הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Summary

AVEXIS הוא קצב העברת נתונים גבוה חלבון אינטראקציה assay פותח מסך באופן שיטתי על הרומן רצפטור ליגנד בזוגות המעורבים בתהליכים תאיים זיהוי סלולריים. היא תוכננה במיוחד כדי לזהות אינטראקציות חלבון חולפות שקשה לזהות באמצעות גישות אחרות קצב העברת נתונים גבוה.

Abstract

חלבונים תאיים: יחסי הגומלין בין חלבון מופרש או קרום הכבולים חלבונים הם קריטיים עבור הלכידות גם ליזום תקשורת אינטר והבטחת בתוך יצורים תאיים. חלבונים חזה כדי ליצור אינטראקציות תאיים מקודדים על ידי כרבע הגנים האנושיים ^1, אבל למרות חשיבותם ושפע, רוב החלבונים האלה תיעדו פרטנר מחייב. בעיקר, וזאת בשל חוסר היכולת להשתלט הביוכימית שלהם: חלבונים בממברנה, משובצים קשה solubilise ב קונפורמציה האם שלהם ומכילים שינויים posttranslational מבנית חשובים. כמו כן, זיקות את האינטראקציה בין חלבונים הקולטן מאופיינים לעיתים קרובות על ידי כוחות אינטראקציה נמוכות מאוד (מחצית חיים <1 2) precluding זיהוי שלהם נפוץ בשימוש שיטות רבות קצב העברת נתונים גבוה ^2.

כאן אנו מתארים assay, AVEXIS (שוקקות מבוסס EXtracelluLAR אינטראקציה מסך) אשר מתגבר על אתגרים אלה טכניים המאפשרים זיהוי של אינטראקציות חלבון חלשים מאוד (t _1/2 ≤ 0.1 שניות) עם שיעור נמוך חיובי כוזב ^3. Assay מיושם בדרך כלל בפורמט תפוקה גבוהה, כדי לאפשר את הקרנת שיטתית של אלפים רבים של אינטראקציות בפורמט נוח microtitre צלחת (איור 1). היא מסתמכת על ייצור של חלבון רקומביננטי מסיסים ספריות המכילות את שברי ectodomain של קולטנים בתא השטח או חלבונים המופרשים שבו למסך עבור אינטראקציות, לכן, גישה זו מתאימה עבור סוג I, Type II, ה-GPI צמודות קולטנים בתא השטח ומופרשת חלבונים אבל לא קרום חלבונים multipass כגון תעלות יונים או מובילי.

הספריות חלבון רקומביננטי מופקים באמצעות מערכת נוחה ברמה גבוהה ביטוי יונקים ^4, על מנת להבטיח כי שינויים posttranslational חשובים כגון glycosylaאג"ח tion ו disulphide נוספים. חלבונים רקומביננטיים לידי ביטוי מופרשים לתוך המדיום והפיק בשתי צורות: הפיתיון biotinylated שניתן שנתפסו על השלב streptavidin מצופה מוצק מתאים להקרנה, וגם אנזימים מתויג pentamerised (β-lactamase) טרף. הפיתיון וחלבונים טרף מוצגים זה לזה בצורה בינארית כדי לזהות אינטראקציות ישירות ביניהם, בדומה ELISA המקובלת (איור 1). Pentamerisation של החלבונים טרף מושגת באמצעות רצף הפפטיד בחלבון מן oligomeric מטריקס הסחוס (COMP), ומגביר את הריכוז המקומי של ectodomains ובכך לספק רווחים שוקקות משמעותיים כדי לאפשר אינטראקציות אפילו חולפות מאוד כדי להתגלות. על ידי נרמול הפעילות של פיתיון וגם טרף לרמות שנקבעו מראש לפני ההקרנה, הראינו כי האינטראקציות שיש monomeric חצאי חייהם של 0.1 שניות ניתן לאתר עם ​​מחירים נמוכים חיוביות כוזבות ^3.

