Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

Resumo

Laser axotomia seguido por lapso de tempo de gravação é uma maneira sensível ao ensaio os efeitos das mutações no C. elegans Sobre a regeneração do axônio. A alta qualidade, mas barato, laser sistema de ablação pode ser facilmente adicionado a maioria dos microscópios. Lapso de tempo de imagem mais de 15 horas exige imobilização cuidadosa do worm.

Resumo

Laser axotomia seguido por microscopia de lapso de tempo é um ensaio sensível para a regeneração do axônio fenótipos em C. elegans ^1. A principal dificuldade deste ensaio é o custo percebido (US $ 25-100K) e conhecimentos técnicos necessários para a implementação de um sistema de ablação a laser ^2,3. No entanto, lasers de estado sólido de pulso de custos modestos (<$ 10K) pode fornecer um desempenho robusto para ablação a laser em preparações transparente, onde os axônios alvo são "próximas" à superfície do tecido. Construção e alinhamento de um sistema pode ser realizado em um dia. O caminho óptico fornecido pela luz do condensador focado para o laser de ablação fornece um guia de alinhamento conveniente. Um módulo intermediário com todos os óptica removido pode ser dedicado a ablação a laser e garante que nenhum dos elementos ópticos precisam ser movidas durante uma sessão de ablação por laser. A dicróicas no módulo intermediário permite gravação simultânea e ablação a laser. Centralizar o feixe de laser to feixe de saída a partir da lente focada microscópio condensador orienta o alinhamento inicial do sistema. A variedade de lentes são usadas para condicionar e expandir o feixe de laser para encher a abertura parte de trás da lente objetiva escolhido. Alinhamento e ensaios finais é realizada com uma superfície espelhada frente alvo lâmina de vidro. Potência do laser é ajustada para proporcionar um ponto de ablação tamanho mínimo (<1um). O local da ablação é centrado com ajustes finos do espelho última cinematicamente montado para uma mira fixa na janela de imagem. Laser de energia para axotomia será de aproximadamente 10X maior do que o necessário para o ponto mínimo de ablação no slide-alvo (isto pode variar com o destino que você usa). Worms pode ser imobilizado por laser de axotomia e lapso de tempo de imagem através da montagem de blocos de agarose (ou em câmaras microfluídicos ^4). Almofadas de agarose são facilmente feitas com 10% de agarose em solução salina equilibrada derretido em um forno de microondas. Uma gota de agarose fundida é colocado numa lâmina de vidro e achatado com outrolâmina de vidro em um bloco de cerca de 200 um de espessura (uma única camada de fita de tempo em lâminas adjacentes é usado como um espaçador). A "Sharpie" cap é usado para cortar um bloco de diâmetro uniforme circular de 13mm. Anestésico (1ul Muscimol 20mM) e microesferas (Chris comunicação fang Yen-pessoais) (2,65% 1ul Poliestireno 0,1 hm em água) são adicionados ao centro do painel seguido de 3-5 worms orientados para que eles estão mentindo em seus lados esquerdo. A lamela de vidro é aplicada e depois vaselina é usada para selar a lamela e evitar a evaporação da amostra.

Protocolo

1. Construção de um sistema de ablação a laser

Use óculos de segurança laser e use boas práticas de segurança do laser durante o alinhamento inicial. Nunca olhe através do oculares quando o laser está ligada.

1. Disponha os componentes na breadboard como mostrado na figura. 1 (ver também o exemplo ^2). Parafuso para baixo a laser (com uma placa de riser, se necessário), pós periscópio, e os suportes trilho elevado.
2. Posição de seu microscópio para se alinhar com o eixo ferroviário. Alinhar com o feixe de luz transmitido a partir da lente condensador do microscópio. Alinhe a altura do trilho (use um nível) e na posição com uma abertura ajustável ou uma lente de aposta no transporte ferroviário. A abertura ou as lentes devem ser alinhados em ambas as extremidades do trilho para o feixe de condensador. Tomadas de laboratório pode ajudar com o ajuste de altura ferroviário.
3. Alinhar o polarizador Glan-Thompson e meia onda chapa para o feixe de laser. Você não precisa o laser para fazer este alinhamento. O beam apenas precisa passar por tanto sem bater suas bordas. Gire o polarizador de fornecer uma orientação conveniente e posição para o despejo do feixe (fig.1). Você vai rodar a placa de meia onda para ajustar a potência do laser. Seguro os componentes ao breadboard.
4. Ligue o laser, definir a freqüência de pulso a 100, modo contínuo, e reduzir ao mínimo o poder usando a placa de meia onda. Usar uma nota de Post-It ou papel de lente para visualizar o feixe de laser.
5. Ajustar e corrigir os espelhos cinematicamente montados em seqüência a partir do laser para trazer o feixe até o espelho que é montado na extremidade do trilho elevado. O feixe de laser deve estar alinhado aproximadamente ao centro dos espelhos. Os espelhos devem ser orientadas cerca de 45 graus em relação ao eixo do feixe laser (fig. 1).
6. Grosseiramente ajustar o espelho cinematicamente montado no topo do periscópio e sobre o fim do transporte ferroviário para alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitidos a partir do microscópio. Tanto o feixe de laser e tele transmitiu feixe de luz do microscópio pode ser simultaneamente visualizadas por inserir papel no caminho do feixe. Certifique-se de quaisquer filtros ND e aberturas no módulo intermediário estão fora ou totalmente aberto.
7. Finamente alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com os ajustes finos no topo do periscópio e espelhos ferroviário. Segure o papel perto do espelho ferroviário e alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com o espelho periscópio topo. Segure o papel perto do porto de microscópio e alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de luz transmitida com os ajustes ferroviário espelho (fig.2).
8. Posição de um post-it no caminho do feixe entre a lente condensador alinhados ea torre objetivo aberta. Você deverá ver o feixe de luz transmitido com o feixe de laser menores perto do centro. Use os ajustes finos no espelho ferroviário para o centro do feixe de laser. Corrigir o microscópio no lugar com grampos.

Os passos 10,9-1,12 são opcionais, mas é fácil e útil para avaliar o alinhamento e ablação a laser antes de adicionar as lentes feixe de expansão.

9. Desligar o laser e envolver o obturador de segurança mecânica. Gire para fora dicróicas de 50% do caminho do feixe. Mesmo que nenhuma luz direta a laser passará para o oculares, a luz refletida pode ser bastante intensa. Montar o slide de destino para o alinhamento fino e imagem, com o objetivo de petróleo 60X. Concentre-se em arranhões no slide. Coloque no ND4 e ND8 filtro no módulo intermediário.
10. Deslize a imagem do alvo com seu CLSM, disco Spinning, ou sistema de câmera CCD. Gire o dicróicas de 50% para o caminho do laser. Partir deste ponto, você nunca deve olhar através oculares enquanto o laser de ablação está ligado. Ligue o laser de ablação e definir o modo como desencadeada freqüência, a 100, eo número de pulso a 10. Certifique-se o poder ainda está definido para o mínimo com a placa de meia onda e depois abrir o obturador de segurança mecânica. Você pode simultaneously imagem e use o laser de ablação.
11. Enquanto imagens do slide-alvo, disparar o laser de ablação. Verifique se o slide de destino para um local hum ablação 1-10 de diâmetro. Seqüencialmente remover filtros ND até o local da ablação é visto. Ajustar o ponto de ablação para o centro da imagem com o espelho ferroviário. Você vai querer voltar a adicionar um filtro ND para ter espaço para aumentar a potência do laser finamente com a placa de meia onda para dar a <1 spot ablação um. Imagem em 0,2 hm / pixel ou menos e finamente ajustar o local da ablação para o centro da imagem (posição 256256, com 512x512 imagem).
12. Verificar a profundidade de foco e eixo do feixe laser. Foco cima e para baixo 1-2 hum e verifique a posição de ablação e tamanho do ponto de ablação. Se o feixe de laser é axialmente alinhados do ponto de ablação não se moverá. O feixe de laser incondicionado vai distribuir poder sobre hum vários (cerca de 3-5 hum de cima para baixo de foco).

2. Adicionar lentes para expandir o feixe de laser para preencher o objectivo de voltaabertura e ajuste de convergência para controle de foco

1. Este sistema utiliza dupla Galileu feixe de expansores para expandir o feixe de laser para encher a abertura de trás do objetivo (10 mm). Monte a 4 lentes para operadoras e anexá-los ao trilho (L1f1 + L2f2 e L3f1 '+ L4f2'). Ajustar as posições para que todas as lentes estão no mesmo eixo óptico e exatamente ortogonal ao feixe de laser (fig. 2).
2. Ligue o laser e ajustá-lo para o mínimo de energia e de modo contínuo. Cerca de ajustar o alinhamento do feixe através de cada lente usando papel para ver o feixe de laser e transmitida feixe de luz a partir do condensador do microscópio. Desligue e obturador a laser.
3. Remova os grampos de um lado do microscópio e deslize o microscópio para fora do caminho do feixe laser. Ligue o laser e remover do obturador de segurança.
4. O alinhamento fino das lentes e do feixe de laser pode ser realizada através da visualização do feixe de laser expandida em uma parede próxima. O feixe deve se expandir e contrair simetricamente quando o leNSES são movidos. Ajustar os últimos dois espelhos cinematicamente montado para alinhar o feixe (fig.3).
5. O perfil do feixe alinhado e expandido deve ser circular e de brilho uniforme (fig.3). O tamanho e uniformidade do feixe pode ser visto com um post-it na posição estimada da abertura traseira objetivo.
6. O feixe deve ser ajustado para zero de convergência para sistemas infinito óptico. Convergência pode ser estimado observando como as mudanças de tamanho feixe de como você mover um post-it mais longe das lentes. Desligar o laser e envolver o obturador mecânico.
7. Deslize o microscópio de volta para o caminho do feixe de laser usando os grampos fixos para definir o alinhamento correto. Substituir os grampos no lado livre de microscópio, mas não aperte para baixo.
8. Ligue o laser e remover o obturador de segurança. Girar a torre objetivo de uma posição aberta. Colocar um post-it no palco. Você deve ver o feixe de laser expandida e uniforme centrado na luz transmitida beam do condensador (fig.4). Você pode precisar para centralizá-la soltando os grampos microscópio e com cuidado empurrando o microscópio.
9. Envolver o obturador de segurança, e definir o laser para acionar o modo. Gire o objetivo 60X no lugar e imagem da superfície de arranhões no slide-alvo.
10. Remover o obturador de segurança, acionar o laser de ablação e ajustar a potência do laser para o ponto mínimo de ablação. O local da ablação deve ser circular e dentro de hum 10/05 do centro da imagem.
11. Centro o ponto de ablação com ajustes finos de espelho ferroviário cinematicamente montado. Você precisará ajustar o iterativamente montado ferroviário e espelho periscópio superior ao centro o ponto de ablação e manter um perfil de luz uniforme.
12. Avaliar o foco do laser Z movendo o foco sistematicamente cima e para baixo em passos de 1 hum e desencadeando o laser de ablação. O feixe expandido, alinhados, e convergência ajustados devem extirpar ao máximo no foco da imagem e fracamente ou não em todos ab 1 umove ou abaixo de foco (fig. 5).
13. Ajuste o foco Z do feixe expandido movendo lente L3 do telescópio de Galileu (fig.2).

3. Laser axotomia e lapso de tempo a microscopia de regeneração do axônio

1. Microondas Agarose 10% (RPI Molecular Biology Grade EEO 0,1 A20090) em solução salina equilibrada até totalmente derretida. Defina em uma chapa quente para mantê-lo derretido durante o uso para montagem.
2. Uma gota de agarose fundida é colocado numa lâmina de vidro e achatado com outra lâmina de vidro em um bloco de cerca de 200 um de espessura (uma única camada de fita de tempo em lâminas adjacentes é usado como um espaçador).
3. A tampa de marcador "Sharpie" é usado para cortar um bloco de diâmetro uniforme circular de 13mm.
4. Anestésico (1ul Muscimol 20mM) e microesferas (Chris Fang-Yen, comunicação pessoal) (2,65% 1ul Poliestireno 0,1 hm em água) são adicionados ao centro do painel seguido de 3-5 worms orientados para que eles estão mentindo em seus lados esquerdo . A lamela de vidro é aplicada e depois Vaseline é usado para selar a lamela e evitar a evaporação da amostra (fig.6).
5. O laser de ablação está alinhada com mira, como descrito acima, no início de cada sessão. Envolver o obturador de segurança laser.
6. Remover o destino de alinhamento a laser e uma imagem de verme adulto montado com um marcador fluorescente apropriado nos neurônios alvo. Axônios imagem com uma ampliação semelhante (0,2 hm / pixel ou maior ampliação) e posição sob a mira (fig.7).
7. Abrir o obturador de segurança laser e acionar o laser de ablação, enquanto imagem. Avaliar o axônio após desencadear a laser e lentamente aumentar potência do laser até o axônio é cortado. Você vai precisar de cerca de 10X mais potência do laser para cortar os axônios do que para formar um ponto de ablação no slide alvo de alinhamento (cerca de 1uJ / ns pulso). Normalmente, cortado com 100 pulsos em 2,5 kHz e poder definir a cerca de 0.27mW (potência média medida na amostra com o medidor de energia coerente FieldMaxII e laser contínuo definido para a 2500 Hz). A ablaçãolaser de potência serão consistentes para o corte de axônios em experimentos futuros (fig.7).
8. Um axônio com sucesso corte irá mostrar uma pausa de cerca de 0,5-1 hum sem perda de brilho nas duas extremidades cortadas (fig.7). Uma grande perda de brilho ou uma grande diferença (2-10 um), muitas vezes significa grandes danos além do axônio por uma bolha de cavitação. Os axônios proximal e distal irá separar e formar bulbos retração nos próximos 30 minutos (fig. 8 e Filme).
9. Equilibrar o seu worms montado com o seu estágio do microscópio por 30 minutos antes de iniciar a gravação de lapso de tempo. Isso irá minimizar deriva devido a diferenças de temperatura e contração de agarose.
10. ) Parâmetros Time-lapse de imagens são criadas usando o software de imagem associada ao seu sistema. Normalmente, as etapas de imagem 20/10 Z (1um/step) em 0,1-0,2 hum / pixel usando ganho, pinhole, taxa de varredura, e as configurações de imagem potência do laser que minimizem a exposição ao dar a resolução desejada espacial. Intervalos de amostragem são típicosly 1-5 minutos mais de 15 horas, dependendo da resolução desejada temporal (fig. 8 e Filme).
11. Dados de lapso de tempo de imagem são convertidos em filmes com elementos NIS ou ImageJ.

4. Resultados representativos:

Laser axotomia usando este sistema é confiável e de rotina. Os resultados mostrados na figura 7 são típicas. Lapso de tempo de imagem de regeneração do axônio é muito robusto usando esse protocolo. Nós rotineiramente cortado e imagem até 5 axônios em 5 worms diferentes em um único slide usando um palco motorizado. A única limitação é o tempo que leva para coletar as imagens de cada axônio, por exemplo, se leva 20 segundos para coletar uma pilha para um axônio, em seguida, no máximo, você pode provar 9 axônios (9 pilhas) se você estiver de amostragem a cada 180 segundos. O exemplo mostrado nas Figuras 8 e 9 é um resultado bom representante. Cerca de 10% dos experimentos dão resultados desta qualidade. Os experimentos restantes fornecem bons dados sobre o fenótipo de regeneração, mas são esteticamente unappealção por causa de pequenos movimentos jittering do worm, que geralmente começam após 5-8 horas de imobilização.

