בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans</em

Summary

לייזר axotomy ואחריו הדמיה זמן לשגות היא דרך רגיש assay את ההשפעות של מוטציות ג elegans על התחדשות האקסון. איכות גבוהה, אבל זול, מערכת לייזר אבלציה ניתן להוסיף בקלות לרוב מיקרוסקופים. זמן לשגות הדמיה מעל 15 שעות מחייבת immobilization זהיר של התולעת.

Abstract

לייזר axotomy ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות הוא assay רגיש פנוטיפים האקסון התחדשות ב C. elegans ^1. הקושי העיקרי של assay זה היא העלות נתפס ($ 25-100K) ואת המומחיות הטכנית הנדרשת ליישום אבלציה לייזר מערכת ^2,3. עם זאת, המדינה לייזר מוצק הדופק של עלויות צנוע (<$ 10K) יכול לספק ביצועים חזקים עבור אבלציה לייזר בהכנות שקוף שבו האקסונים היעד "לסגור" על פני השטח רקמות. בנייה ויישור של המערכת יכול להתבצע ביום אחד. הנתיב האופטי המסופק על ידי אור הקבל ממוקד לייזר אבלציה מספק מדריך יישור נוח. מודול ביניים עם כל אופטיקה הסיר ניתן המוקדש לייזר אבלציה ומבטיחה שאין אלמנטים אופטיים צריך להתרגש במהלך הפגישה אבלציה לייזר. Dichroic במודול ביניים מאפשר הדמיה סימולטני אבלציה לייזר. מרכוז קרן הלייזר לאo קרן היוצאת מן עדשה מיקרוסקופ ממוקד הקבל מנחה את היישור ההתחלתי של המערכת. מגוון של עדשות משמשים תנאי ולהרחיב את קרן הלייזר כדי למלא את הפתח האחורי של העדשה המטרה שנבחרה. יישור בדיקות הסופי מתבצע עם יעד משטח מול מראות זכוכית שקופית. כוח לייזר מותאם לתת הגודל המינימלי אבלציה נקודה (<1um). נקודה אבלציה מרוכז עם התאמות בסדר המראה רכוב kinematically האחרון לחצות שערות קבוע בחלון ההדמיה. לייזר כוח axotomy יהיה 10X כ גבוה יותר מאשר צורך במקום אבלציה המינימום בשקופית היעד (זה עשוי להשתנות עם יעד אתה משתמש). תולעים יכולים להיות משותקת עבור לייזר ו axotomy זמן לשגות הדמיה על ידי הרכבה על כריות agarose (או microfluidic לתאי ^4). רפידות agarose נעשים בקלות מלוחים מאוזנת נמס במיקרוגל עם agarose 10%. ירידה של agarose מותכת מושם על שקופית זכוכית שטוחה עם אחרשקופיות הזכוכית לתוך כרית כ 200 אממ עבה (שכבה יחידה של קלטת זמן בשקופיות הסמוך משמש כשומר רווח). "ממולח" כובע משמש לגזור משטח עגול בקוטר במדים של 13mm. הרדמה (1ul Muscimol 20mm) ו microspheres (כריס פאנג-ין תקשורת אישית) (1ul 2.65% פוליסטירן 0.1 אממ במים) מתווספים במרכז כרית ואחריו 3-5 תולעים אוריינטציה כך שהם שוכבים על הצד השמאלי שלהם. Coverslip כוס מוחל ואז וזלין משמש לאטום את coverslip ולמנוע התאדות של המדגם.

Protocol

1. בנייה של מערכת אבלציה לייזר

ללבוש משקפי בטיחות לייזר ושימוש טוב נוהלי בטיחות לייזר במהלך יישור הראשונית. לעולם לא להסתכל דרך oculars כאשר הלייזר פועל.

1. מסדרים את המרכיבים על קרש החיתוך, כפי שמוצג באיור. 1 (ראו גם דוגמא ^2). Bolt את לייזר (עם צלחת riser במידת הצורך), שלאחר פריסקופ, ואת תומכת רכבת גבוהות.
2. מיקום מיקרוסקופ שלך כדי להתיישר עם ציר הרכבת. יישור עם אלומת האור המועבר מן העדשה הקבל מיקרוסקופ. יישר את גובה המעקה (להשתמש רמה) ואת המיקום עם צמצם או עדשה מתכווננת מודבקת על המעקה. צמצם או עדשה חייבים להיות מיושרים בשני הקצוות של המסילה אל הקורה הקבל. שקעי מעבדה יכול לעזור עם התאמת גובה המעקה.
3. יישר את מקטב Glan-תומפסון חצי גל הצלחת קרן לייזר. אתה לא צריך את הלייזר על לעשות את זה יישור. בEAM רק צריך לעבור את שניהם בלי לפגוע הקצוות שלהם. סובב את מקטב לספק אוריינטציה עמדה נוחה עבור המזבלה קרן (תמונה 1). תוכלו לסובב את נפנוף קל צלחת כדי להתאים את כוח לייזר. Secure את הרכיבים קרש החיתוך.
4. הפעל את הלייזר, להגדיר את תדירות הדופק ל -100, במצב מתמשך, ולצמצם את כוח למינימום באמצעות צלחת חצי גל. השתמש פתק Post-it או נייר העדשה לדמיין את קרן הלייזר.
5. התאם ולתקן את מראות רכוב kinematically ברצף של לייזר כדי להביא את אלומת האור אל המראה כי הוא רכוב על קצה המעקה מוגבה. קרן הלייזר צריכה להיות בערך מיושר למרכז המראות. מראות צריכה להיות מכוונת בערך 45 מעלות על ציר קרן לייזר (תמונה 1).
6. גס להתאים את המראה kinematically רכוב על גבי פריסקופ ועל בסופו של הרכבת כדי ליישר את קרן הלייזר למרכז של קרן האור מועבר המיקרוסקופ. הן קרן לייזר ו tהעביר קרן אור המיקרוסקופ ניתן דמיינו בו זמנית על ידי החדרת נייר בנתיב הקורה. ודא כל המסננים ND ו פתחים במודול הביניים יוצאים או פתוח.
7. דק ליישר את קרן הלייזר למרכז של קרן האור המועבר בהתאמות קנס על פריסקופ העליון ומראות הרכבת. החזק את הנייר קרוב במראה המעקה ליישר את קרן הלייזר למרכז של קרן האור מועבר עם המראה פריסקופ העליון. החזק את הנייר ליד הנמל מיקרוסקופ וליישר את קרן הלייזר למרכז של קרן האור מועבר עם המראה התאמות מסילה (Fig.2).
8. מיקום Post-it לציין בנתיב הקורה בין העדשה הקבל בציר הצריח אובייקטיבית פתוח. אתה צריך לראות את אלומת האור מועבר באמצעות קרן לייזר קטנה בסמוך למרכז. השתמש התאמות קנס על המראה ברכבת הקורה מרכז לייזר. תקן את המיקרוסקופ במקום עם מהדק.

