同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

要約

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な "活動"の間の機構的な関係を明らかにする。

要約

シナプス間隙、ドーパミンへのそのリリース後に、その前と後シナプスターゲット¹を介して、その生物学的特性を発揮する。ドーパミン信号が拡散^2-3、細胞外酵素^4、膜輸送体⁵で終了します。ドーパミンニューロンの周囲のシナプス間隙に位置するドーパミントランスポーターは、内側ドーパミンフラックス（取り込み）を介して放出さアミンをクリアします。ドーパミントランスポーターはまたドーパミン⁵の外側への輸送または流出と呼ばれるプロセスで、内部から外部へのアミンを解放するために逆方向に働くことができます。 。フォワード（摂取）とリバース（流出^）5：20年以上前スルザーらは、ドーパミントランスポーターは、次の2つのアクティビティのモードで動作することができます報告した。トランスポーターを介して流出を介して神経伝達物質放出は、細胞外空間にドーパミンを大量に移動させることができ、細胞外ドーパミンhで主要な調節的役割を果たすことが示されているomeostasis ^6。ここでは、同時パッチクランプとアンペロメトリー記録は膜電位が制御されているミリ秒の時間分解能で流出機構を介してドーパミン放出を測定するために使用する方法について説明します。このため、全細胞電流と酸化（アンペロメトリー）信号はAxopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、全細胞電流記録、1,000 Hzのローパスベッセルフィルタが設定された）を使用して同時に測定される。アンペロメトリーは炭素繊維電極を記録するためには、第二増幅器（Axopatch 200B）に接続されており、細胞膜に隣接して配置され、700 mVに保持されます。全細胞と酸化（アンペロメトリー）電流を記録することができ、電流 - 電圧の関係は、電圧ステッププロトコルを使用して生成することができます。濃度への変換を必要とする通常のアンペロメトリックキャリブレーションとは異なり、現在は有効容積^7を考慮せず^に直接報告されています。従って、得られたデータいくつかの送信機はバルク溶液に失われるので、ドーパミン流出には下限を表しています。

プロトコル

1。用品

1. バックグラウンドノイズを低減する防振台（TMI）の上にファラデーケージをマウントします。
2. 同時パッチクランプアンペロメトリー記録システムは、優れたDICの光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡を必要とします。車のバッテリーに灯台顕微鏡を接続します。システムのこのDC光源はさらに、電気ノイズを減少させるであろう。
3. 油圧マイクロマニピュレーター（Siskiyou）さらに減少ノイズ。私達の構成では、我々は、全細胞記録のために右利きのマニピュレータを使用し、電流測定のために左利き。

2。記録用の電極を準備

1. P-2000プラー（サター）に石英ピペットを用いてパッチ電極を引き出します。私たちのプルは、2つの熱サイクルで、約5秒続く。この熱時間は私たちの全細胞パッチピペットで一貫抵抗（MΩ3-4​​）をもたらしました。
2. に電極を埋めるピペットは、2mMのドーパミンを含む溶液と右マニピュレーターにマウントします。アルミホイルでDAを含むピペット溶液を保持する容器を包む。氷上で保存する。ドーパミンは酸化可能である。光から保護し、氷の上で解決策を維持すると、ドーパミンの酸化速度が低下します。
3. 優しく、収納ボックスからProCFE（ダガン）低ノイズカーボンファイバーアンペロメトリー電極を取り外します（ 図1に示すように）アンペロメトリアダプタに水銀、マウントと入力し、[右maniupulatorにマウントされます。炭素繊維の遠端を保持することによって損傷から炭素繊維の先端を保護します。先端を清潔にし、無傷であることを確認するために、ラボ顕微鏡で電極を点検してください。
4. 外液を含有するガラスボトムシャーレに電極を入れて電流滴電極の整合性を調べます。ドーパミンの非存在下での現在のベースラインを記録します。皿に1mmのDA溶液10μlを追加します。良いアンペロメトリー電極REコー​​ド酸化電流の増加。アンペロメトリー電極が正常に動作して確実にし、各実験の開始時と終了時に、この手順を繰り返します。