Figura 1 sistema de ablação por laser. O Nd nm 532: Yag laser é montado em uma placa de riser para trazê-la à altura dos outros componentes e aparafusado ao breadboard. (Isolador óptico é opcional e, provavelmente, não é necessário). O polarizador Glan-Thompson e meia onda placa são usados ​​para controlar finamente a potência do laser. Eles estão em montagens de rotação finamente calibrada. Tome cuidado para definir o despejo do feixe. O espelho de canto dirige o feixe de laser para o espelho inferior periscópio. O espelho periscópio superior dirige o feixe para o espelho ferroviário. O trilho é montada em duas plataformas da haste apoiada. Dupla lentes de Galileu estão ligados a suportes trilho deslizante. Observe o módulo adicionado intermediária dedicada ao laser de ablação. O sistema poderia ser mais compacto, removendo o isolamento ópticotor eo espelho de canto, e reposicionamento do laser, Glan-Thompson polarizador e placa de meia onda para a borda traseira da breadboard.

Figura 2 Dual lentes condicionado Galileu são usados ​​para expandir os 300 hm TEMoo feixe de laser a uma convergência de zero tamanho uniforme de 10 mm. A tomada de laboratório é posicionado sob uma das plataformas de exploração do trilho. Isso ajuda no ajuste da altura do trilho durante as etapas de alinhamento. Cruamente ajustar a altura ferroviário montando a lente L1 ao trilho e usando o feixe de condensador como um guia de alinhamento. Ajustar o trilho de modo que o feixe de condensador alinha ao centro da lente em ambas as extremidades do trilho. Isso irá garantir o trilho está alinhado paralelamente ao eixo óptico do microscópio. Você pode precisar ajustar o primeiro microscópio para coincidir com o eixo óptico do trilho. Use grampos para fixar a posição do microscópio (vide fig. 1). Remover ªe ferroviário montado lente. Agora alinhar o feixe de laser para o centro do feixe de condensador em ambas as extremidades do trilho. Um artigo no caminho do feixe é uma maneira conveniente de ver os dois feixes simultaneamente. Use o espelho periscópio top para alinhar o feixe de laser para o feixe de condensador próximo ao espelho instaladas sobre carris. Use o trilho montado espelho para alinhar o feixe de laser para o feixe de condensador no extremo do trilho (mais próximo ao microscópio). Agora montar todos os quatro lentes para o trilho, como mostrado na figura. O comprimento do trilho, o comprimento focal das lentes, bem como as modalidades de lente irá variar dependendo do seu microscópio e set up físico. Parâmetros críticos são o diâmetro do feixe laser eo tamanho da abertura de trás do objetivo escolhido. Sistemas infinito óptico irá focar um feixe de laser perfeitamente paralelos (zero de convergência). Distância entre L1 e L2 devem ser soma das lentes de distâncias focais, f1 + f2, e distância entre L3 e L4 deve ser correspondentemente f1 '+ f2 ". A distância entre ªpares e dupla Galileu não é crítica. Posição de L3 podem ser finamente ajustados para controlar a convergência do feixe; ajustes <1mm será necessário para ajustar o foco do laser para o foco da imagem. Certifique-se de remover todas as lentes, filtros, aberturas, etc a partir do módulo intermediário que pode estar no caminho do feixe (ou estar cientes do que fazem e ajustar o seu sistema em conformidade).

Figura 3 Alinhamento do feixe de laser através das lentes dupla Galileu. Remova os grampos microscópio de um lado do microscópio para o microscópio pode ser movido para fora do caminho do feixe, mas os grampos restantes permitirá que o microscópio para ser precisamente reposicionada. Pense na segurança laser. Certifique-se que a potência do laser é ajustada para um mínimo com o polarizador Glan-Thompson. Ligue o laser e exibir o padrão de feixe de laser na parede. Você pode encontrar um papel colado na parede ajuda a visualizar o laserspot. Sistematicamente ajustar as posições das lentes para começar uma sensação para o que eles fazem com o tamanho do feixe e aparência. Você deve ver algo que se parece com painel A, onde o local é intensa excentricamente localizada em um perfil de dimmer. Use o espelho montado em trilho para ajustar o ponto forte para o centro, como mostrado no painel B. Agora use o periscópio montado na parte superior do espelho para dar um perfil uniforme periféricos. Se tudo estiver alinhado corretamente, você agora deve achar que movimentação das lentes faz com que o feixe de expandir e contrair de forma simétrica. Mover as lentes de volta para as posições de partida, como mostrado na figura 2. Agora interceptar o feixe a uma distância da abertura traseira objetivo. Deve ser circular, pelo menos, grande o suficiente para encher a sua abertura para trás, e de um brilho uniforme. É OK se for maior, contanto que você tem poder suficiente para o seu laser de ablações. Avaliar a convergência, comparando diâmetro do feixe na distância da abertura da volta objetiva e na parede. Diâmetro do feixe deveser idêntico para um feixe de convergência zero. Barra de escala é de 10mm.