Protocol

1. עריכת ספריית בית וטרף ביטוי פלסמיד-וקטורים

1. רשימה של קולטן תא השטח חלבונים המופרשים המעניינים שיוקרנו על אינטראקציות ולאחזר רצפים שלהם באתר חלבון מתאים ברצף. רוב חלבונים המכילים N-מסוף האות פפטיד הפרשה מתאימים (אלה כוללים סוג I, ה-GPI צמודות ומופרשת חלבונים). בדרך כלל, המשפחה חלבון (למשל superfamily אימונוגלובולינים או כל הקולטנים מוגבלים לסוג תא מסוים כמו כדורית אדומה) ייבחרו.
2. לקבוע את היקף האזורים תאיים על ידי זיהוי מיקומו של הפפטיד האות באזור הטרנסממברני באמצעות תכונה חלבון תוכנות חיזוי. אנו משתמשים בדרך כלל v3.0 SignalP ⁵ ו TMHMM v2.0 ^6.
3. פריימר עיצוב סטים כי להגביר את שבר ectodomain כולו קולטן זה. יש לנו חבילה של הפיתיון וקטורים טרף המתאימים למטרה זו אשרvailable מ Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). תחל בעיצוב תחושת סביב תחילת מתיונין לכלול אנזים הגבלה NotI האתר ברצף קוזאק אופטימלי, זה מלווה 25 זוגות בסיסים של התאמה מדויקת גן ספציפי ברצף (איור 2 א).
4. תחל בעיצוב antisense לחתוך אני מקליד חלבונים הקולטן ממש לפני האזור הטרנסממברני חזה על מנת להביע את ectodomain כולה חלבון מסיס רקומביננטי. כלול אתר הגבלת asci ב פריימר זה שאמור ואז לתרגם מסגרת עכברוש בטרמינל C-4 Cd4d3 תג חלבון ⁷ (איור 2 א).
5. להגביר את שברי ectodomain מכל הגנים הללו באמצעות primers ולשכפל אותם הפיתיון או וקטור טרף. לפעמים אנחנו מוצאים את זה מועיל 1 לשכפל אותם וקטורים הסעות לפני subcloning לתוך וקטור ביטוי הולם יונקים, אנו משתמשים נגזרת של וקטור pTT3 ^3,4. גם את הפיתיון וקטורים טרף contaiנ ג מסוף חלבון תגיות כדלקמן (איור 2 ב).
   1. פיתיונות: תג המכיל תחומים 3 ו -4 של CD4 חולדה (Cd4d3 4) חלבון ואחריו רצף פפטיד זה המצע של בירה E.coli האנזים ולכן יכול להיות monobiotinylated על שאריות ליזין מסוים (איור 2 ב) . Cd4d3 4 תג מוכר על ידי נוגדן חד שבטי OX68 ומשמש לכמת את הביטוי של חלבונים הפיתיון של ELISA. החלבונים הם הפיתיון monomeric ולכן ו monobiotinylated. נוספים חלבון הפיתיון וקטורים שבו פפטיד biotinylatable הוא הוחלף על ידי תג 6 שלו לטיהור זמינים.
   2. פושט: את ניזונים מכילים גם Cd4d3 עכברוש 4 תג ואחריו רצף הפפטיד בחלבון מן הסחוס עכברוש מטריקס oligomeric (COMP) ו-C מסוף β-lactamase האנזים. הפפטיד COMP מבטיחה את הטפסים pentamers טרף לידי ביטוי פעם אחת (איור 2 ב).

2. Prey, וכן בית חלבון Expression

אנו משתמשיםהמערכת נוחה ברמה גבוהה ביטוי באמצעות התרבות ההשעיה של הקו הסלולרי HEK293E ⁴ לייצר ספריות חלבון שלנו, אבל כל מערכת היונקים הביטוי צריך להיות מתאים. חלופה זמינה באופן מסחרי היא מערכת בסגנון חופשי. תאים בתרבית באופן שגרתי על 37 על פלטפורמת רועד (125 סל"ד) מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ על לחות יחסית 70%. חלבונים לשלוט הן חיוביות ושליליות צריך גם לבוא לידי ביטוי. עכברוש Cd4d3 4 תג בלבד שבר זמין כפיתיון וגם טרף פיקוח שליליים מתאימים. באופן דומה, הפיתיון ו טרף וקטורים המקודדים שליטה חיובית זמינים (Addgene), אנחנו משתמשים בדרך כלל עכברים Cd200-Cd200R אינטראקציה ^8.

1. זרע התאים HEK293E יום לפני transfection בצפיפות של 2.5 x 10 ⁵ תאים למ"ל ^-1. אנו שגרתי התרבות התאים בנפחים של 50 מ"ל ב Freestyle293 התקשורת בעקבות המלצות היצרן. על מנת להבטיח biotinylation יעיל, לא להשליםהוא התרבות בינוני התא משמש לייצור חלבונים הפיתיון עם D-ביוטין לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. בינוני נהג להביע את החלבונים טרף לא צריך להשלים עם תוספת D-ביוטין.
2. למחרת, תאים transfect באמצעות מגיב transfections מתאים (293fectin למשל). השתמש 25 מיקרוגרם של הפיתיון או בונה פלסמיד קורבן transfect תרבות 50 מ"ל. כדי לייצר את פיתיונות biotinylated, שיתוף transfect קידוד פלסמיד הפיתיון לבנות עם פלסמיד המקודד סוג של חלבון המופרש-E.coli ligase ביוטין ( בירה) שניתן להשיג אצל Addgene. שיתוף transfect הפיתיון פלסמידים ביחס 10:01 (2.5 מיקרוגרם) של קידוד פלסמיד חלבון המופרש בירה.
3. קציר תרבויות חמישה ימים לאחר transfection ידי 1 pelleting את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 20 דקות ולאחריו סינון של supernatant באמצעות מיקרומטר 0.22 הסינון.

עצה [: בית וחלבון טרףזה צריך להיות מאוחסן חי על 4 מעלות צלזיוס, כמו מנחה כללי יש להשתמש תוך שנה. הוסף bacteriostatics כמו 50 מיקרוגרם / מ"ל polymyxin B סולפט או 10 mM NaN ₃ על מנת למנוע זיהום חיידקי של supernatants את.]

3. Normalisation של בית דגימות טרף

אחד המאפיינים העיקריים של assay AVEXIS היא כי חלבונים רקומביננטיים מופרשים הם יכולים להיות מדולל או מרוכז (מנורמל) עד ​​למרחק של פעילויות הסף שנקבעו לפני בשימוש assay. מצאנו כי רמות שבו חלבונים רקומביננטיים באים לידי ביטוי מגוון רחב ההיקף - עד 4 סדרי גודל - וכך צעד לנורמליזציה מפחית באופן משמעותי את מספר תוצאות חיוביות שגויות במהלך המסכים.

3.1 בית נורמליזציה

הערה: Unconjugated D-ביוטין יש להסיר מן התקשורת (בדרך כלל על ידי דיאליזה) שכן הוא יתחרה עם באי biotinylatedלא החלבון על קשירה streptavidin אתרי הקישור.

1. העברת supernatants הפיתיון לתוך תווית צינורות, דיאליזה, קליפ מאובטח dialyse נרחב נגד המאגר מתאים כגון PBS להסיר ביוטין חינם.

[טיפ: מצאנו כי דיאליזה מספיק מושגת בדרך כלל על 6 x 50 הפיתיון supernatants מ"ל נגד בנפח של 4.5 ליטר של PBS עם 4 שינויים על פני תקופה של 24 שעות. דיאליזה מספיק ניתן לראות על ידי עיכוב של חלבון מחייב על דילולים נמוכים במהלך שלב הפיתיון נורמליזציה (איור 3 א.)