3。グラスボトムペトリ皿内ド​​ーパミントランスポーターを発現するように遺伝子ドーパミン神経細胞や神経細胞の初代培養を始めて

1. 優しく暖かい外液と細胞やドーパミンニューロン3回洗浄する。
2. 顕微鏡ステージ上にグラスボトムシャーレをマウントします。

4。セルを視覚化し、実験を行う

1. 明らかに細胞を可視化するための正しい焦点を見つける。パッチ電極に正の圧力をかける。その後、静かに溶液中に両方の電極をダウンさせると、セルに近接しています。
2. セル（左側）、右側にパッチ電極の隣にアンペロメトリー電極を配置します。
3. パッチ電極付きセルでgigaohmシールを達成。破裂に吸引シール細胞全体の構成を実現。
4. 細胞内にドーパミンを含む内部液の透析のための5月8日分を許可します。
5. 所望の電圧ステップまたはランプ·プロトコルを使用しています。同時にパッチピペットと膜電位はパッチピペットを介して制御されながら、ドーパミントランスポーターを介して全細胞電流とドーパミンの逆輸送を測定する電流測定型電極の両方からデータを取得します。

結果

アンペロメトリーとの複合パッチクランプは、電位依存DAT媒介DA流出。 図2Aは、細胞内環境と膜電位が全細胞パッチピペットによってクランプされるDATの媒介DA流出の代表的な実験設定や記録を示して測定することができます。アンペロメトリー電極が細胞膜（ 図2A）上に置かれている間、このテクニックを使用すると、YFP-DATのタンパク質を発現する細胞は全細胞パ?...

ディスカッション

同時に電圧クランプとアンペロメトリーは、次の利点があります。すべての細胞型はアクセス可能であり、記録のために使用することができます。レコーディングが行われた細胞またはニューロンの同定は、シンプルで簡単です。特に、細胞が蛍光実験者が容易に目的の細胞や神経細胞を選択することができ、目的のタンパク質に蛍光タグを追加することで、ラベルが付いていた場合。実験?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			機器
防振テーブルのw /ファラデーケージ	テクニカル·マニュファクチャリング株式会社	63から500シリーズ	私たちはモデル63から543までを使用
倒立顕微鏡ニコンTE-2000	ニコン	中止	これで、EclipseのTi
二つの低雑音増幅器axopatch 200B	分子デバイス		800-635-5577
1-CV 203 BUのヘッドステージ	分子デバイス		800-635-5578
1-HL-Uピペットホルダ	分子デバイス		800-635-5579
Digidata 1440A / Dコンバータ	分子デバイス		800-635-5580
2つのマニピュレータSiskyou、左と右利き	Siskiyou	MX6600R MX6600L	877-313-6418
レーザーピペットプラー	サターインスツルメンツ	P-2000	888-883-0128
低ノイズの炭素繊維電極アンペロメトリー	ProCFE		www.dagan.com
低ノイズ石英ピペット	サターインスツルメンツ	QF100-70から7.5	888-883-0128
12ボルトのカーバッテリー			広く利用可能
車のバッテリー充電器			広く利用可能
			試薬
塩化ナトリウム（NaCl）	シグマ	S7653
HEPES	シグマ	H3375
葡萄糖	シグマ	G7528
硫酸マグネシウム（MgSO 4）	シグマ	M2643
リン酸二水素カリウム（KH 2 PO 4）	シグマ	P5655
塩化カリウム（KCl）	シグマ	P9333
塩化カルシウム水和物（CaCl 2で •2H 2 0）	シグマ	223506
塩化マグネシウム六水和物（MgCl 2を •6H 2 0）	シグマ	M2670
EGTA	シグマ	E0396