Figura 4 Alinhamento do feixe de laser expandida para o feixe de condensador. Obturador e mover o laser do microscópio de volta para o caminho do feixe de laser usando as garras como paradas de alinhamento. Ligue, alinhar e focar o feixe do condensador utilizando um papel para lentes. Tape objetivo sobre o oculares para evitar que alguém de ver a luz do laser intensa refletida. Girar a torre objetivo de uma posição aberta. Coloque um pedaço de papel no palco para ocluir o feixe de condensador. Ligar o laser de modo contínuo e remover o obturador de segurança mecânica. Você deverá ver um pouco de luz a laser vindo embora o microscópio. Solte os grampos microscópio e delicadamente nudge o microscópio para alinhar o feixe de laser com o feixe de condensador. O feixe de laser deve ser circular e de brilho uniforme. Às vezes é útil para adjuª o trilho montado lentes. Você deve ser capaz de se expandir e contrair o feixe de laser uniformemente se o alinhamento está correto. Você pode centralizar o feixe de laser contratada para o feixe de condensador mínimo centrada com o espelho montado em trilho e depois expandi-lo para o tamanho desejado. Uma vez que você ajustar a posição do feixe de contrato com o espelho ferroviário, você terá de reajustar o espelho periscópio montado na parte superior para manter um brilho uniforme do feixe expandido. Se você não puder obter um feixe de laser circular centrado, então você terá que voltar com as etapas anteriores de alinhamento.

Figura Center 5 a mancha de ablação e ajustar a convergência do feixe de laser para focagem. Desligue e obturador a laser. Retire o papel e montar o slide-alvo espelhado (você também pode usar tinta de marcador permanente em uma lamela como meta ^2). Arranhões imagem na superfície espelhada com os 60X lente de óleo 1.4na) Agora a imagem da superfície com uma confocal ou CCD. Não olhe através do oculares enquanto o laser está ligada. Ligue e unshutter a laser. Definir o laser para acionar o modo, menor consumo de energia, e 100 Hz. Acionar cerca de 10 pulsos. Você deverá ver um local de ablação de 1-5 um de diâmetro dentro de 10 um do centro de visão. Se você não vê um local de ablação você pode aumentar a potência do laser em passos de 5-10%. Depois de identificar o local da ablação, centro-la para o campo de visão. Colocar a cruz em 256, 256 coordenadas se a visualização de imagens 512x512. Se você ajustar o ponto do laser para o centro, então não vai mudar de posição com o zoom. Use o espelho montado em trilho para mover o ponto de ablação para a mira centro. Reavaliar a uniformidade do feixe de laser ao olhar para o feixe com o objetivo removido, como descrito acima na Figura 4. Ajustar a uniformidade do feixe com o espelho superior periscópio montado. Repita a avaliação da posição à vista de ablação. Este é um processo iterativo process que deve ser repetido até o local da ablação é centrado eo feixe expandido é uniforme. Se feito corretamente o local da ablação será circular como se vê no local da ablação em Foco na figura. Em seguida avaliar o foco do feixe de laser no eixo Z. Acionar o laser para produzir um ponto de ablação de cerca de 1 um no centro. Agora mova a lâmina de cerca de 5 hum lateralmente e 1 um foco abaixo da superfície da lâmina alvo. Acionar o laser usando as configurações mesmo laser que você usou para o local da ablação em primeiro lugar. Repita depois de focar um hum acima da superfície da lâmina alvo. Se o feixe de laser é focado para o foco da imagem, então você deve ver um padrão semelhante ao mostrado nesta figura. O ponto maior de ablação deve corresponder ao foco da imagem e os pontos de ablação acima e abaixo foco deve ficar menor simetricamente. Ajuste da lente L3 para alinhar planos focais. Movimento da lente L3 longe do microscópio fará o feixe mais convergentes e local da ablação vai aproximar-seo objetivo. Pequenos ajustes <1mm serão necessários perto de foco. Agora você está pronto para cortar axônios. Barra de escala é de 1 um.

Figura 6 worms de montagem para a laser axotomia e lapso de tempo de imagem. Agarose 10% em solução salina é aquecida até derreter totalmente. Uma pequena gota é colocada sobre uma lâmina de vidro e então achatado, com outro slide para formar um bloco de apartamento. A espessura da almofada é definido por fita em duas lâminas adjacentes. A almofada é permitido para definir por cerca de 1 minuto e, em seguida, as lâminas são separados. A "Sharpie" top é usado como um cortador de biscoitos para formar um bloco uniforme de tamanho de cerca de 13 milímetros. 1 ul de 10mm Muscimol e 1 ul de microesferas são adicionados ao centro do painel (Fang Yen-comunicação pessoal). Worms são adicionados à queda de 2 ul e orientado antes de colocar a lamela de vidro. Vaselina é aplicada a partir de uma seringa (20-25 ga agulha.) Até à extremidade da lamela para selá-lo.

Figura 7 resultados típicos de laser axotomia em C. elegans. Em A você pode ver o axônio intacta pouco antes e depois do laser axotomia. A diferença é normalmente cerca de 0,5-1um. B mostra a laser axotomia de um axônio sem danificar um axônio próximo cerca de 1 hum distância. Laser foi ajustado para cerca de 10% de energia (0,3 MW médios em 2500 Hz), e 100 pulsos. Barra de escala é de 5 um.

Figura 8. Tipo selvagem típicos L4 regeneração. Esta é uma série de tempo, mostrando a ablação e lapso de tempo de gravação de regeneração do axônio. Logo após a laser axotomia em 0 minutos, você pode ver o bulbo de retração. Por 138 minutos, o bulbo de retração tem puxado de volta à sua mais distante extensão e agora começou a remodelar. Saliências membrana esporádica (mircospikes ou filopodia) pode ser visto ao longo do eixo do axônio (setas 138 e 324). Ocoto direito se estende um cone bem formado crescimento compacto com 360 minutos. Em 414 minutos ambos os cotos estenderam cones de crescimento. Inicial cones embrionárias-like growth se distróficas como eles estendem em direção ao cordão nervoso dorsal (414, 519 e 597 minutos). O distróficos crescimento stall cones curta do cordão nervoso dorsal (960 minutos). Setas apontam coto proximal e cones de crescimento. Setas apontam saliências membrana ao longo do eixo do axônio proximal. Bar 20um escala.

Movie 1. Filme de regeneração do axônio tipo selvagem. Este filme vai junto com os pontos de tempo mostrado na Figura 8. Worms foram montados conforme descrito no protocolo e axônios foram fotografadas a cada três minutos por cerca de 10 horas. Z pilhas (20 X 1um) foram tomadas em cada momento e se fundiram em imagens individuais por um algoritmo de projeção máxima (Elements NIS). Clique aqui para assistir o filme.

Discussão

Existem várias boas discussões de microcirurgia laser com sistemas de laser diferentes ^3,5-11. Lasers de femtossegundos IR são o "padrão ouro" para ablação a laser subcelulares ¹² e conveniente se associado a um mecanismo de imagem, mas são muitas vezes demasiado caros para usuários individuais. Se você precisar de um laser de femtossegundos IR para imagens de sua amostra por causa da profundidade da imagem, então você provavelmente precisará de um para o laser axotomia. Tecidos transparentes com axônios alvo dentro de 30-50 hum da superfície são provavelmente viável com lasers de pulso azul e verde na faixa de 20 UJ / pulso direcionados através de uma lente de alta imersão na. Haverá mais danos colaterais com o nano e pico lasers segundo em comparação com o laser de femtossegundos, especialmente como a profundidade dos aumentos axônio alvo. C. elegans é transparente e todos os axônios estão dentro de 20-30 hum da superfície. Rotineiramente corte axônios motores que são dentro de 5 hum da superfície. Temos também facilmente cortar machadoons dentro do anel nervosas que são cerca de 20 hm a partir da superfície da cutícula. Encontramos o limite para o corte de axônios em cerca de 30-50 hum através do diâmetro de um verme adulto. É provável que o sistema de ablação a laser descrita aqui seria muito bem com muitas preparações diferentes que se ajustam aos critérios de transparência e profundidade de axônios alvo. Ainda assim, é um pouco surpreendente, dadas as vantagens teóricas dos lasers de femtossegundos IR, que nano e picosegundo 355 nm e 532 nm lasers executar tão bem para o laser axotomia em C. elegans ^6,13. Não vemos diferenças na regeneração do axônio em resposta ao laser axotomia com nanossegundo 440 nm, 532 nm nanossegundo, e lasers de femtossegundos IR.

Lasers de estado sólido 355 nm UV são sobre o mesmo custo que o diodo de 532 nm bombeado passivamente Q-Switched laser de estado sólido, mas exigem poderes para mais ou ótica que passam de forma eficiente estes comprimentos de onda mais curto. A maioria das ópticas são projetados para um bom desempenho com 400 visível -700 nm de luz. 355 nm lasers ofereceria algumas vantagens, tais como limiar ⁶ plasma reduzido, menor tamanho do local, e um passe longo dichroic seria eficiente direta de 100% do laser ablação para o alvo e permitir gravação simultânea de GFP sem perda de sinal da amostra. 440 nm lasers azuis manteria as vantagens de trabalhar com um laser de luz visível (o bom desempenho com a óptica padrão e de segurança). Infelizmente, o custo de um DPP Q-switched de estado sólido de 440 nm do laser é 3 vezes o custo de um laser de 355nm ou 532 nm de poder similar neste momento. Se nós estivéssemos projetando um novo sistema para C. elegans, onde a profundidade-alvo é mínima, poderíamos optar por uma lente UV transparente (custou cerca de US $ 3.000 para uma lente de óleo 40X 1.3na com 50-70% de transmitância em 355nm) e um laser de 355 nm produzindo UJ 10/05 / pulso a 1 kHz -20.