2. לבצע ELISA כדי לקבוע את רמות יחסית שבו החלבונים הפיתיון באים לידי ביטוי. הכן סדרה דילול של חלבונים הפיתיון biotinylated ולתפוס אותם על צלחת streptavidin מצופה microtitre. השתמש Cd4d3 עכברוש 4 תג לזהות ולכמת את החלבונים הפיתיון שנתפסו באמצעות נוגדן חד שבטי (OX68). לרכז או לדלל חלבונים הפיתיון מהסכום המינימלי הדרוש כדי להרוות את כל ביובכל אתרי הקישור ב גם צלחת streptavidin מצופה.
3. חסום את הבארות של צלחת streptavidin מצופה עם פוספט שנאגרו saline/0.1% tween-20 (PBST) / 2% שור בסרום אלבומין (BSA) במשך 15 דקות.
4. בצלחת נפרדת, לעשות סדרה דילול (ארבעה דילולים 1:3 בדרך כלל מספיק) של חלבונים הפיתיון BSA PBST / 2% והעברה בארות הצלחת streptavidin מצופה. דגירה שעה 1 בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את פי 3 ב PBST. הוסף μL של 100 מיקרוגרם 2 / mL נגד עכברוש העכבר Cd4d3 4 IgG (OX68) דגירה שעה 1 בטמפרטורת החדר.
6. לשטוף את פי 3 ב PBST. הוספת 100 μL של phosphatase העכבר נגד בסיסי בדילול 1:5,000 ב PBST / BSA 2% ו דגירה שעה 1 בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף את פי 3 ב PBST ולבצע שטיפה האחרון PBS להסיר כל חומר ניקוי שיורית. הוספת 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל תשתית 104 diethanolamine חיץ (diethanolamine 10% (V / V), 0.5mm MgCl _2, 10 mM NaN _3, pH9.8, לאחסן מפני אור 4° C).
8. לאחר שעה, ספיגת מידה ב 405 ננומטר. הפיתיון נציג תוצאות נורמליזציה מוצגים איור 3 א.
9. חלבונים הפיתיון הזה באים לידי ביטוי ברמות כי הם לא מספיק כדי להרוות את כל ביוטין מחייבים אתרים של צלחת streptavidin מצופה, הפועל חי, יש לרכז באמצעות Vivaspin ריכוז (Vivascience, 10kDa MWCO). כמדריך, אנו מעריכים כי ~ 5 מיקרוגרם של חלבון הפיתיון אופיינית (~~~HEAD=NNS 80 KDA) מספיקה כדי להרוות צלחת 96 גם כן.
   1. חלבונים הפיתיון לידי ביטוי ברמות גבוהות יכולה להיות מדולל BSA PBST / 2% לריכוז מספיק כדי להרוות את הצלחת streptavidin מצופה. הפעילות של פיתיונות צריך להיות ובדק שוב לאחר דילול או ריכוז כדי לוודא שהם להרוות את כל אתרי הקישור ביוטין בצלחת streptavidin מצופה.

3.2 Prey נורמליזציה

1. לכמת את רמות יחסית שבו החלבונים טרף באים לידי ביטוי באמצעות β-lactamaseפעילות האנזים.
2. ראשית, לעשות סדרה של דילול supernatant המכיל את החלבונים טרף PBST / 2% חיץ BSA. לאחר מכן להוסיף 20 μL של דילולים כדי μL 60 של כמה 242 מיקרומטר (0.125 מ"ג / מ"ל) nitrocefin פתרון (Calbiochem).
3. מיד להעביר את הצלחת לקורא צלחת microtitre שלוקח מדידת ספיגת ב 485 ננומטר בכל דקה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. טרף נציג תוצאות נורמליזציה מוצגים באיור 3 ב.
4. להתרכז דגימות באמצעות ריכוז צנטריפוגלי או לדלל אותם BSA PBST / 2% כדי להגיע לסף פעילות של ~ 2 מחזור nmol ^-1 דקות של nitrocefin. למעשה, זו מושגת אם כל nitrocefin הוא הידרוליזה ~~~HEAD=NNS בתוך 7 דקות.

4. AVEXIS נוהל הקרנה

1. לשטוף צלחת streptavidin מצופה ב PBST.
2. הוספת 100 μL של BSA PBST / 2% זה טוב דגירה במשך 30 דקות כדי לחסום כל אתרי חלבון שווא מחייב גם בתוך כל אחד.

[טיפ: כדי להסיר כל חיץ לשטוף שיורי לאחר צעדים כביסה, צלחת הוא טפח - במרץ - על מגבות נייר]

3. הסר את פתרון חסימת בהינף חכם הצלחת מעל הכיור ולהוסיף 100 הפיתיון μL מנורמל monomeric biotinylated על בארות מתאימים דגירה שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. הסר את דגימות הפיתיון מהצלחת ידי ההופך את הצלחת בזריזות מצליף מעל לכיור, לשטוף 3 פעמים ב PBST.
5. הוספת 100 μL טרף pentamerized מנורמל לבנות זה טוב דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה 1, לשטוף כמו בשלב 1 4.4 ולבצע שטיפה סופית עם PBS בלבד.
6. הוסף 60 μL של פתרון 242 מיקרומטר nitrocefin (לפרק 5 מ"ג nitrocefin ב μL 500 של DMSO, לערבב היטב ואז לדלל עוד יותר את nitrocefin ב 40 מ"ל PBS ולעבור כמה 0.22 מיקרומטר לסנן לפני הוספת ללוחות) ו דגירה בטמפרטורת החדר . אינטראקציות חיוביות ניתן לצפותבעין מאז nitrocefin הצהוב הידרוליזה לצבע אדום. לכמת ידי קריאת ספיגת ב 485 ננומטר באמצעות קורא צלחת. הצלחת quantitation טיפוסי מוצג איור. 4.

[טיפ: אינטראקציות חיוביות נצפות בדרך כלל בטמפרטורת החדר תוך 2 שעות למרות הצלחות צריך להיות ממוקם על 4 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות על מנת להבטיח את כל אינטראקציות אפשריות מזוהים. מצאנו גם כי nitrocefin זירז ואת הפגמים על הפלסטיק של צלחת microtitre כגון שריטות / טביעות אצבעות יכולים מדי פעם להביא תוצאות חיוביות שגויות artefactual ב 485 ננומטר למרות הידרוליזה לא nitrocefin גלויה. לכן מומלץ לקחת תמונות של הצלחות חזותית להקליט מחזור nitrocefin ב וולס.]

5. נציג תוצאות

למשל צלחת AVEXIS נציג ההקרנה מוצגת באיור 4. יש לשמור הידרוליזה (צהוב אדום) של המצע nitrocefin בהשליטה בארות חיובית (גם נוגדנים בתיווך ללכידת טרף מלאה גם אינטראקציה מלאה חיובי) בתוך כ 10 דקות. כמה אינטראקציות בתוך המסך הם נצפו גם בתוך סולם הפעם, אבל אחרים עשויים להימשך זמן רב יותר (כמה שעות) כדי להופיע. בדרך כלל, פגע בשיעור של כ 0.4-0.6% (אינטראקציה חיובית על כל 150-250 אינטראקציות שהוקרנו) אופייני, בהתאם ספריות חלבון שהוקרנו.