שלבים 10.9-1.12 הם אופציונליים, אבל קל ושימושי להעריך יישור אבלציה לייזר לפני הוספת עדשות קרן מתרחבת.

9. כבה את לייזר להעסיק את בטיחות תריס מכני. סיבוב החוצה dichroic 50% נתיב קרן. אפילו לא אור לייזר ישיר יעבור את oculars, האור המוחזר יכול להיות אינטנסיבי למדי. הר שקופיות יעד יישור התמונה בסדר במטרה שמן 60x. פוקוס על שריטות בשקופית. שים את ND4 ו ND8 מסנן מודול ביניים.
10. תמונת היעד שקופיות עם CLSM שלך, דיסק ספינינג, או מערכת מצלמת CCD. סובב את dichroic 50% לתוך הנתיב לייזר. מנקודה זו, אתה לא צריך להסתכל דרך oculars בעוד לייזר אבלציה על. הפעל את הלייזר אבלציה ולהגדיר את מצב לתדר, מופעלות על 100, ומספר הדופק עד 10. ודא כוח מוגדר עדיין למינימום עם צלחת חצי גל ולאחר מכן פתח את תריס מכני בטיחות. אתה יכול simultaneouתמונה ערמומי ולהשתמש לייזר אבלציה.
11. בעוד הדמיה השקופית היעד, ההדק לייזר אבלציה. בדוק את השקופית יעד אממ אבלציה במקום 1-10 קוטר. ברצף להסיר את המסננים ND עד נקודה אבלציה נתפסת. התאם את המקום אבלציה למרכז התמונה עם המראה הרכבת. אתה רוצה להוסיף בחזרה ND פילטר יש מקום להגדיל את כוח לייזר דק עם צלחת חצי גל לתת <1 אבלציה נקודה אממ. תמונה ב 0.2 אממ / פיקסל או פחות דק להתאים את המקום אבלציה למרכז התמונה (256,256 עמדה עם תמונה 512x512).
12. בדוק את עומק המיקוד ואת ציר של קרן לייזר. פוקוס למעלה ולמטה 1-2 אממ ולבדוק את המיקום אבלציה ואת גודל נקודה אבלציה. אם קרן הלייזר מיושר axially המקום אבלציה לא יזוז. קרן הלייזר מותנית תפיץ כוח אממ כמה (כ 3-5 אממ מלמעלה למטה של ​​המוקד).

2. הוסף עדשות להרחיב את קרן הלייזר כדי למלא את המטרה בחזרההצמצם ולהתאים את ההתכנסות כדי לשלוט להתמקד

1. מערכת זו משתמשת כפול הגלילי הקורה expanders להרחיב את קרן הלייזר כדי למלא את הפתח האחורי של המטרה (10 מ"מ). הר 4 עדשות על ספקים ולצרף אותם אל מעקה (+ L1f1 L2f2 L3f1 ו '+ L4f2'). התאם את עמדות כל כך עדשות נמצאים הציר האופטי זהה אורתוגונליים בדיוק את קרן הלייזר (איור 2).
2. הפעל את הלייזר ולהתאים אותו כוח מינימלי במצב מתמשך. בערך להתאים את יישור הקורה דרך העדשה כל שימוש בנייר לראות את קרן הלייזר והעביר אלומת האור מן הקבל מיקרוסקופ. כבה את הצמצם לייזר.
3. הסר את מהדק מצד אחד של המיקרוסקופ והחלק את המיקרוסקופ מתוך נתיב קרן הלייזר. הפעל את הלייזר ולהסיר תריס בטיחות.
4. יישור עדין של עדשות קרן הלייזר יכול להתבצע על ידי הצגת קרן לייזר מורחבת על הקיר הסמוך. הקרן אמורה להתרחב ולהתכווץ באופן סימטרי כאשר lenses מועברים. התאם את האחרון שתי מראות רכוב kinematically כדי ליישר את הקורה (Fig.3).
5. פרופיל הקורה מיושרת והרחיב צריך להיות עגול של בהירות אחידה (Fig.3). גודל ואחידות של הקרן ניתן לראות עם פוסט זה פתק במיקום המשוער של הפתח האחורי אובייקטיבי.
6. הקרן צריכה להיות מותאמת התכנסות אפס עבור מערכות אופטיות אינסוף. ההתכנסות ניתן להעריך על ידי וציין כיצד משתנה גודל קרן כמו תעביר פוסט זה פתק רחוק יותר עדשות. כבה את לייזר להעסיק את תריס מכני.
7. החלק את המיקרוסקופ בחזרה לנתיב קרן לייזר באמצעות מהדק קבוע כדי להגדיר את היישור הנכון. החלף את מהדק בצד ללא מיקרוסקופ, אבל לא להדק למטה.
8. הפעל את הלייזר ולהסיר את התריס בטיחות. סובב את צריח אובייקטיבית למצב פתוח. מניחים פוסט זה פתק על הבמה. אתה צריך לראות את קרן הלייזר מורחבת אחיד התרכזו ב האור המועברEAM מתוך מעבה (fig.4). ייתכן שיהיה עליך מרכז זה על ידי שחרור המלחציים מיקרוסקופ ובזהירות דוחקת את המיקרוסקופ.
9. Engage את התריס בטיחות, ולהגדיר את הלייזר כדי לעורר מצב. סובב את המטרה 60x במקום והתמונה שריטות משטח בשקופית היעד.
10. הסר את תריס בטיחות, להפעיל את הלייזר אבלציה ולהתאים את כוח לייזר במקום אבלציה המינימום. הנקודה אבלציה צריך להיות עגול בתוך אממ 5-10 של מרכז התמונה.
11. במרכז המקום אבלציה עם התאמות בסדר המראה רכבת רכוב kinematically. יהיה עליך להתאים את iteratively רכוב המעקה מראה פריסקופ בראש למרכז הן המקום אבלציה ולשמור על פרופיל קרן אחידה.
12. הערכת להתמקד Z של הלייזר על ידי העברת המוקד באופן שיטתי למעלה ולמטה 1 צעדים אממ מפעילה הלייזר אבלציה. קרן מותאם מורחבת, מיושר, והתכנסות צריך לכרות מקסימאלי במוקד התמונה חלש או בכלל לא ab 1 אממove או מתחת מוקד (איור 5).
13. התאם את המיקוד Z הקורה מורחבת על ידי הזזת העדשה L3 של הטלסקופ הגלילי (Fig.2).

3. לייזר ו axotomy זמן לשגות מיקרוסקופיה של התחדשות האקסון

1. מיקרוגל agarose 10% (RPI לביולוגיה מולקולרית כיתה EEO 0.1 A20090) ב מלוחים מאוזנת עד שנמס לחלוטין. הגדר על צלחת חמה לשמור אותו נמס במהלך לשימוש גובר.
2. ירידה של agarose מותכת מושם על שקופית זכוכית שטוחה עם שקופיות עוד כוס לתוך כרית כ 200 אממ עבה (שכבה יחידה של קלטת זמן בשקופיות הסמוך משמש כשומר רווח).
3. כובע "ממולח" סמן משמש לגזור משטח עגול בקוטר במדים של 13mm.
4. הרדמה (1ul Muscimol 20mm) ו microspheres (כריס פאנג-ין, תקשורת אישית) (פוליסטירן 1ul 2.65% 0.1 אממ במים) מתווספים במרכז כרית ואחריו 3-5 תולעים אוריינטציה ולכן הם שוכבים על צד שמאל . Coverslip כוס מוחל Vasel אזine משמש לאטום את coverslip ולמנוע התאדות של המדגם (fig.6).
5. לייזר אבלציה מיושר הכוונת, כמתואר לעיל, בתחילת כל פגישה. Engage את התריס בטיחות לייזר.
6. הסר את מערך לייזר היעד התמונה התולעת הבוגרת רכוב עם סמן פלואורסצנטי מתאים הנוירונים היעד. תמונה אקסונים בהגדלה דומה (0.2 um / או הגדלה פיקסל ומעלה) ואת המיקום תחת הכוונת (fig.7).
7. פתח את תריס בטיחות לייזר ההדק לייזר אבלציה תוך הדמיה. הערכת האקסון לאחר מפעילה הלייזר ולאט לאט להגדיל את כוח לייזר עד האקסון נחתך. יהיה עליך על כוח 10X לייזר יותר לחתוך אקסונים מאשר להקים במקום אבלציה בשקופית יישור היעד (כ 1uJ / ns הדופק). אנחנו חותכים בדרך כלל kHz 2.5 כוח מוגדר על 0.27mW (הספק ממוצע נמדד הדגימה עם מד FieldMaxII קוהירנט כוח לייזר מוגדר רציפה ב 2500 הרץ) עם 100 פעימות. אבלציההגדרת לייזר כוח יהיה עקבי לחיתוך אקסונים בניסויים עתידיים (fig.7).
8. האקסון לחתוך בהצלחה יציג הפסקה של כ 0.5-1 אממ ללא הפסד של בהירות בשני הקצוות לחתוך (fig.7). הפסד גדול של בהירות או פער גדול (20-10 אממ) מסמל לעתים קרובות נזק רב מעבר האקסון על ידי בועה cavitation. אקסונים הפרוקסימלית ומ דיסטלי יהיה נפרד בצורה נורות הכחשה במשך 30 הדקות הבאות (איור 8 ו - Movie).
9. לאזן תולעים רכוב עם מיקרוסקופ הבמה שלך במשך 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות הקלטה שלך. זה יהיה למזער להיסחף בשל ההבדלים בטמפרטורה והתכווצות agarose.
10. ) זמן לשגות הדמיה פרמטרים מוגדרים באמצעות תוכנת הדמיה קשורה למערכת שלך. אנחנו בדרך כלל 10-20 תמונה צעדים Z (1um/step) בשעה 0.1-0.2 אממ / פיקסל באמצעות רווח, חריר, קצב סריקה, הדמיה הגדרות לייזר הכוח לצמצם את החשיפה תוך מתן ברזולוציה מרחבית הרצוי. מרווחי דגימה אופיינייםly 1-5 דקות במשך 15 שעות, תלוי ברזולוציה הזמני המבוקש (איור 8 ו - Movie).
11. זמן לשגות נתוני תמונה מומרים סרטים באמצעות אלמנטים ש"ח או ImageJ.

4. נציג תוצאות:

לייזר axotomy באמצעות מערכת זו הינו אמין שגרתית. תוצאות שמוצג באיור 7 אופייניים. זמן לשגות הדמיה של התחדשות האקסון הוא מאוד חזקים שימוש בפרוטוקול זה. אנו שגרתי לגזור תמונה עד 5 אקסונים ב 5 תולעים שונות בשקופית אחת באמצעות הבמה ממונע. המגבלה היחידה היא הזמן שלוקח לאסוף את כל תמונות של האקסון, למשל, אם זה לוקח 20 שניות לאסוף ערימה של האקסון אז לכל היותר אתה יכול מדגם 9 אקסונים (9 ערימות) אם אתה כל דגימה 180 שניות. הדוגמה המוצגת איורים 8 ו - 9 היא תוצאה נציג טוב. כ -10% בניסויים לתת תוצאות של איכות זו. הניסויים הנותרים לספק נתונים טובים על הפנוטיפ התחדשות, אבל הם unappeal אסתטיתing בגלל תנועות jittering קטן של התולעת כי בדרך כלל מתחילות לאחר 5-8 שעות של חוסר תנועה.