Ablação axônio é pensado para ser devido à formação de plasma. Pulsos curtos produzirá limiares plasma em baixa potência e os volumes de plasma w doente ser menor ^6. O objetivo é produzir o plasma menor e mais curto de vida, ajustando a energia de pulso para o menor poder. Maiores de longa duração plasmas irá gerar bolhas de cavitação que os danos que envolve as células. Temos encontrado geralmente que a ablação utilizando cerca de 50-100 pulsos na freqüência mais alta (isto é, 2,5 kHz) dá os melhores resultados. Isto sugere que os danos podem ser gradualmente integrada sobre uma série de pulsos para controlar melhor a extensão dos danos. O sistema de ablação a laser descrita aqui é muito perdoar se o feixe esteja alinhado e expandido com precisão. Começamos corte axônios em vermes adultos em potência do laser de 10% (média de 0,3 mW medido em 2500 Hz e cerca de 1 UJ / pulso) e pode cortar com danos localizados limitada pelo poder de 14%. Você pode observar áreas maiores de dano 15-39% de potência do laser, mas só acima do poder de 40% (cerca de 1 MW médios medidos em 2500 Hz) fazer o worms explodir devido a bolhas de cavitação e grandes danos à cutícula do verme.

e_content "> O Steinmeyer et al. 2010 de papel ² é um excelente recurso para a construção de um sistema de ablação por laser. Leon Avery também tem uma boa descrição prática de um sistema de ablação a laser baseado em um laser de gás N2 barato nm 337 e ele fornece algumas práticas grande conselho (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Ao projetar seu próprio sistema você deve primeiro conversar com o seu representante microscópio para determinar como alvo o laser ablação para a objetiva do microscópio. Seu microscópio deve ser montado sobre uma mesa de isolamento de vibração (Newport, TMI, Thor). A top breadboard é o ideal, mas uma parte superior de aço sólido ainda pode ser usado com posicionadores magnético. Um módulo dedicado intermediário em um escopo de pé é bom porque todos os elementos ópticos podem ser deixados no local. No entanto, ele pode ser menos caro e mais conveniente usar uma porta da câmera (invertido) ou um "combinador" ligado a uma porta de epi-fluorescente. Você precisa saber o tamanho da abertura para trás e para a transmissão (ao um blation laser de comprimento de onda) da lente objetiva que você pretende usar. Depois de decidir sobre um laser (por exemplo, Crylas, TEEM, Crystal, ou CRC), você deve entrar em contato Thor ou Newport para ajudar com a seleção correta dos elementos ópticos, equipamentos de hardware e segurança. Decidimos em um expansor de feixe duplo de Galileu para economizar espaço, mas uma simples expansão de Kepler é uma opção (f2/f1 = fator de expansão). Um expansor de feixe personalizado será menos caro, mas Newport, Thor, e vários dos fabricantes de laser oferecem uma excelente qualidade comercial feixe de expansores. Alguns fabricantes também oferecem a laser atenuadores manual e eletronicamente controlado, que pode ser rentável e economia de espaço, mas não tão versátil como o polarizador Glan-Thompson e placa de meia onda. Você também precisa decidir como controlar a laser. Você pode projetar um controlador baseado em LabView, use um gerador de TTL comercial, ou software fornecido pela empresa laser. Discutir as opções com o fabricante de laser específico.

tenda "> Nós fornecemos uma lista de hardware que temos usado apenas como um guia geral. O sistema descrito aqui custa cerca de $ 15.000, quando adicionado em nosso sistema de imagem existente. O departamento de Física locais, muitas vezes, tem alguém disposto a oferecer uma introdução prática ao com segurança trabalhando com lasers de feixe livre.

Métodos alternativos para imobilização e lapso de tempo de imagem de C. elegans foram recentemente descritos. ¹⁴

Solução de problemas

O passo mais difícil e crítica é o alinhamento do feixe centrado expandiu-se para o eixo óptico do microscópio. Depois de ter o feixe centrado e expandido através das lentes de Galileu que você deve trabalhar duro para obtê-lo alinhado dentro de 5 de hum eixo óptico do microscópio ANTES de usar os espelhos de direcção para o alinhamento final para o centro. Uso excessivo dos espelhos de direção para alinhar o feixe para o microscópio vai movê-lo fora do eixo através do feixeexpansor. USANDO EXTREMO CUIDADO você pode atenuar o feixe de laser com o filtro ND apropriado e visualizar diretamente o perfil de feixe de laser sobre um alvo refletivo (espelho de superfície frontal). Você pode gentilmente empurrar o microscópio com precisão centro do feixe no campo objetivo 60X de vista (se ele não pode ser centrada para cima / para baixo faixa que você precisa para ajustar a altura do trilho). O perfil do feixe pode ser usado para alinhar precisamente o eixo microscópio óptico para dar um feixe centrado que é circular e "flares" simetricamente. Um alargamento assimétrico é uma indicação de que o eixo do microscópio não está perfeitamente alinhado (ou o trilho não é nível). Finalmente, você deve ajustar L3 e ver uma expansão ainda e simétrica e contração do feixe. O foco do microscópio precisamente sobre a superfície do alvo e depois ajustar L3 para focar o feixe de laser para o menor ponto. Agora você deve achar que o feixe de laser é dentro de 5 hum do centro quando fotografada através LSCM ou sistema CCD eo local está dentro de ablação1um de foco Z.

Se você achar que você está "explodindo" worms ou consistentemente gerar bolhas de cavitação grande para cortar axônios seu problema é mais provável que o alinhamento fino do laser de ablação. Certifique-se que o mínimo (<500nm) no local da ablação é localizada ao foco Z (ajustar a convergência com L3 lente) e para o local XY fiduciária (ajustar com espelho cinematicamente montado passado).