באיור 1. זיהוי הקולטן ליגנד אינטראקציות מתווכות תהליכי זיהוי באמצעות הסלולר AVEXIS. סכמטי מראה שני תאים אינטראקציה (A ו-B) להחלפת מידע באמצעות אינטראקציות שנעשו בין הממברנה משובצים חלבונים הקולטן. AVEXIS הוא חלבון להרחבה אינטראקציה assay תוכננה במיוחד כדי לזהות את הרומן רצפטור ליגנד זוגות המאופיינים עוצמות אינטראקציה חלשה מאוד. רקומביננטי כךספריות חלבון luble המייצגים ectodomain כל הרפרטואר פני הקולטן התא של תאים הן מופקים כמו גם פושט β-lactamase-מתוייגים pentameric (סוג התא) או פיתיונות ביוטין, מתוייגים monomeric (עבור B סוג התא). Pentamerisation של פושט מגביר את הריכוז המקומי של ectodomains כדי להשפיע על הרווח הכולל שוקקות כך אינטראקציות אפילו חולפות מאוד ניתן לאתר. הספרייה הפיתיון ערוכים על streptavidin מצופים לוחות ושיטתי נחקר על אינטראקציות עם חלבונים טרף. אחרי רחצה קצרה, פושט את כל שנתפסו מזוהים באמצעות פעילות β-lactamase קשור טרף.

איור 2. הפיתיון מבנה עיצוב טרף. (א) Cd200 עכברוש חלבון קולטן מסופק כדוגמה כיצד ectodomains שלמות של פני התא קולטן נקבעים ו primers נועדו להפוך הן פיתיוןוביטוי טרף בונה. רצף החלבון cDNA ותורגם מוצגים מ פפטיד N-מסוף האות לאזור, קרום פורש הטרנסממברני של עכברוש Cd200. פריימר תחושת נועד לכלול "5 האנזים NotI הגבלה באתר ורצף קוזאק אופטימלית ואחריו 25 בסיסים של רצף התאמה מדויקת רצף cDNA Cd200. פריימר antisense מכיל האתר asci ו -25 בסיסים של רצף התאמה מדויקת ממוקם מיד במעלה הזרם של שאריות ectodomain שנבחר גמימה. כדי לשמור על ectodomain בתוך מסגרת עם תג Cd4d3 4 עכברים, אתר asci צריך לתרגם כמו גלאי-ALA-Pro. (ב) ייצוגים סכמתיים של הפיתיון וביטוי בונה טרף. מכיל ectodomains הקולטן ולצדו NotI ואתרים asci ותג Cd4d3 4. פיתיונות מכילים רצף בטרמינל C-peptide שניתן monobiotinylated במיוחד עם פלסמיד ביטוי אנזים המופרש על ידי cotransfection בירה. פושט את מלוות רצף pentamerisationמן החלבון oligomeric מטריקס הסחוס (COMP) ואת האנזים β-lactamase.

איור 3. Normalisation של הפיתיון וחלבונים טרף (א) דוגמאות מייצגות של נורמליזציה הפיתיון. סדרת דילול של ארבעה supernatants שונים הפיתיון dialysed התגלו על ידי ELISA באמצעות נוגדן אנטי CD4 תג חד שבטי. ארבעת פיתיונות באים לידי ביטוי ברמות שונות 1> 2> 3> 4. פיתיונות יש מנורמל לרמת הסף כי מרווה את אתרי הקישור של ביוטין גם כל אחד. פיתיונות הפערים לידי ביטוי יכול להיות מדולל כדי לחסוך חלבון (למשל פיתיון 1 יכול להיות מדולל ~ 1:100), ו-פיתיונות היטב לידי ביטוי מרוכז. קריאות ירד ב דילולים נמוכים הם נצפו לעתים כמה פיתיונות (למשל פיתיון 2) אשר ניתן לייחס לנוכחות של unconjugated D-ביוטין בשל דיאליזה שלם. (ב) שבו רמות חלבונים הם טרף לשעברמגוהצים הוא לכמת לפי שער הידרוליזה של המצע β-lactamase, nitrocefin. בדוגמה המוצגת, שלושת פושט באים לידי ביטוי ברמות שונות: טרף 1> 2> 3. פושט צריך להיות מנורמל לפעילות של ~ 2 דקות nmol ^-1, המתאימה להשלים הידרוליזה של 14.5 nmol nitrocefin ~~~HEAD=NNS ב -7 דקות (למשל טרף 1). פושט את האחרים בדוגמה זו יש לרכז לפני השימוש ההקרנה.

