Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

Zusammenfassung

Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.

Zusammenfassung

Nach seiner Freilassung in den synaptischen Spalt, Dopamin übt seine biologischen Eigenschaften über seine Pre-und Post-synaptischen Ziele ^1. Die Dopamin-Signal wird durch Diffusion ^2-3, extrazelluläre Enzyme ⁴ und Membrantransportern ⁵ beendet. Die Dopamin-Transporter in der peri-synaptischen Spalt von Dopamin-Neuronen angeordnet löscht die freigesetzten Amine durch eine nach innen Dopamin Flusses (Uptake). Die Dopamin-Transporter kann auch in umgekehrter Richtung arbeiten, um Amine von innen nach außen freigeben in einem Prozess namens Abtransport oder Efflux von Dopamin ^5. . Mehr als 20 Jahren Sulzer et al berichtete die Dopamin-Transporter kann in zwei Modi der Tätigkeit zu betreiben: forward (Aufnahme) und rückwärts (Efflux) ^5. Der Neurotransmitter über Efflux durch den Transporteur freigesetzt werden eine große Menge an Dopamin in den extrazellulären Raum bewegen, und hat gezeigt, dass eine große regulatorische Rolle der extrazellulären Dopamin h spielenomeostasis ^6. Hier beschreiben wir, wie die gleichzeitige Patch-Clamp-und Amperometrie Aufzeichnung verwendet werden, um veröffentlicht Dopamin über den Effluxmechanismen mit Millisekunden Zeitauflösung, wenn das Membranpotential gesteuert wird messen. Hierzu werden Ganzzell-Strom und oxidative (amperometrisch) Signale gleichzeitig unter Verwendung eines Axopatch 200B Verstärkers (Molecular Devices, mit einer Tiefpaß-Bessel-Filter Satz bei 1000 Hz für Ganzzell-Strom-Aufzeichnung) gemessen. Für Amperometrie Aufzeichnen eines Kohlenstofffaser-Elektrode ist mit einem zweiten Verstärker (Axopatch 200B) verbunden ist und angrenzend und in die Plasmamembran bei +700 mV gehalten. Die Ganzzell-und oxidativen (amperometrische) Ströme können aufgezeichnet werden und die Strom-Spannungs-Beziehung kann mit Hilfe einer Spannung Schritt-Protokoll. Im Gegensatz zu der üblichen amperometrischen Kalibrierung, die Umwandlung in Konzentration erfordert, wird der Strom direkt ohne Berücksichtigung des effektiven Volumens ⁷ berichtet. Somit werden die resultierenden Datenstellen eine untere Grenze zu Dopamin Efflux weil einige Sender zu dem Schüttgut-Lösung verloren geht.

Protokoll

Ein. Ausstattung und Zubehör

1. Montieren Sie einen Faraday-Käfig auf dem Anti-Vibrations-Tabelle (TMI), um die Hintergrundgeräusche zu verringern.
2. Die gleichzeitige Patch-Clamp-Amperometrie Aufzeichnungssystem erfordert eine inverse Mikroskop mit exzellenter DIC Optik und einem langen Arbeitstag Abstand Linse. Schließen Sie das Mikroskop Leuchtturm an eine Autobatterie. Dieser DC-Lichtquelle für das System weiter sinken die elektrisches Rauschen.
3. Hydraulische Mikromanipulatoren (Siskiyou) weiter den Geräuschpegel zu senken. In unserer Konfiguration verwenden wir einen Rechtshänder Manipulator für die gesamte Zelle Aufnahme, und die linke für Amperometrie übergeben.

2. Bereiten Elektroden für die Aufnahme

1. Ziehen Patch-Elektroden unter Verwendung von Quarz Pipetten auf einem P-2000 Ziehvorrichtung (Sutter). Unser Zug dauert ca. 5 sec, mit zwei Wärmezyklen. Diese Wärme Zeit in konstanten Widerstand (3-4 MOhm) in unserem ganzen Zelle Patch-Pipetten geführt.
2. Füllen Sie die Elektrode mit demPipette Lösung mit 2 mM Dopamin und montieren Sie ihn auf der rechten Manipulator. Wickeln Sie den Behälter mit der Pipette Lösung DA mit Aluminiumfolie. Halten Sie auf dem Eis. Dopamin ist oxidierbare. Halten Sie die Lösung auf Eis, vor Licht geschützt verringert die Oxidation von Dopamin.
3. Entfernen Sie vorsichtig eine ProCFE (Dagan) geräuscharm Kohlefaser amperometrischen Elektrode aus der Aufbewahrungsbox, füllen mit Quecksilber, mount auf die amperometrische Adapter (wie in Abbildung 1 dargestellt), und montieren Sie auf der rechten maniupulator. Schutz der Spitze der Kohlenstoff-Faser von Schäden durch Halten des anderen Ende des Kohlenstofffaser. Überprüfen Sie die Elektrode mit einem Labor-Mikroskop, um sicherzustellen, die Spitze ist sauber und intakt.
4. Untersuchen der Integrität der amperometrischen Elektrode, indem die Elektrode in einem Glasboden Petrischale mit externen Lösung. Aufzeichnen einer Basislinienstrom in Abwesenheit von Dopamin. Fügen Sie 10 ul einer 1mM DA Lösung für das Gericht. Eine gute amperometrischen Elektrode reKorde eine Erhöhung des oxidativen Strom. Wiederholen Sie diesen Schritt am Anfang und am Ende jedes Experiments, um sicherzustellen, das amperometrischen Elektrode richtig funktioniert.