איור 1 אבלציה מערכת לייזר. 532 ננומטר Nd: YAG לייזר רכוב על צלחת riser כדי להביא אותה לגובה של רכיבים אחרים, וזינק אל קרש החיתוך. (המבודד האופטי הוא אופציונלי וכנראה לא נחוץ). מקטב Glan-תומפסון חצי גל צלחת משמשות דק לשלוט על כוח לייזר. הם נמצאים עולה סיבוב מכויל היטב. תשמרי על עצמך הגדרת ה-dump הקורה. המראה לפינה ומפנה את קרן הלייזר אל המראה פריסקופ נמוך. המראה פריסקופ עליון שמכוון את הקורה למראה הרכבת. מעקה הוא רכוב על שתי פלטפורמות מוט נתמך. עדשות גלילית כפולה מחוברים mounts רכבת הזזה. שימו לב מודול ביניים נוסף המוקדש לייזר אבלציה. המערכת יכולה להיות קומפקטית יותר על ידי הסרת Isola אופטיתור את המראה בפינה, למקם מחדש את לייזר, Glan-תומפסון מקטב וחצי גל צלחת לקצה האחורי של קרש החיתוך.

איור 2 עדשות Dual מיזוג הגלילי משמשים להרחיב אממ 300 TEMoo קרן לייזר על גודל אחיד אפס ההתכנסות 10 מ"מ. שקע המעבדה ממוקמת מתחת לאחד פלטפורמות להיאחז במעקה. זה עוזר לכוון את גובה המעקה במהלך השלבים היישור. בגסות להתאים את גובה המעקה על ידי הרכבה של העדשה L1 אל המעקה, באמצעות קרן הקבל כמדריך היישור. התאם את הרכבת, כך הקורה הקבל מיישרת למרכז של העדשה בשני הקצוות של המעקה. פעולה זו תבטיח את המעקה מיושר מקביל לציר האופטי של המיקרוסקופ. ייתכן שיהיה עליך קודם כל להתאים את מיקרוסקופ כדי להתאים את ציר אופטי של המעקה. השתמש מהדק לתקן את המיקום של המיקרוסקופ (ראו איור. 1). הסרת הדואר הרכבת רכוב העדשה. עכשיו ליישר את קרן הלייזר למרכז הקורה הקבל בשני הקצוות של המעקה. נייר בנתיב קרן הוא דרך נוחה לראות את שתי הקורות בו זמנית. השתמש במראה פריסקופ העליון כדי ליישר את קרן הלייזר אל הקורה הקבל קרובים מראה רכבת רכוב. השתמש המעקה מותקן במראה כדי ליישר את קרן הלייזר אל הקורה הקבל בקצה המרוחק של המעקה (הקרוב ביותר מיקרוסקופ). עכשיו לעלות את כל ארבעת עדשות למעקה, כפי שמוצג באיור. אורכו של המעקה, אורך המוקד של העדשות, ועל הסדרי העדשה ישתנה בהתאם מיקרוסקופ ולהגדיר גופנית מעלה. פרמטרים קריטיים קרן הלייזר בקוטר גודל הצמצם האחורי של המטרה שנבחרה. Infinity מערכות אופטיות יתמקד מקביל לחלוטין קרן לייזר (אפס ההתכנסות). מרחק בין L1 ו-L2 צריך להיות סכום של העדשות אורכי מוקד, F1 + F2, ואת המרחק בין L3 ו L4 צריך להיות בהתאם F1 '+ F2 ". המרחק בין הדואר זוגות כפול הגלילי אינה קריטית. מיקום L3 יכול להיות מותאם היטב כדי לשלוט ההתכנסות קרן; <התאמות 1mm יהיה צורך להתאים את המיקוד של הלייזר כדי למקד את התמונה. הקפד להסיר את כל עדשות, מסננים, פתחים וכו 'מהמודול ביניים שעשוי להיות בנתיב קרן (או להיות מודעים מה הם עושים ולהתאים את המערכת שלך בהתאם).

איור 3 יישור של קרן לייזר דרך עדשות גלילית כפולה. הסר את מהדק מיקרוסקופ מצד אחד של המיקרוסקופ כך מיקרוסקופ ניתן להעביר מתוך נתיב קרן, אבל מהדק הנותרים יאפשרו מיקרוסקופ להיות מיקומו בדיוק. תחשוב בטיחות לייזר. ודא כוח לייזר מותאם למינימום עם מקטב Glan-Thompson. הפעל את הלייזר ולהציג את קרן הלייזר דפוס על הקיר. אתה עלול למצוא את נייר מודבקת לקיר עוזר להציג את הלייזרנקודה. שיטתי לשנות את עמדותיהם של עדשות כדי לקבל תחושה לגבי מה שהם עושים לגודל הקורה ואת המראה. אתה צריך לראות משהו שנראה כמו פאנל, בו במקום אינטנסיבי ממוקם אקסצנטרי בפרופיל עמעם. השתמש במראה רכבת רכוב כדי להתאים את מקום אינטנסיבי למרכז, כפי שמוצג בלוח B. עכשיו להשתמש פריסקופ בראש רכוב המראה לתת פרופיל היקפי אחידה. אם הכל מיושר כהלכה אתה צריך עכשיו למצוא כי העברת עדשות גורמת הקורה להתרחב ולהתכווץ באופן סימטרי. הזז את העדשות חזרה לעמדות המוצא כפי שמוצג באיור 2. עכשיו ליירט את הקורה במרחק של הפתח האחורי אובייקטיבי. זה צריך להיות עגול, לפחות מספיק גדול כדי למלא את הצמצם חזרה שלך, של בהירות אחידה. זה בסדר אם הוא גדול יותר, כל עוד יש לך כוח לייזר מספיק כריתה שלך. הערכת ההתכנסות ידי השוואת קוטר אלומת במרחק של הצמצם המטרה בחזרה לקיר. קרן בקוטר צריךלהיות זהה עבור קרן התכנסות אפס. בר סולם הוא 10mm.