Segmentação axônios mais perto da superfície vai exigir menos energia laser. Da mesma forma, animais menores (L1 e L2) irá requerer menos energia do laser para axotomia em comparação com a segmentação dos axônios mesmo em adultos.

Se o seu axônios de tipo selvagem não se regeneram ou a lixívia axônios você deve tentar reduzir a potência do laser de imagens ou diminuindo a taxa de amostragem. Se o seu worms morrem ou ficam doentes tente reduzir o percentual Agarose em passos de 1%. Verifique se você não está movendo a lamela após worms montagem como esta, muitas vezes, levá-los a morrer ao usar alta porpercentual de agarose e microesferas.

Se o seu worms estourar ou morrer durante uma sessão de lapso de tempo é devido a: 1. Percentual de agarose é muito alto. 2. Danos à cutícula ablação por laser. 3. Movimento de lamela após a montagem. Em caso de danos à cutícula é a culpa será só afetam worms montada que têm sido alvo com o laser de ablação.

Se o seu verme se move muito durante uma sessão de lapso de tempo tentar aumentar o percentual de agarose em passos de 0,5%. Axônios saudável em vermes saudáveis ​​são sempre "ativo" e apresentar um nível consistente de fluorescência. Se você ver uma diminuição súbita da fluorescência ou atividade do worm está morrendo ou morto. Múltiplos axônios de contas ou fragmentados são um sinal certo de um worm morrendo ou morto.

Se você tiver problemas para manter seus axônios em foco durante toda a sessão lapso de tempo, pode haver vários problemas diferentes. Primeiro verifique a sua fase de drift por imagem uma amostra inerte sobre uma lâmina de vidro com mais de 10 hrs. A deriva poucos microns pode ser devido à instabilidade térmica, mas superior a 5 hum é provavelmente devido a problemas mecânicos com seu microscópio. Problemas com a montagem são mais comuns. Deixe sua worms montado equilibrar com o seu estágio do microscópio por 30 minutos antes de iniciar o seu lapso de tempo. Verifique se o seu selo vaselina não desenvolveram vazamentos durante o curso de sua sessão de lapso de tempo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
535 nm Laser	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal, e CRC também oferecem lasers comparáveis)
Todos os óptica e hardware			(Thor oferece ópticas comparáveis ​​e hardware)
SUPREMA Optical Monte, de 1,0 de diâmetro	Newport	SS100-F2KN	2
Um "post de diâmetro, 1" height	Newport	PS-1	1
Um "fork pós diâmetro	Newport	PS-F	1
Acromática Zero Order-Placa Wavel, ½ Retardo Wave, 400-700nm	Newport	10RP52-1	1
Estágio de rotação, 1 Abertura "	Newport	RSP-1T	1
Um "post de diâmetro, 1" height	Newport	PS-1	1
Um "fork pós diâmetro	Newport	PS-F	1
Glan-Laser Polarizador Calcita, 430-700nm	Newport	10GL08AR.14	1
Polarizador de rotação Monte	Newport	RM25A	1
¼ "espaçador para um" post diâmetro	Newport	PS-0,25	1
½ "de altura, um" post diâmetro	Newport	PS-0.5	1
Garfo, uma pós "de diâmetro	Newport	PS-F	1
Dump feixe	Newport	PL15	1
Microscópio Objetivo Montagem de Lente	Newport	LH-OBJ1	1
Um "post de diâmetro, 1" height	Newport	PS-1	1
Um "fork pós diâmetro	Newport	PS-F	1
High-Energy Nd: YAG laser Mirror, 25,4 mm de diâmetro, 45 °, 532 nm	Newport	10Q20HE.2	4
SUPREMA Optical Monte, 1.0 polegadas de diâmetro, furo espaço de montagem	Newport	SN100C-F	2
High Precision Parafuso de Ajuste Knob, 12,7 milímetros de viagens, 100TPI	Newport	AJS100-0.5K	4
Adaptador de rosca, ¼ do sexo masculino -20, 8-32 feminino	Newport	SS-1-B	2
Rod Grampo para haste de 1,5 polegadas de diâmetro	Newport	340-RC	2
Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura	Newport	40	1
Transportador ferroviário para X26 duração quadrados, 40mm	Newport	CN26-40	4
Aço Rail, 384 milímetros de comprimento (15 ")	Newport	X26-384	1
Rod Plataforma de 1,5 polegadas de diâmetro da haste	Newport	300-P	2
Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura	Newport	40	2
Plano-Concave Lens, 12,7 milímetros de diâmetro, EFL-25mm, 430-700nm	Newport	KPC025AR.14	2
Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 50,2 milímetros EFL, 430-700nm	Newport	KPX082AR.14	1
Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 62,9 milímetros EFL, 430-700nm	Newport	KPX085AR.14	1
Montagem de Lente fixa de 0,5 "de diâmetro, 1,0" de altura Axis	Newport	LH-0.5	2
Montagem de Lente fixa, 1,0 "de diâmetro, 1,0" de altura Axis	Newport	LH-1	2
Microesferas 0.1um	Polysciences	00876
Agarose	RPI	A20090	Assuntos EEO
Muscimol	Sigma	M1523