JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

Abstract

לאחר השחרור ל, דופמין המרווח הסינפטי מפעיל תכונות הביולוגיות שלו דרך יעדיה לפני ואחרי-הסינפטי 1. אות דופמין הוא הופסק על ידי דיפוזיה 2-3, אנזימים תאיים 4, ומובילים בממברנה 5. טרנספורטר דופאמין, הממוקם בחריץ שperi-הסינפטית של הנוירונים דופאמין מנקה את האמינים ישוחררו באמצעות שטף דופמין פנימה (ספיגה). טרנספורטר דופאמין יכול לעבוד גם בכיוון הפוך כדי לשחרר אמינים מבפנים החוצה בתהליך שנקרא תחבורה או זרימה של דופמין 5 כלפי חוץ. . יותר מ 20 שנים לפני זולצר et al דיווח טרנספורטר דופאמין יכול לפעול בשני מצבי פעילות: קדימה (ספיגה) והפוך (זרימה) 5. הנוירוטרנסמיטר משתחרר דרך הזרימה דרך טרנספורטר יכול להזיז כמות גדולה של דופמין למרחב החוץ התאי, והוכח לשחק תפקיד מרכזי בויסות דופמין h התאיomeostasis 6. כאן אנו מתארים כיצד מהדק תיקון זמני והקלטת amperometry יכולים לשמש למדידת דופמין שוחרר באמצעות מנגנון הזרימה עם רזולוצית זמן האלפית השנייה, כאשר פוטנציאל הממברנה נשלט. לשם כך, בהווה ובאותות חמצונים כל תאים (amperometric) נמדדים בו זמנית באמצעות מגבר 200B Axopatch (התקנים מולקולריים, עם סט נמוך לעבור Bessel מסנן ב1000 הרץ להקלטה נוכחית כל תאים). לamperometry הקלטת האלקטרודה סיבי פחמן מחובר למגבר שני (Axopatch 200B) וממוקמת בסמוך לממברנת הפלזמה ונערכה ב700 mV. הזרמים כל התא וחמצונים (amperometric) ניתן להקליט ויחסים נוכחי מתח יכולים להיות שנוצרו באמצעות פרוטוקול צעד מתח. בניגוד לכיול amperometric הרגיל, שדורש המרה לריכוז, הנוכחי הוא דיווח ישירות ללא התחשבות בנפח 7 היעילים. לפיכך, את הנתונים המתקבלמייצג גבול תחתון לזרימת דופאמין כי חלק המשדר הפסיד לפתרון התפזורת.

Protocol

1. ציוד ואספקה

  1. הר כלוב פאראדיי בחלק העליון של טבלת הרטט אנטי (TMI) כדי להקטין את רעש הרקע.
  2. המערכת בו זמנית תיקון מהדק amperometry ההקלטה דורשת מיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה DIC מצוין ועדשת מרחק עבודה ארוכה. חבר את המיקרוסקופ מגדלור לסוללה של מכונית. מקור אור זה DC עבור המערכת יהיה עוד יותר להקטין את הרעש החשמלי.
  3. micromanipulators ההידראולי (Siskiyou) רעש ירידה נוסף. בתצורה שלנו, אנו משתמשים בידי מניפולטור זכות להקלטת התא כולו, ונתן לשמאל amperometry.

2. הכן אלקטרודות להקלטה

  1. משוך אלקטרודות תיקון באמצעות pipettes קוורץ על חולץ P-2000 (סאטר). המשיכה שלנו נמשכת כ 5 שניות, עם שני מחזורי חום. זמן חום זה הביא התנגדות עקבית (3-4 MΩ) בpipettes תיקון התאים השלמים שלנו.
  2. מלא את האלקטרודה עםפתרון פיפטה המכיל דופמין 2 המ"מ ולהתקינה על מניפולטור הנכון. עטוף את המכל מחזיק פתרון פיפטה מכיל DA עם רדיד אלומיניום. שמור על קרח. דופמין הוא oxidizable. שמירה על הפתרון בקרח, מוגן מפני אור תקטין את שיעור החמצון של דופמין.
  3. בעדינות להסיר את האלקטרודה ProCFE (דגן) רעש נמוכה סיבי פחם amperometric מתיבת האחסון, למלא עם כספית, הר על מתאם amperometric (כמתואר באיור 1), ולאחר מכן לעלות על maniupulator הנכון. הגן על קצה סיב פחמן מניזק על ידי מחזיק בקצה המרוחק של סיבי הפחם. בדוק את האלקטרודה עם מיקרוסקופ מעבדה על מנת להבטיח את הקצה הוא נקי ושלם.
  4. בדוק את התקינות של האלקטרודה amperometric ידי לשים את האלקטרודה בצלחת פטרי תחתית כוס המכילה את הפתרון חיצוני. הקלט נוכחי בסיסית בהיעדר דופמין. הוסף 10 μl של פתרון DA 1mm למנה. מחדש האלקטרודה amperometric טובמייתרי גידול בזרם החמצונים. חזור על שלב זה בהתחלה ובסופו של כל ניסוי כדי לוודא את האלקטרודה amperometric עובדת כראוי.