איור 4 המערך של קרן לייזר מורחבת הקורה הקבל. תריס הלייזר להזיז את המיקרוסקופ בחזרה לתוך הנתיב של קרן לייזר באמצעות מהדק כמו מפסיק היישור. הפעל, ליישר, ולמקד את אלומת האור הקבל באמצעות נייר המטרה העדשה. Tape מעל oculars כדי למנוע ממישהו הצגת אור חזק לייזר לידי ביטוי. סובב את צריח אובייקטיבית למצב פתוח. שימו פיסת נייר על הבמה כדי לחסום את הקורה הקבל. הפעל את הלייזר על מצב מתמשך להסיר את תריס מכני בטיחות. אתה צריך לראות כמה אור לייזר הקרובים למרות המיקרוסקופ. שחרר את מהדק מיקרוסקופ בעדינות דחיפה מיקרוסקופ כדי ליישר את קרן הלייזר עם הקורה הקבל. קרן הלייזר צריכה להיות עגולים של בהירות אחידה. לפעמים זה מועיל adjuרח' הרכבת עדשות רכוב. אתה אמור להיות מסוגל להתרחב ולהתכווץ קרן הלייזר אחיד אם היישור הוא הנכון. אתה יכול למרכז את קרן הלייזר חוזה קרן הקבל למינימום מרוכז עם מראה רכבת רכוב ולאחר מכן להרחיב אותו לגודל הרצוי. ברגע שיש לך להתאים את המיקום של הקרן התקשרה עם המראה הרכבת, תצטרך להתקין מחדש את המראה העליון פריסקופ רכוב לשמור על בהירות אחידה של הקורה מורחבת. אם אתה לא יכול לקבל קרן לייזר ממוקדת מעגלית ואז תצטרך לחזור דרך השלבים יישור קודם לכן.

איור 5 מרכז את המקום אבלציה ולהתאים את קרן הלייזר התכנסות עבור להתמקד אופטימלית. כבה את הצמצם לייזר. הסר את הנייר ואת הר השקופית היעד שיקוף (אתה יכול גם להשתמש בדיו בטוש בלתי מחיק על coverslip כמטרה ^2). תמונה שריטות על פני השטח מראות עם 60X עדשה 1.4na שמן) עכשיו התמונה משטח עם confocal או CCD. אל תסתכל דרך oculars תוך לייזר פועל. הפעל ו unshutter הלייזר. הגדר את הלייזר כדי לעורר מצב, ההספק הנמוכה ביותר, ו - 100 הרץ. טריגר על 10 פעימות. אתה צריך לראות את המקום אבלציה של 1-5 אממ בקוטר בתוך 10 אממ של מרכז הראייה. אם אינך רואה את הנקודה אבלציה אתה יכול להגדיל את הכוח לייזר צעדים 5-10%. ברגע שאתם מזהים נקודה אבלציה, מרכז זה בתחום התצוגה. שים את הכוונת על 256, 256 הקואורדינטות אם צפייה בתמונה 512x512. אם תתאים את המקום לייזר למרכז אז זה לא ישנה את העמדה עם התקרבות. השתמש המעקה מותקן במראה כדי להעביר את הנקודה אבלציה של הכוונת במרכז. להעריך מחדש את האחידות של קרן לייזר על ידי הסתכלות הקורה במטרה להסיר כמתואר לעיל באיור 4. התאם את אחידות המראה עם קרן פריסקופ בראש רכוב. חזור על הערכה של העמדה במקום אבלציה. זהו איטרטיבי process כי יש לחזור עד נקודה אבלציה מרוכז ואת קרן מורחבת אחידה. אם נעשה בצורה נכונה את המקום אבלציה יהיה מעגלי כפי שניתן לראות במקום אבלציה במוקד באיור. הבא להעריך את המיקוד של אלומת לייזר ציר Z. טריגר הלייזר כדי לייצר נקודה אבלציה של כ - 1 אממ במרכז. עכשיו להעביר את השקף על 5 אממ רוחבית להתמקד 1 אממ מתחת לפני השטח של שקופית היעד. טריגר לייזר תוך שימוש בהגדרות לייזר זהה השתמשת עבור אבלציה במקום הראשון. חזור אחרי התמקדות 1 אממ מעל פני השטח של שקופית היעד. אם קרן לייזר ממוקדת למקד את התמונה אז אתה צריך לראות דפוס דומה לזה שמוצג באיור הזה. הנקודה אבלציה הגדולה צריכה להתאים למקד את התמונה ואת הנקודות אבלציה מעל ומתחת המיקוד צריך לקבל קטן סימטרי. התאמת העדשה L3 ליישר מטוסים מוקד. הזזת העדשה L3 הרחק המיקרוסקופ יגרום הקורה מתכנסת יותר את המקום אבלציה יהיה להתקרבהמטרה. קטן <התאמות 1mm יהיה צורך להתמקד ליד. כעת אתה מוכן לחתוך אקסונים. סרגל קנה המידה 1 אממ.

איור 6 תולעים הרכבה עבור axotomy לייזר זמן לשגות הדמיה. Agarose 10% מלח מחומם עד שנמס לחלוטין. טיפה קטנה מושם על המיקרוסקופ שקופית זכוכית שטוח אז עם שקופית אחר כדי ליצור משטח שטוח. עובי משטח מוגדר על ידי סרט על שתי שקופיות סמוכים. כרית מותר להגדיר לרגע על 1 ולאחר מכן את השקופיות מופרדים. "ממולח" העליון משמש חותך עוגיה כדי ליצור משטח בגודל אחיד של כ - 13 מ"מ. 1 ul של 10mm Muscimol ו 1 ul של microspheres מתווספים במרכז כרית (פאנג-ין תקשורת אישית). תולעים מתווספים לירידה 2 ul בכיוון לפני לשים על coverslip הזכוכית. וזלין מוחל אז מן מזרק (20-25 גה. מחט) לקצה coverslip כדי לאטום אותו.

איור 7 תוצאות אופייניות של לייזר axotomy ב C. elegans. ב אתה יכול לראות את האקסון שלמים זמן קצר לפני ואחרי לייזר axotomy. הפער הוא בדרך כלל כ 0.5-1um. B מראה לייזר axotomy של האקסון אחד ללא פגיעה האקסון סמוך על 1 אממ משם. לייזר נקבע לשלטון על 10% (ממוצע 0.3 mW ב 2500 הרץ), ו - 100 פעימות. סרגל קנה המידה 5 אממ.