3. Bereiten Sie den primären neuronalen Kultur der Dopamin-Neuronen oder Zellen Entwickelt, um Dopamin Transporter in Glass Bottom Petrischalen Express

1. Vorsichtig waschen die Zellen oder Dopamin-Neuronen dreimal mit warmem externe Lösung.
2. Montieren Sie den Glasboden Petrischale auf den Mikroskoptisch.

4. Visualisieren Cell und Führen Experiment

1. Finden Sie die richtige Anlaufstelle, klar zu visualisieren die Zellen. Platzieren positiven Druck auf die Flächenelektrode. Dann sanft bringen beide Elektroden nach unten in der Lösung und in der Nähe der Zelle.
2. Positionieren des amperometrischen Elektrode neben der Zelle (auf der linken Seite), und der Patch-Elektrode auf der rechten Seite.
3. Erreichen eine Gigaohm Dichtung auf der Zelle mit dem Patch-Elektrode. Rupture die Dichtung mit Absaugenzu erreichen Ganzzellkonfiguration.
4. Lassen Sie 5-8 min für die Dialyse der internen Lösung mit Dopamin in die Zelle.
5. Verwenden gewünschte Spannung Schritt oder Rampe Protokoll. Gleichzeitig erwerben Daten sowohl aus der Patch-Pipette und der amperometrischen Elektrode ganze Zelle Ströme messen und Rücktransport von Dopamin durch die Dopamin-Transporter während die Membran Potential über die Patch-Pipette gesteuert wird.

Ergebnisse

Kombinierte Patch Clamp mit Amperometrie messen kann spannungsabhängigen DAT-vermittelte DA Efflux. 2A zeigt eine repräsentative experimentellen Konfiguration und Aufzeichnung der DAT-vermittelte DA Efflux wenn der intrazellulären Milieu und das Membranpotential durch ein Whole-Cell-Patch-Pipette eingespannt sind. Mit dieser Technik sind Zellen exprimieren YFP-DAT Proteine ​​spannungsgesteuerten eingespannt mit einem Ganzzell Patch-Pipette, während eine amperometrische Elektrode auf der Plasmame...

Diskussion

Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie hat die folgenden Vorteile. Alle Zelltypen sind zugänglich und können zur Aufzeichnung verwendet werden. Die Identifizierung der Zellen oder Neuronen, wo die Aufnahmen gemacht ist einfach und unkompliziert. Insbesondere, wenn die Zelle durch Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten fluoreszierende Markierung auf das Protein von Interesse markiert der Experimentator kann problemlos das Zielzelle oder Neurons. Der experimentelle Aufbau ermöglicht eine gleichmäßige und kontr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Ausrüstung
Anti-Vibrations-Tabelle w / Faradayschen Käfig	Technische Manufacturing Corporation	63-500 Serie	verwenden wir Modell 63-543
Inverses Mikroskop Nikon TE-2000	Nikon	abgebrochen	Jetzt Eclipse-Ti
Zwei rauscharmen Verstärkern Axopatch 200b	Molecular Devices		800-635-5577
1-CV 203 BU Headstage	Molecular Devices		800-635-5578
1-HL-U Pipettenhalter	Molecular Devices		800-635-5579
Digidata 1440A A / D-Wandler	Molecular Devices		800-635-5580
Zwei Manipulatoren Siskyou, linksund Rechtshänder	Siskiyou	MX6600R MX6600L	877-313-6418
Laser Pipette puller	Sutter Instruments	P-2000	888-883-0128
Rauscharme Kohlefaser amperometrischen Elektrode	ProCFE		www.dagan.com
Rauscharme Quarz Pipette	Sutter Instruments	QF100-70-7,5	888-883-0128
12-Volt-Autobatterie			weithin verfügbar
Autobatterie-Ladegerät			weithin verfügbar
			Reagens
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma	S7653
HEPES	Sigma	H3375
Traubenzucker	Sigma	G7528
Magnesiumsulfat (MgSO 4)	Sigma	M2643
Kaliumphosphat einbasischen (KH 2 PO 4)	Sigma	P5655
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma	P9333
Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 • 2H 2 0)	Sigma	223506
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl 2 • 6H 2 0)	Sigma	M2670
EGTA	Sigma	E0396