.2 GHz, Intel Core). פוטנציאלית, הדור הבא של יחידות עיבוד גרפיקה (GPU) יכול לשמש גם עבור עיבוד מהיר יותר. בנוסף ההדמיה, במידת הצורך, האובייקטים פלורסנט מפוענח ניתן גם לספור באופן אוטומטי באמצעות ממשק מותאם אישית מפותחת (ראו איור. 8) עבור יישומים על השבב cytometry.

1. מדידה של מערכת Point-Spread Function (כוחות הביטחון הפלסטינים):
   לפני כל עיבוד דיגיטלי ברזולוציה שיפור (כגון deconvolution או פענוח דחיסה), הפונקציה מבולבל נקודה התפשטות מערכת על שבב צריך להיות מוערך, אשר יכולה להיות מושגת על ידי מיצוע מספר דפוסי נמדד פלורסנט lensfree נוצר על ידי מבודד פלורסנט קטנות חרוזים הממוקם בגובה מסוים של שבב החיישן. אלהדפוסי ניאון הפרט מיושרים אז ביחס למרכז המסה שלהם קואורדינטות להיות בממוצע לאחר ^1,2 בעוצמה המתאימה נורמליזציה. דפוס זה בממוצע lensfree יכול לשמש אז הפונקציה נקודה התפשטות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלנו על שבב.
2. לוסי-ריצ'רדסון Deconvolution ^1: כדי לשפר את דיגיטלית ברזולוציה מרחבית של הפלטפורמה שלנו, אנו להאכיל את התמונה גלם פלורסנט רכשה ותפקוד הנמדד מבולבל נקודה להתפשט לתוך לוסי-ריצ'רדסון ^80-10 מואצת אלגוריתם. על ידי יישום משפט "Bayes, האלגוריתם לוסי-ריצ'רדסון משתמש נמדד נקודה להפיץ פונקציה iteratively לחדד את אמידה מקסימאלית הסבירות של חלוקת מקור הקרינה על המטוס אובייקט ^8,9. תהליך איטרציה מסתיימת בדרך כלל אחרי מאה מחזורים ספורים לפני הופעתה של הגברה רעש כדי להבטיח שגיאה מרובע מינימלי בין מוקרן ואת דפוסי נמדד פלורסנט lensfree. ההתכנסות של אלגוריתם זה deconvolution הואצה גם בשיטה וקטור אקסטרפולציה כדי לקצר את זמן החישוב ^10. כדי לתת מושג: אלגוריתם זה מספק רזולוציה מרחבית יעילה של ~ 20 מיקרומטר (באמצעות שבב CCD / CMOS בעלי גודל פיקסל של למשל, ~ 9μm) והוא יכול deconvolve FOV של ס"מ 8 ~ ² תוך כמה עשרות דקות מחשב רגיל שפועל Matlab ^1. ראוי לציין, כי באותו זמן חישוב טיפות רק כמה שניות למשל, ~ 1mm ² FOV אשר ניתן להשוות את FOV של העדשה אובייקטיבי טיפוסי 10X.
3. דגימה דחיסה / חישה מבוסס אות דליל, פענוח ^2: שיפור הרזולוציה נוסף (עד <4 מיקרומטר) ⁴ יכולה להיות מושגת באמצעות לחיצה חישה / דגימה מבוסס אלגוריתמים פענוח ^11,12. דגימה דחיסה / חישה מספקת מסגרת תיאורטית לאחרונה המתעוררים ^13-15 שמטרתו לשחזר את אות דלילה ממדגמים הרבה פחות כי הוא נדרש על פי משפט הדגימה. אמנם באופן כללי, התאוששות האות מתחת שנדגמו המדידות היא בעיה חולה הנשקף, לשיעור מסוים של פונקציות (כלומר עבור פונקציות דלילה), משפט ידוע הדגימה בסיס ייצוג שלה מוצג לאחרונה להיות יעיל למדי במונחים מספר המדידות הדרושות, כלומר, האות דלילה אותו יכול בכלל להיות התאושש ייחודי ממדגמים מעט מאוד לעומת תורת הדגימה הקלאסית.
   תמונות פלורסנט עצמים ללא עדשה נרשמו על ידי מיקרוסקופ שלנו על שבב מטבעו לספק את הדרישה החשובה של פענוח דחיסה: עבור יישומים שמעניינים לעבודה זו, כגון cytometry רחב בתחום פלורסנט, ניתוח התא נדירים תפוקה גבוהה מיקרו מערך הדמיה, אובייקטים פלורסנט עניין יכול להיחשב כבר דליל. לכן, עצמים ללא עדשה מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלנו, פענוח של חלוקת ואת החוזק היחסי של emitters פלורסנט הממוקם המטוס אובייקט יכול להיות המודל כפי l בקנה מידה גדול _{1-הסדירה} הריבועים הפחותים בעיה אשר ניתן לפתור באמצעות לדוגמה, פנים, נקודת שיטה ^2,12. בעיה זו אופטימיזציה ניתן לבטא בצורה מתמטית:
   
   שם | | u | | = _k ⁽ⁿ Σ _i | u _i | ^{k) (1 / k)} ו - | | u | | _∞ = מקסימום _אני | u _i |. לכן, אנו למזער l _1-2-l הסדירה הנורמה של ההבדל בין רשמה / נמדד (Y) לבין אומדן (Ax) תמונות lensfree, כאשר x ו מייצגים את מקור ההפצה להיות מפוענח ואת מטריצת המדידה יצרו באמצעות הניסוי של מערכת כוחות הביטחון הפלסטינים, בהתאמה. אנחנו גם להשתמש בפונקציה אילוץ לאלץ את ההפצה מקור על המטוס חפץ להיות שלילי. זה תהליך איטרטיבי דחיסה ופענוח מסתיים כאשר הערך של פונקציית העלות מגיעה לערך שנקבע מראש סובלנות. פרמטרים להסדרת (β) וסובלנות הם פונקציות הכללי של דלילות את האובייקט ואת רמת הרעש מדידה מותאמים במערכת שלנו βmax/10 ~ ו ~ 0.01, בהתאמה.
   בהתבסס על תכנית מספרי שתוארו לעיל, דחיסה ופענוח של תמונות פלורסנט גלם משפר באופן משמעותי את היכולת של הפלטפורמה שלנו כדי לפתור אובייקטים דלילה ותערוכות מהירות עיבוד דומה לוסי-ריצ'רדסון Deconvolution ^2. בנוסף הדמיה שכבה יחידה, חפצים פלורסנט ממוקם בעומקים שונים יכול להיות מפוענח גם מופרדים זה מזה בעת ובעונה אחת על ידי הפעלת אלגוריתם זהה שימוש בכל PSFs המתאים שכבות עומק שונות ^2.
4. Pseudocoloring: אמנם לא מגבלה בסיסית, שהוצג על שבב פלטפורמת הדמיה בעיקר מעסיקה מונוכרום אלקטרוניים-Opto sensor מערכים אשר בדרך כלל מספקים יותר אות לרעש יחס הדמיה מדגם הביולוגי. לכן, התמונות פלורסנט הגלם נרכשים בגווני אפור בפורמט, אשר אינו מכיל את נתוני הצבע האמיתי של הדגימות. זה יכול להיות מיתנה באמצעות צבע CCD / CMOS שבבים באדריכלות הדמיה lensfree שלנו כזה 3 ערוצי צבע (אדום, ירוק וכחול) הם נרכשו כל מדידה פלורסנט lensfree. מצד שני, אם לצבוע תיוג המאפיינים פליטה ידועים כבר, בפורמט גלם תמונות בגווני אפור הניאון של מונוכרום חיישן שבב וגרסאות מפוענח / deconvoled שלהם ניתן גם להמיר באופן מלאכותי לתמונות צבע באמצעות אלגוריתם pseudocoloring מיושם למשל, MATLAB. לענין זה, תמונות בגווני אפור רכשה ניתן להרחיב ל 3 מימדי נתונים קוביות, שבו כל צבע של עניין ניתן להפיק באמצעות גורמי במשקל המתאים כל ערוץ פסאודו הקובייה נתונים. כתוצאה מן העיבוד הזה, תמונות בשחור לבן lensfree פלורסנט ניתן להמיר (אם רוצים) אל הרב ערוצית תמונות המספקים מידע ידוע צבע של אובייקט פלורסנט נתון.
5. תא ספירה אוטומטיות ניאון: עבור יישומים cytometry, פיתחנו גם ממשק אישית מעוצבת המשתמש (ראה איור 8). שניתן לספור באופן אוטומטי את האובייקטים ניאון / תאים בהתבסס על תמונות שלהם נרכש lensfree עם הפלטפורמה שלנו על שבב במיקרוסקופ. לקראת משימה זו, תחילה סף רכה מוחל גלם תמונות lensfree כדי לצמצם את המיקומים הפוטנציאליים של אובייקטים ניאון. לאחר מכן, סדרה של פונקציות (בעיקר regionprops) משמשים למדידת מאפייני דמותו של האזור משנה כל עניין כגון צורה, מיקום, שטח ועוצמה. בעזרת נתונים אלה אובייקט, אובייקטים בינאריים מסווגים לתוך קבוצות, כגון תאים, פיקסלים מתים, כמו גם אבק או רקע הקרינה אוטומטי. לאחר התוצאה הסופית של הפונקציה regionprops מסונן כדי להציג רק את התאים של עניין, אורך של מערך המבנה וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי להשיג את ספירת התאים מעל FOV כולה imager lensfree על השבב שלנו.

4. נציג תוצאות:

סקירה של למעלה הגדרת שלנו מוצג באיור 1, עם כמה רכיבים אופטיים המשמשים ההרכבה שלה. התכונות העיקריות של הפלטפורמה שלנו על שבב מיקרוסקופיה מוסברים איור 2, כולל עירור גילוי הניאון, השתקפות פנימית מוחלטת, כמו גם תאורה חלקית קוהרנטית הדמיה הילוכים הולוגרפית על אותה פלטפורמה. עצמים ללא עדשה ניאון על שבב תוצאות ההדמיה של תערובת הטרוגנית המכילה שונים מיקרו חלקיקים (4 מיקרומטר ירוק 10 מיקרומטר ירוק / אדום) מוצגים איורים 3-4. השוואת deconvolution לוסי-ריצ'רדסון דגימה דחיסה / פענוח חישה מבוסס מסופק איור 5 דיגיטלית עבור שיפור הרזולוציה של תמונות גלם פלורסנט עצמים ללא עדשה. פענוח דחיסה מופעלת ברזולוציה מרחבית (<4 מיקרומטר) היא לכמת באיור 6. עצמים ללא עדשה מיקרוסקופ על שבב של שכותרתו fluorescently כדוריות הדם הלבנות מתואר באיור 7, אשר מספק גם תמונות שצולמו השוואה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. לבסוף, ספירה אוטומטיות ניאון שלנו ממשק אובייקט מוצג באיור 8.

באיור 1. סקירת על שבב מעלה להגדיר עצמים ללא עדשה שלנו הדמיה מוצג עם מספר רכיבים אופטיים המשמשים ההרכבה שלה.

איור 2. התרשים סכמטי של פלטפורמת lensfree על שבב דימות פלואורסצנטי מוצג (בתמונה משמאל). עירור פלואורסצנטי מושגת באמצעות פן את הצד של פריזמה מעוין באמצעות מקור מבולבל. ניסיוני הגדרת המצע שלנו על שבב דימות פלואורסצנטי מוצג גם (בתמונה מימין). דגימת דם שלמים בתוך microfluidic שבב (מידות: 2.5 x 3.5 x 0.3 ס"מ) היה נרגש דרך ממשק פריזמה, שם שמן מדד ההתאמה נעשה שימוש כדי להרכיב את השבב לבין פריזמה. לאחר דחייה של האור על ידי עירור טיר מסנן צבע, רק פליטת פלורסנט מתאי דם שכותרתו נרשם על ידי שבב שלנו חיישן CCD (KODAK 11,002) על FOV של ~ 2.5 x 3.5 ס"מ.

איור 3. רחב בתחום עצמים ללא עדשה דימות פלואורסצנטי על שבב של תערובת המכילה 4 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר חלקיקים פלואורסצנטי ירוק מודגם. לצורך השוואה, 10X אובייקטיבית תמונות מיקרוסקופ ניתנים גם, אשר מסכימה גם עם תמונות פלורסנט עצמים ללא עדשה שלנו.