איור 8. סוג בר אופייניות L4 התחדשות. זהו רצף הזמן מראה אבלציה ואת זמן לשגות הקלטה של ​​התחדשות האקסון. זמן קצר לאחר לייזר axotomy ב 0 דקות אתה יכול לראות את הנורה הכחשה. עד 138 דקות הנורה נסיגת יש משוך לאחור במידה הרחוק ביותר שלה עכשיו מתחילה לשפץ. בליטות קרום ספוראדי (mircospikes או filopodia) ניתן לראות לאורך הפיר האקסון (חיצים 138 ו - 324).גדם זכות מרחיב חרוט בנוי היטב לצמיחה קומפקטית ב 360 דקות. ב 414 דקות גדמי שניהם הרחיבו קונוסים צמיחה. הראשונית עובריים כמו קונוסים צמיחה להפוך dystrophic כפי שהם להרחיב לכיוון חוט העצב הגבי (414, 519 ו - 597 דקות). הגידול קונוסים dystrophic קצר של חוט העצב הגבי (960 דקות) דוכן. ראשי חץ להצביע על גדם הפרוקסימלית ומ קונוסים צמיחה. חצים להצביע בליטות הממברנה לאורך הפיר האקסון הפרוקסימלי. בר סולם 20um.

סרט 1. סרט סוג של התחדשות בטבע האקסון. הסרט הזה הולך יחד עם נקודות הזמן שמוצג באיור 8. תולעים היו רכוב כמתואר בפרוטוקול ו אקסונים הם צילמו כל שלוש דקות למשך כ -10 שעות. Z ערימות (20 X 1um) נלקחו בכל נקודת זמן מוזגה לתוך התמונות אחת על ידי אלגוריתם התחזית היותר (אלמנטים ש"ח). לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

Discussion

ישנם מספר דיונים טובה של לייזר microsurgery עם מערכות לייזר שונות ^3,5-11. Femtosecond לייזרים IR הם "תקן הזהב" עבור אבלציה לייזר subcellular ¹² ונוחה אם הקשורים במתקן הדמיה, אבל הם לעיתים קרובות יקר מדי עבור משתמשים פרטיים. אם אתם זקוקים לייזר femtosecond IR עבור הדמיה מדגם שלך בגלל עומק הדמיה אז אתה כנראה צריך אחד עבור לייזר axotomy. רקמות שקוף עם אקסונים היעד בתוך 30-50 אממ של פני השטח הם כנראה אפשרי עם לייזרים הדופק כחול וירוק בטווח Uj / דופק 20 ממוקדות מבעד לעדשה na גבוה טבילה. לא יהיה נזק סביבתי יותר עם ​​ננו ולייזרים פיקו second לעומת הלייזר femtosecond, במיוחד כאשר העומק של עליות האקסון היעד. ג elegans שקוף אקסונים כולם בתוך 20-30 אממ של פני השטח. אנו שגרתי לחתוך אקסונים מנוע, כי הם בתוך 5 אממ של פני השטח. יש לנו גם לחתוך בקלות גרזןתוספות בתוך טבעת העצב כי הם בערך 20 אממ מפני השטח לציפורן. מצאנו את מגבלת לחיתוך אקסונים להיות כ 30-50 אממ דרך בקוטר של תולעת מבוגר. סביר להניח כי אבלציה לייזר במערכת המתואר כאן יעבוד היטב עם תכשירים שונים שמתאימים לקריטריונים של שקיפות ועומק של אקסונים היעד. ובכל זאת, זה קצת מפתיע, בהתחשב ביתרונות התיאורטיים של לייזרים femtosecond IR, כי ננו picosecond 355 nm ו 532 nm לייזרים לבצע כל כך טוב עבור לייזר axotomy ב C. elegans ^6,13. אנו רואים הבדלים התחדשות האקסון בתגובה לייזר axotomy שבריר שנייה עם 440 ננומטר, 532 ננומטר שבריר שנייה, לייזרים femtosecond IR.

מצב מוצק 355 ננומטר לייזרים UV הן על העלות זהה דיודה 532 ננומטר שאוב פסיבי Q-Switched לייזר מצב מוצק, אך דורשים סמכויות או גבוה או אופטיקה ביעילות לעבור אלה אורכי גל קצרים יותר. רוב אופטיקה נועדו לבצע היטב עם 400 גלוי -700 ננומטר אור. 355 ננומטר לייזרים תציע כמה יתרונות כגון ⁶ סף פלזמה מופחת, גודל נקודה קטן יותר, dichroic לעבור זמן רב היה יעיל ישיר 100% של הלייזר אבלציה ליעד ולאפשר דימות סימולטני של ה-GFP ללא אובדן האות המדגם. כחול 440 ננומטר לייזרים היה לשמר את היתרונות של עבודה עם לייזר האור הנראה (ביצועים טובים עם אופטיקה תקן בטיחות). למרבה הצער, את העלות של DPP Q-switched מוצק המדינה 440 ננומטר לייזר 3 פעמים את העלות של לייזר 355nm או 532 ננומטר עוצמה דומה בתקופה זו. אם היינו בתכנון מערכת חדשה עבור C. elegans, שם בעומק המטרה היא מינימלית, היינו לבחור עדשה שקופה UV (עלות כ - 3000 $ עבור עדשה שמן 40X 1.3na עם העברה 50-70% ב 355nm) ו לייזר 355 ננומטר לייצור Uj 5-10 / דופק על 1 -20 קילוהרץ.