באיור 4. נציג AVEXIS תוצאות ההקרנה. (א) תצלום של צלחת AVEXIS נציג ההקרנה. חלבון טרף הוא נחקר על 41 פיתיונות שונים אינטראקציה חיובית מתגלה E2 גם כן. פקדים המשמשים את הצלחות ההקרנה כוללות: נוגדן biotinylated אנטי CD4 כדי ללכוד את כל החלבון טרף להוסיף גם (G6), אינטראקציה מלאה: עכברוש Cd200 (הפיתיון)-Cd200R (טרף) עם Cd200R את הטרף להשתמש בדילול הסף (ע3), 01:10 (H4) ו 1:100 (H5). בקרות שליליות היו: Cd4d3 4 פיתיון חקרה את החלבון עם טרף שהוקרנו (H1) ו טרף Cd200R (H2). (ב) כימות ערכי ספיגת אותו מסך ביצע בשלושה עותקים. נקודות הנתונים הם ממוצע ± SD.

Discussion

כאשר תאים חיים הם נצפו in vivo, קרום הפלזמה שלהם להפגין התנהגות דינמית מאוד: הארכת ואת קרום תהליכים חוזרת בה כפי שהם ליצור קשר ולתקשר עם ² שכניהם. אינטראקציות פיזיות בין הממברנה משובצים חלבונים קולטנים אשר מתווכים רבים של קשרים אלה התפתחו להיות חלש מאוד, כדי לאפשר התנהגות זו ניעתי מאוד. ההערכה היא כי החוזק אינטראקציה monomeric חלש כמו 50 מיקרומטר יכול להיות מספיק כדי לנהוג אינטראקציות ספונטניות על צפיפות קולטני פיזיולוגיים ⁹ שהופך גילוי אינטראקציות חדשות מאוד מאתגר ^2,10. השיטה המתוארת כאן AVEXIS מספק שיטה רגישה לגילוי חלבון תאי חולף: אינטראקציות חלבון זה יכול להיות מיושם באופן מדרגי עם שיעור נמוך חיובי כוזב. בעוד שיטות אחרות להרחבה פותחו לזיהוי אינטראקציות תאיים ^11-15,אחד היתרונות של AVEXIS היא כי פרמטרים ניסיוניים כמו פיתיון ופעילויות טרף היה לכמת לזהות אפילו החלש ביותר של אינטראקציות (t _1/2 ≤ 0.1 ים) תוך שמירה על שיעור נמוך חיובי כוזב ^3. בנוסף, הכנת נהלי יעיל וחזק מדגם אפשרו זה assay להיות מיושם בקנה מידה הרבה יותר גדול מאשר מבחני אחרים שתיארנו לאחרונה המסך אינטראקציה שיטתית בהיקף של מעל 16,500 ~~~HEAD=NNS אינטראקציות אפשריות ^16.

Assay יכול להתבצע על חלבון כלשהו אשר ניתן לבטא שבר מסיסים חלבון רקומביננטי. ולכן זה כולל חלבונים המכילים פפטיד N-מסוף האות כגון סוג I, ה-GPI צמודות ומופרשת חלבונים. עיצבנו לאחרונה חבילה של וקטורים כי עכשיו יאפשרו לנו להביע את סוג החלבונים השנייה כמו פיתיונות ^17. Assay אינו מתאים בדרך כלל קרום חלבונים multipass כגון טרנספורטר יוןS או משאבות מאז לא סביר שהם להיות מקופל בצורה נכונה מחוץ להקשר של קרום הפלזמה. יש לנו ליישם את זה על מגוון רחב של מערכות שונות הביעו בהצלחה חלבונים תאיים מ ^3,16,18 דג הזברה, אדם, עכבר ו פ falciparum עבור מסכי אינטראקציה.

מבחינת המשאבים הדרושים כדי להקים מסך AVEXIS, מצאנו כי צוואר בקבוק משמעותי, בחירת בנייה, ריצוף מלא של פלסמידים ביטוי. היבט זה של השיטה יכול לקחת עד שנה כדי להפוך ~ 100 הפיתיון בונה טרף, אך עם עלות ירידה של סינתזה הגן, עכשיו אנחנו מעדיפים מסחרית מיקור חוץ היבט זה של הפרויקט. מערכת ביטוי יונקים יחד עם גדול רועד תרבות רקמות חממה (אנו משתמשים Cell HT INFORS Multitron) מאפשרת לחוקר יחיד לבטא לנרמל את הפיתיון עד 100 ~ וחלבונים טרף בחודש. לאחר החלבונים מיוצרים מנורמל, Screening עבור אינטראקציות מהירה של עד 12 לוחות 96-גם בטיפול בנוחות ליום. ציוד העידו רק שפיתחנו כדי להקל על ייצור של מספר כה גדול של חלבונים הוא בוכנה אוויר מונחה דחוס המשמש להעביר עד חמישה supernatants דרך פילטר 0.22μm במקביל.

המעמד המרכזי של אינטראקציות שעלול לפספס בהשוואה האינטראקציות הצפויות מן הספרות (נגטיבים שווא) הם אינטראקציות homophilic, אם כי חלקם של אינטראקציות אלה ניתן לאתר ^3. במקרים שבהם האינטראקציות הצפויות לא מזוהים, אנו מאמינים כי הדבר נובע היווצרות של אינטראקציות homophilic על ידי החלבונים טרף (טרף "מיסוך" אפקט) אשר לאחר מכן מונע אינטראקציות עם חלבונים נוספים הפיתיון חסרי יכולת תנועה. התדירות שבה אינטראקציות מזוהים תלוי תוכן של ספריית חלבון שהוקרנו. כמדריך לקורא, מסך של> 30, 000 אינטראקציות בתוך superfamily אימונוגלובולינים דג הזברה הביא 188 חיוביות - תדר של 0.6% ^3,16,18. בדיקה מהירה מאוד, כי ניתן לבצע כדי לאמת את כל הלהיטים חיוביות הוא להחליט אם את האינטראקציה ניתן להבחין בשתי מגמות הפיתיון, טרף, כלומר, יכול האינטראקציה אותה להתגלות בלי קשר כמו גם הפיתיון של האם חלבונים מחייב נוכחים או טרף. בכל פעם אנו רואים התנהגות זו הדדיות, מחייב לאחר מכן כבר הוכח להיות ספציפי על ידי הוכחת מחייב saturable ישירה של חלבונים מטוהרים באמצעות משטח plasmon תהודה. יש להדגיש כי אנו מגבירים את הלהיטות מחייב באופן מלאכותי על ידי pentamerising החלבונים טרף, אנחנו לא רואים את assay מתאים כמותית השוואת עוצמות אינטראקציה. כדי לקבל פרמטרים מחייבים biophysical של אינטראקציות בהם אנו משתמשים חלבונים monomeric ותהודה plasmon פני השטח. לבסוף, לאחר אינטראקציה זוהה, הייהטבע התפוקה של GH assay עושה את זה קל יחסית להתאים את assay למסך ריאגנטים כמו נוגדנים או מולקולות קטנות לחסום את האינטראקציה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	החתול. מספר	תגובות
Freestyle התקשורת	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
SA מצופים microtitre צלחות	Nunc	734-1284
OX68 נוגדן	AbDSerotec	MCA1022R
דיאליזה צינורות	לנקב	PN68100
Polymyxin B	סיגמא	P4932
D-ביוטין	סיגמא	B4639-5G
המצע-104	סיגמא	1040-506
Vivaspin-20 צנטריפוגלי ריכוז	סארטוריוס	VS2002
מסננים 0.22 מיקרומטר	Nalgene	190-2520