איור 4. רחב בתחום דימות פלואורסצנטי עצמים ללא עדשה של תערובת המכילה 10 ירוק מיקרומטר ו 10 מיקרומטר חלקיקים ניאון אדום מודגם. תמונות פלורסנט עצמים ללא עדשה שלנו מספקים התאמה הגון 10X אובייקטיבית תמונות מיקרוסקופ של דגימות אותו.

איור 5. השוואה של ביצועי deconvolution (LR) לוסי-ריצ'רדסון דגימה דחיסה (CS) מבוסס אלגוריתמים פענוח מסופק, הדמיה של 10 מיקרומטר שונים חרוז-בזוגות. השורה העליונה ממחישה את התמונות עצמים ללא עדשה פלורסנט גלם. התמונות הבלעה בשורה העליונה להראות השוואות מיקרוסקופ של חלקיקים באותו נרכשים באמצעות עדשה אובייקטיבי 10X. השורה האמצעית שלנו מדגים תוצאות דחיסה ופענוח בעוד השורה התחתונה ממחישה את לוסי-ריצ'רדסון תוצאות deconvolution. ד, ד _CS, ו - ד _LR מתייחסים למרכז אל מרכז מרחקים בתמונות מיקרוסקופ, מפוענח CS תמונות עצמים ללא עדשה, ו LR deconvolved תמונות עצמים ללא עדשה, בהתאמה.

איור 6. עיבוד דיגיטלי של תמונות עצמים ללא עדשה גלם פלורסנט מודגם. אלגוריתם דחיסה מבוסס דגימה משמש כדי להשיג <4 מיקרומטר ברזולוציה מרחבית על ידי פתרון בצפיפות בקוטר 2 מיקרומטר זוגות חרוז. ריבועי גם מראים 40X אובייקטיבי מיקרוסקופ השוואות, אשר מסכים מאוד עם תמונות פלורסנט מפוענח. כאן ד מתייחס מרכז אל מרכז מרחקים בתמונות מיקרוסקופ, בעוד ד _CS מתייחס מרכז אל מרכז מרחקים בתמונות מפוענח CS פלורסנט עצמים ללא עדשה.

איור 7. הדמיה של עצמים ללא עדשה fluorescently (SYTO 16) שכותרתו תאים דם לבנים מודגם. התמונות גלם lensfree הם מפוענח במהירות באמצעות מפענח CS מבוססת, אשר מסכים מאוד עם תמונת מיקרוסקופ רגיל מדגם זהה לזו שרכש עם עדשה אובייקטיבי 10X.

איור 8. אישית מעוצבת ספירה אוטומטיות פלורסנט אובייקט ממשק (ב MATLAB) מודגם.

Discussion

הפגנו פלטפורמה על שבב במיקרוסקופ פלואורסצנטי שניתן להשיג למשל, <4μm ברזולוציה מרחבית מעל למשל> 0.6-8 ס"מ ² בתחום של נוף ללא שימוש עדשות, סריקה מכני או סרט דק הפרעה מסננים. בטכניקה זו, עם השימוש לוחית סיבים אופטיים או להתחדד, פליטת פלורסנט מעצמים נאסף עם מערך-2D ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומר שם	חברה	מספר קטלוגי
טעינת המכשיר מצמידים (CCD)	KODAK	כף-8300
טעינת המכשיר מצמידים (CCD)	KODAK	כף-11002
טעינת המכשיר מצמידים (CCD)	KODAK	כף-39000
משלימים תחמוצת מתכת, סמיקונדקטור (CMOS)	מיקרון	MT9T031C12STCD
מתח גבוה LED כמקור האור	Thorlabs	M455L2-C2
הנהג גבוהה LED כוח	Thorlabs	LEDD1B
סיבים מצמידים מקור אור LED	Mightex	FCS-0625-000
אבק עט	אדמונד אופטיקה	NT57-636
2, 4, 10 מיקרומטר Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS תמוגה חיץ 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 תיוג מגיב	Invitrogen	S7578
סיבים אופטיים לוחית	אדמונד אופטיקה	NT55-142
סיבים אופטיים להתחדד	אדמונד אופטיקה	NT55-134
פריזמות	אדמונד אופטיקה	NT47-626, NT45-403
מסננים	אדמונד אופטיקה	NT39-417
PDMS אלסטומרים	Dow Corning	Slygard 184