אבלציה אקסון נחשבת עקב היווצרות פלזמה. פולסים קצרים יפיק ספי פלזמה ב חשמל נמוכה הכרכים פלזמה w חולה להיות קטן ^6. המטרה היא לייצר את הפלזמה הקטן משך החיים הקצר ביותר על ידי התאמת אנרגיה הדופק העוצמה הנמוכה ביותר. מוגדלת חיים ארוכים פלזמות תיצור בועות cavitation כי נזק לתאים הסמוכים. גילינו בדרך כלל כי אבלציה באמצעות כ 50-100 פעימות בתדירות הגבוהה ביותר (כלומר 2.5kHz) נותן את התוצאות הטובות ביותר. הדבר מצביע על כך הנזק ניתן לשלב בהדרגה במשך סדרה של פולסים לשלוט טוב יותר את מידת הנזק. אבלציה לייזר המערכת המתוארת כאן היא סלחנית מאוד אם קרן מיושר והרחיב במדויק. אנחנו מתחילים חיתוך האקסונים של תולעים בוגרות לייזר בהספק 10% (ממוצע של 0.3 mW נמדד ב הרץ 2500 והעריך 1 Uj / דופק) והוא יכול לחתוך עם נזק מקומי מוגבל באמצעות כוח 14%. אתה יכול לראות אזורים גדולים של נזק מהשלטון לייזר 15-39%, אבל רק מעל כוח 40% (כ 1 ממוצע mW נמדד הרץ 2500) לעשות התולעים להתפוצץ עקב בועות cavitation גדול ונזק לציפורן של התולעת.

e_content "> et al. 2010 ² הנייר הוא משאב מצוין עבור בניית מערכת אבלציה לייזר. Steinmeyer ליאון אייברי יש גם תיאור מעשי נחמד של מערכת לייזר אבלציה מבוסס על לייזר זול גז N2 337 ננומטר והוא מספק כמה מעשית רבה עצה (elegans.swmed.edu / Worm_labs / אייברי /). בעת תכנון המערכת שלך אתה צריך קודם לדבר עם נציג מיקרוסקופ כדי לקבוע כיצד לכוון את הלייזר אבלציה למטרה מיקרוסקופ. מיקרוסקופ שלך צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רעידות (ניופורט, TMI, Thor). גבי קרש החיתוך הוא אופטימלי, אבל בראש פלדה מוצק עדיין ניתן להשתמש עם positioners מגנטי. מודול ייעודי ביניים על היקף זקופה נחמד כי כל אלמנטים אופטיים ניתן להשאיר במקום. עם זאת, יכול להיות זול יותר ונוח יותר להשתמש ביציאת המצלמה (הפוכה) או "combiner" שמחוברים ליציאת עלית פלורסנט. אתה צריך לדעת את גודל הצמצם האחורי לבין העברה (ב blation לייזר באורך גל) של העדשה אובייקטיבי אתה מתכוון להשתמש. ברגע שאתה מחליט על לייזר (למשל, Crylas, לשרוץ, קריסטל, או CRC) אתה צריך ליצור קשר תור או ניופורט לעזרה עם בחירת אלמנטים אופטיים נכונה, ציוד חומרה ובטיחות. החלטנו על ההרחבה הקורה הכפולה גלילי כדי לחסוך מקום, אלא פשוט קפלרי ההרחבה היא אופציה (f2/f1 = גורם הרחבה). ההרחבה קרן אישית יהיה הכי זול, אבל בניופורט, Thor, וכמה יצרני לייזר להציע איכות מעולה מסחרי הקורה expanders. חלק מהיצרנים מציעים גם לייזר attenuators ידני מבוקר אלקטרונית שעשויים להיות העלות האפקטיבית לחסוך מקום, אבל לא תכליתי כמו מקטב Glan-תומפסון ואת גל צלחת וחצי. אתה גם צריך להחליט כיצד לשלוט על לייזר. באפשרותך לעצב בקר LabVIEW מבוסס, להשתמש במחולל מסחרי TTL, או תוכנה המסופקים על ידי החברה לייזר. דונו באפשרויות עם היצרן לייזר ספציפי.

אוהל "> סיפקנו רשימה של החומרה השתמשנו רק כהנחיה כללית. המערכת המתוארת כאן עולה על 15,000 $ כאשר הוסיף מערכת ההדמיה הקיימים שלנו. המחלקה לפיסיקה המקומי שלך לעתים קרובות יהיה מישהו מוכן לתת הקדמה מעשית בבטחה לעבוד עם אלומת לייזרים חינם.

שיטות חלופיות immobilization זמן לשגות הדמיה של C. elegans תוארו לאחרונה. ¹⁴

פתרון בעיות

השלב הקשה ביותר והקריטי הוא יישור של הקורה מורחבת במרכז לציר האופטי של המיקרוסקופ. ברגע שיש לך את אלומת האור ממוקדת והרחיב דרך עדשות הגלילי אתה צריך לעבוד קשה כדי לקבל את זה מיושר בתוך 5 אממ של ציר אופטי של מיקרוסקופ לפני תחילת השימוש במראות ההיגוי יישור הסופי למרכז. שימוש מוגזם המראות היגוי כדי ליישר את הקורה המיקרוסקופ יעברו דרך אותו ציר הקורהההרחבה. שימוש בזהירות רבה אתה יכול להחליש את קרן הלייזר עם מסנן ND המתאים להציג ישירות את פרופיל קרן לייזר על מטרה רפלקטיבית (ראי פני השטח הקדמי). אתה יכול לנדנד בעדינות את המיקרוסקופ למרכז בדיוק את הקורה בתחום 60x המטרה של התצוגה (אם זה לא יכול להיות מרוכז בטווח למעלה למטה / אתה צריך להתאים את גובה המעקה). פרופיל קרן יכול לשמש בדיוק ליישר את ציר מיקרוסקופ אופטי לתת קרן ממוקדת כי הוא עגול "התפרצויות" סימטרי. התלקחות אסימטרית הוא אינדיקציה לכך את ציר מיקרוסקופ אינו מיושר לחלוטין (או המעקה לא ברמה). לבסוף, אתה צריך להתאים L3 ולראות הרחבה אפילו סימטרי והתכווצות של הקורה. פוקוס מיקרוסקופ דווקא על משטח היעד ולאחר מכן להתאים L3 למקד את קרן הלייזר למקום הקטן. כעת אתה אמור למצוא את קרן הלייזר נמצא במרחק 5 אממ המרכז כאשר צילמו באמצעות LSCM או CCD מערכת הנקודה נמצאת בתוך אבלציה1um של המוקד Z.

אם אתה מוצא שאתה "לפוצץ" תולעים או באופן עקבי לייצר בועות cavitation גדול לחתוך אקסונים הבעיה שלך היא ככל הנראה את יישור קנס של הלייזר אבלציה. ודא המינימום (<500nm) במקום אבלציה הוא מקומי למקד את Z (להתאים את ההתכנסות עם עדשה L3) וכן למקום XY נאמנות (להתאים עם מראה רכוב kinematically אחרון).

מיקוד אקסונים קרוב לפני השטח ידרוש פחות כוח לייזר. באופן דומה, בעלי חיים קטנים (L1 ו-L2) ידרוש פחות כוח לייזר axotomy לעומת מיקוד אקסונים זהה אצל מבוגרים.

אם אקסונים בר שלך סוג לא להתחדש או אקונומיקה אקסונים אתה צריך לנסות לצמצם כוח הדמיה לייזר או להקטין את קצב הדגימה. אם תולעים שלך למות או להיות חולני לנסות לצמצם את אחוז agarose בשלבים 1%. ודא שאתה לא העברת coverslip אחרי תולעים הרכבה כמו זה יהיה לעיתים קרובות לגרום להם למות בעת שימוש גבוה לכלcentage agarose ו microspheres.

אם תולעים שלך להתפוצץ או למות במהלך הפגישה זמן לשגות זה בגלל: 1. אחוז agarose הוא גבוה מדי. 2. נזק לציפורן על ידי לייזר אבלציה. 3. תנועת coverslip לאחר הרכבה. אם נזק לציפורן הוא אשם זה ישפיע רק על תולעים רכוב כי כבר ממוקד עם לייזר אבלציה.

אם התולעת שלך נעה יותר מדי במהלך הפגישה זמן לשגות נסה להגדיל את אחוז agarose בצעדים 0.5%. אקסונים בריאה תולעים בריא הם תמיד "פעיל" ולהציג רמה עקבית של הקרינה. אם אתה רואה ירידה פתאומית פלואורסצנטי או פעילות התולעת גוסס או מת. אקסונים חרוזים או מקוטעת מרובות הן סימן בטוח של תולעת גוסס או מת.

אם אתה מתקשה לשמור על אקסונים שלך בפוקוס במהלך הפגישה כל הזמן לשגות ייתכנו בעיות שונות. ראשית לבדוק להיסחף הבמה שלך על ידי הדמיה מדגם אינרטי בשקופית זכוכית מעל 10 שעותrs. להיסחף מיקרון כמה יכול להיות בגלל חוסר יציבות תרמית, אבל יותר מ -5 אממ כנראה בשל בעיות מכניות עם מיקרוסקופ שלך. בעיות עם הרכבה שכיחים יותר. בואו תולעים רכוב שלך לאזן עם מיקרוסקופ הבמה שלך במשך 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות שלך. בדוק חותם וזלין שלך לא לפתח דליפות במהלך ההפעלה זמן לשגות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
535 ננומטר לייזר	Crylas	FDSS532Q3	(לשרוץ, קריסטל, ו CRC מציעים גם לייזרים מקביל)
כל אופטיקה וחומרה			(Thor מציעה אופטיקה דומה וחומרה)
SUPREMA אופטי הר, 1.0-בקוטר	ניופורט	SS100-F2KN	2
1 "פוסט בקוטר 1" גובה	ניופורט	PS-1	1
1 "פוסט קוטר המזלג	ניופורט	PS-F	1
אכרומטי Zero-Order פלייט Wavel, ½ גל פיגור, 400-700nm	ניופורט	10RP52-1	1
שלב סיבוב, 1 "Aperature	ניופורט	RSP-1T	1
1 "פוסט בקוטר 1" גובה	ניופורט	PS-1	1
1 "פוסט קוטר המזלג	ניופורט	PS-F	1
Glan-לייזר מקטב קלציט, 430-700nm	ניופורט	10GL08AR.14	1
סיבוב מקטב הר	ניופורט	RM25A	1
¼ "spacer עבור 1" פוסט בקוטר	ניופורט	PS-0.25	1
½ "גובה, 1" פוסט בקוטר	ניופורט	PS-0.5	1
פורק, 1 "פוסט בקוטר	ניופורט	PS-F	1
קרן Dump	ניופורט	PL15	1
המטרה עדשה מיקרוסקופ הר	ניופורט	LH-OBJ1	1
1 "פוסט בקוטר 1" גובה	ניופורט	PS-1	1
1 "פוסט קוטר המזלג	ניופורט	PS-F	1
High-Energy Nd: YAG לייזר מראה, קוטר 25.4 מ"מ, 45 °, 532 ננומטר	ניופורט	10Q20HE.2	4
SUPREMA אופטי הר, בקוטר 1.0 אינץ', חור אישור הרכבה	ניופורט	SN100C-F	2
דיוק גבוהה Knob בורג כוונון, נסיעות 12.7mm, 100TPI	ניופורט	AJS100-0.5K	4
מתאם נושא, ¼ זכר -20, 8-32 נקבה	ניופורט	SS-1-B	2
רוד קלאמפ עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש	ניופורט	340-RC	2
רוד, 14 אינץ' (35.5 ס"מ) גבוה	ניופורט	40	1
Rail המוביל לכל אורך x26 רבועים, 40mm	ניופורט	CN26-40	4
Steel Rail, 384mm (15 ") אורך	ניופורט	X26-384	1
רוד פלטפורמה עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש	ניופורט	300-P	2
רוד, 14 אינץ' (35.5 ס"מ) גבוה	ניופורט	40	2
Plano-עדשה קעורה, בקוטר 12.7mm, 25mm-EFL, 430-700nm	ניופורט	KPC025AR.14	2
Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 50.2mm EFL, 430-700nm	ניופורט	KPX082AR.14	1
Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 62.9mm EFL, 430-700nm	ניופורט	KPX085AR.14	1
עדשה קבועה בהר, 0.5 ", בקוטר 1.0" גובה הציר	ניופורט	LH-0.5	2
עדשה קבועה בהר, 1.0 "קוטר, 1.0" גובה הציר	ניופורט	LH-1	2
Microspheres 0.1um	Polysciences	00876
Agarose	RPI	A20090	EEO בעניינים
Muscimol	סיגמא	M1523