3. הכן את התרבות העצבית הראשונית של נוירונים או תאי דופמין הונדסו טרנספורטר דופאמין בצלחות פטרי תחתית זכוכית

  1. לשטוף בעדינות את התאים או נוירונים הדופמין שלוש פעמים עם פתרון חיצוני חם.
  2. הר צלחת פטר תחתית הזכוכית על במת מיקרוסקופ.

4. דמיינו תא ולבצע את הניסוי

  1. מצא את נקודת המיקוד הנכונה בבירור לדמיין את התאים. הנח לחץ חיובי על האלקטרודה התיקון. ואז, בעדינות להביא את שתי אלקטרודות לתוך הפתרון, וקרוב לתא.
  2. מקם את האלקטרודה amperometric ליד התא (בצד שמאל), והאלקטרודה התיקון בצד ימין.
  3. להשיג חותם gigaohm בתא עם אלקטרודה התיקון. קרע החותם עם יניקהלהשיג תצורת תא כולו.
  4. אפשר 5-8 דקות לדיאליזה של פתרון פנימי המכיל דופמין לתא.
  5. השתמש צעד מתח רצוי או פרוטוקול רמפה. במקביל תרכשו נתונים משני פיפטה התיקון והאלקטרודה amperometric למדוד זרמי תא שלמים ולהפוך הובלה של דופאמין דרך טרנספורטר דופאמין בעוד פוטנציאל הקרום נשלט באמצעות פיפטה התיקון.

תוצאות

מהדק תיקון משולב עם amperometry יכול למדוד DA זרימת 2A מתח תלוי DAT בתיווך. איור מציג תצורת נציג ניסיוני והקלטה של DA זרימת DAT בתיווך כאשר הסביבה התאית ופוטנציאל הקרום הם הדקו ע"י פיפטה תיקון כל תאים. באמצעות טכניקה זו, תאים לבטא חלבוני YFP-DAT הם מתח הדק עם פיפט...

Discussion

מתח מהדק וamperometry סימולטני מציעים את היתרונות הבאים. כל סוגי התאים נגישים וניתן להשתמש בו להקלטה. זיהוי של תאים או נוירונים בי את ההקלטות נעשות הוא פשוט וברור. בפרט, אם התא מסומן fluorescently ידי הוספת תג ניאון לחלבון של עניין הנסיין יכול לבחור בקלות לתא המטרה או תא העצב. התצ?...

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר Sanika Chirwa לסקירה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (DA026947, DA021471, וNS071122).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ציוד
נגד רעידות שולחן w / פאראדיי כלוב טכנית ייצור חברה 63-500 סדרה אנו משתמשים במודל 63-543
הפוך מיקרוסקופ ניקון TE-2000 ניקון הופסק עכשיו אקליפס Ti
שני מגברי רעש נמוכים axopatch 200 מיליארדים התקנים מולקולריים 800-635-5577
203 headstage 1-CV BU התקנים מולקולריים 800-635-5578
1-HL-U בעל פיפטה התקנים מולקולריים 800-635-5579
Digidata 1440A / D ממיר התקנים מולקולריים 800-635-5580
שני Siskyou המניפולטורים, עזבוונתן זכות Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
ליזר פיפטה חולץ סאטר מכשירים P-2000 888-883-0128
האלקטרודה רעש נמוכה סיבי פחם amperometric ProCFE www.dagan.com
רעש הנמוכה קוורץ פיפטה סאטר מכשירים QF100-70-7.5 888-883-0128
סוללה במכונית 12-וולט זמין באופן נרחב
מטען סוללה לרכב זמין באופן נרחב
מגיב
נתרן כלורי (NaCl) סיגמא S7653
HEPES סיגמא H3375
דקסטרוז סיגמא G7528
מגנזיום סולפט (MgSO 4) סיגמא M2643
אשלגן זרח monobasic (KH 2 PO 4) סיגמא P5655
אשלגן כלורי (KCl) סיגמא P9333
dihydrate סידן כלוריד (CaCl 2 • 2H 2 0) סיגמא 223506
hexahydrate מגנזיום כלוריד (MgCl 2 • 6H 2 0) סיגמא M2670
EGTA סיגמא E0396

References

  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience69VoltametryVoltametry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved