Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Özet

AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Özet

Hücre dışı protein: salgılanan veya membran-gergin proteinler arasındaki protein etkileşimleri Çok hücreli organizmalarda hem de hücreler arası iletişimi başlatma ve uyum sağlamak için önemlidir. Proteinler hücre dışı etkileşimlerin insan genlerinin ¹ yaklaşık dörtte bir oranında kodlanmış oluşturmak için tahmin edilen, ancak önemi ve bolluğuna rağmen, bu proteinlerin çoğunluğu hiçbir bağlayıcı ortağı belgelenmiştir. Öncelikle, bu onların biyokimyasal inatçılığı nedeniyle: membran-gömülü proteinler kendi doğal yapısındaki çözünebilmesi zordur ve yapısal-posttranslasyonel önemli değişiklikler içerir. Ayrıca, reseptör proteinler arasındaki etkileşimi akrabalıklar genellikle çok sık kullanılan, yüksek verimlilik yöntemleri ² ile tespit engelleyen son derece düşük etkileşimi güçlü (yarılanma ömrü <1 saniye) ile karakterizedir.

Burada, AVEXIS (avidite tabanlı ekstraselüler, bir deneyi tarifdüşük yalancı pozitiflik oranı ³ ile çok zayıf protein etkileşimleri (t _1/2 ≤ 0.1 sn) tespiti sağlayan bu teknik zorlukların üstesinden lar Etkileşimi Ekran). Assay genellikle uygun bir mikrotitre plakası biçiminde etkileşimler (Şekil 1) binlerce sistematik tarama sağlamak için yüksek bir verim biçimde uygulanmaktadır. Bu etkileşimler için taranması için, içinde hücre yüzey reseptörü veya salgılanan proteinlerin ectodomain parçaları içeren çözünür rekombinant protein üretime kütüphaneleri dayanır, bu nedenle, bu yaklaşım tipi için uygun olan I, tip II, GPI-bağlı hücre yüzey reseptörleri ve salgılanmış proteinler değil, iyon kanalları ya da taşıyıcı olarak multipass membran proteinleri için.

Rekombinant protein kütüphaneler gibi glycosyla gibi önemli posttranslasyonel değişiklikler sağlamak için, uygun ve yüksek seviyeli memeli ifade sistem ⁴ kullanılarak üretilmektedirTION ve disülfit bağları eklenir. Taraması için uygun bir streptavidin kaplı bir katı faz üzerinde yakalandı edilebilir bir biyotinile yem, ve bir pentamerised enzim-etiketli (β-laktamaz) av: ifade edilen rekombinant proteinlerin, orta ve iki formda üretilen salgılanmaktadır. Yem ve av proteinleri geleneksel bir ELISA (Şekil 1) 'e benzer bunlar arasında doğrudan etkileşimler, tespit etmek için bir ikili şekilde birbirine sunulmaktadır. Av in proteinlerin pentamerisation kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) bir peptid sekansı ile gerçekleştirilir ve böylece daha çok geçici etkileşimler tespit edilebilir sağlamak için önemli bir avidite kazancı sağlanması ectodomains lokal konsantrasyonunu artırır. Yem ve tarama öncesinde önceden belirlenen seviyelere av hem de faaliyetlerini normalleştiren, biz 0.1 sn monomerik yarı ömrü olan etkileşimleri düşük yanlış pozitif oranları ³ ile tespit edilebilir olduğunu göstermiştir.

Protokol

1. Bait ve Prey Plazmid ifade Vektörler Kütüphanesi Derleme

1. Hücre yüzey reseptörü ve etkileşimleri açısından taranmalıdır ilgi salgılanan proteinlerin bir listesini derleyin ve uygun bir protein dizisi veritabanından kendi sıraları almak. Bir N-terminal salgılayıcı sinyal peptit içeren Çoğu protein (bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinlerin dahil) uygundur. Tipik olarak, bir protein familyası (örn. imünoglobulin süperailesine veya eritrosit gibi belirli bir hücre tipinde sınırlı tüm reseptörler) seçilir.
2. Protein özelliği tahmin yazılımı kullanılarak sinyal peptid ve transmembran bölge konumunu belirleyerek dışı bölgelerin ölçüde belirler. Biz genellikle SignalP v3.0 ⁵ ve TMHMM v2.0 ⁶ kullanın.
3. Her bir reseptör için tüm ectodomain parçasının büyütülmesi tasarım primer seti. Bir olup, bu amaç için uygun olan yem ve av vektörler bir takımdır sahipAddgene (gelen ULLANILABİLEN http://www.addgene.org/~~V ). Bir Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal bir Kozak sekansı dahil etmek metionin başlangıç ​​etrafında duyu primeri tasarlanması; Bu tam eşleme genin spesifik sekansı (Şek. 2A) ve 25 baz çifti tarafından takip edilir.
4. Hemen önceki tahmin transmembran bölgeyi çözünebilir bir rekombinant bir protein olarak tamamını ifade ectodomain şekilde tip I reseptör proteinler kesecek şekilde tasarlanması anti duyum primeridir. Daha sonra, bir C-terminali sıçan Cd4d3 4 proteini etiketi ⁷ (Şek. 2A) çerçeveye tercüme edilir Bu astar bir Asci sınırlandırma bölgesi içerir.
5. Bu primerler kullanılarak tüm genlerden ectodomain parçaları yükseltmek ve yem veya av vektör içine klonlamak. Biz bazen uygun bir memeli ifade vektörüne on klonlama sonrasında önce, biz pTT3 vektör ^3,4 bir türevini kullanan ilk mekik vektörleri içine clone yararlı buluyor. Yem ve yırtıcı vektörler contai Hemaşağıdaki gibi n C-terminal protein etiketler (Şek. 2B).
   1. Yemler: E.coli Bira enzimi için substrat bir peptid sekansı tarafından takip ve bu nedenle belli bir lisin çökeltisinde üzerine monobiotinylated edilebilir sıçan CD4 (Cd4d3 4) proteinin etki 3 ve 4 içeren bir etiket (Şek. 2B) . Cd4d3 4 etiketi OX68 monoklonal antikoru tarafından fark edildi ve ELISA ile yem proteinlerinin ifadesini ölçmek için kullanılır. Dolayısıyla, monomer cinsi yem proteinler ve monobiotinylated vardır. Biotinylatable peptid saflaştırılması için bir 6-onun etiketi ile değiştirilir Ek yem proteini vektörler kullanılabilir.
   2. Preys: kurbanlarına da sıçan kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve bir C-terminali β-laktamaz enziminin bir peptid sekansı takiben bir sıçan Cd4d3 4 etiketi içerir. COMP peptid av formları pentamers kez (Şekil 2B) ifade sağlar.

2. Prey ve Bait-protein İfade

Biz kullanınBizim proteini kütüphaneleri üretmek için HEK293E hücre hattı ⁴ süspansiyonu kültürü, fakat herhangi bir memeli ekspresyon sistemi kullanılarak, uygun bir yüksek seviyeli ekspresyon sistemi uygun olmalıdır. Ticari olarak kullanılan bir alternatif Serbest sistemidir. Hücreler rutin 37 titreyen platformu (125 rpm) kültüre ° C olarak,% 5% 70 bağıl nemde CO _2. Pozitif ve negatif kontrol proteinler de ifade edilmelidir. Rat Cd4d3 +4 etiketi sadece bir parçası yem ve yırtıcı her ikisi de mevcuttur ve uygun negatif kontroller vardır. Benzer şekilde, bir pozitif kontrol kodlamak yem ve yırtıcı vektörler (Addgene) mevcuttur; biz genellikle sıçan Cd200-Cd200R etkileşimi ⁸ kullanın.

1. Tohum HEK293E hücreleri 2.5 x 10 ⁵ hücrelik bir yoğunlukta mL ^-1 az önce transfeksiyon için günde. Üreticinin önerilerini takip Freestyle293 medyada 50 ml hacimde Biz rutin kültür hücreleri. Verimli biyotinilasyon sağlamak için, t ekO hücre kültürü aracı maddesi 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek D-biotin ile yem proteinleri üretmek için kullanılır. Av proteinleri ifade etmek için kullanılan Orta ek D-biotin ile takviye edilmesi gerekmez.
2. Ertesi gün, transfekte hücreler (örneğin 293fectin), uygun bir reaktif kullanılarak Transfeksiyonlar. 50 ml kültür transferinde yem veya av plazmid yapıları 25 mcg kullanın. Biyotinile yemler üretmek için, eş-transferinde plazmid kodlama yem E.coli protein biotin ligaz (bir salgılanan formu kodlayan bir plazmid ile inşa Addgene temin edilebilir Bira). Plazmid kodlama salgılanmış Bira bir protein 10:01 oranında (2,5 ug) de eş-transfekte yem plazmid.
3. İlk filtre 0.22 uM yoluyla süpernatan filtrasyon takiben 20 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri tarafından Hasat kültürler beş gün post-transfeksiyon.

[İpucu: Yem ve yem proteins 4 ° C'de sulandırılmadan ve genel bir kural olarak bir yıl içinde kullanılmalıdır olarak saklanmalıdır. Böyle 50 mcg / ml polimiksin B sülfat veya süpernatantları bakteri bulaşmasını önlemek için 10 mM NaN ₃ olarak Bakteriyostatik ekleyin.]

3. Bait ve Prey Örnekleri Normalisation

AVEXIS assay of önemli özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanan çünkü önceden deneyde kullanılan etmek kurulmuştur eşik aktiviteleri içinde seyreltilir veya (normalize) konsantre edilebilir olmasıdır. Büyüklükte 4 kadar siparişler - - ve böylece normalizasyon adımı sırasında önemli ölçüde ekranlarını yanlış sayısını azaltan We rekombinant proteinlerin ifade edildiği az düzeyde geniş bir aralık yayılma olduğunu bulduk.

3.1 Bait normalleşme

Not: biyotinile bai ile yarışacak beri D-biotin Konjuge olmamış medya (genellikle diyaliz ile) kaldırılması gerekirbağlanma yerleri streptavidin bağlanmaktan t proteini.

1. Diyaliz tüp, etiket içine yem süpernatantlar aktarın, güvenli klibi ve serbest biotin kaldırmak için böyle PBS gibi uygun bir tampon karşı yoğun diyaliz.

[Tip: Bu yeterli diyaliz normal olarak bir 24 saatlik bir süre boyunca 4 değişikliklerle PBS 4.5 L'lik bir hacme karşı 6 x 50 mL yem için süpernatan elde edilir olduğunu bulduk. Yetersiz diyaliz yem normalleşme adımı sırasında düşük dilüsyonlarda proteinlerine bağlanma inhibisyon tarafından görülebilir (Şekil 3A).

2. Yem proteinleri ifade edildiği azından göreceli seviyelerini belirlemek için bir ELISA gerçekleştirmek. Biyotinile yem protein dilüsyon serisi hazırlayın ve bir streptavidin kaplı mikrotitre tabağa yakalamak. Bir monoklonal antikor (OX68) kullanarak yakalanan yem proteinleri tespit etmek ve ölçmek sıçan Cd4d3 +4 etiketi kullanın. Tüm biot doyurmak için gereken minimum miktarı yem proteinleri konsantre veya seyreltikBir streptavidin kaplı levhanın hem de birleştirici yerlerde.
3. Fosfat içeren bir streptavidin kaplı plaka kuyuları bloke saline/0.1% Tween-20 (PBST) /% 2 sığır için albumini (BSA) serum 15 dakika tamponlu.
4. Ayrı bir plakası, bir streptavidin kaplı plaka PBST /% 2 BSA ile kuyucuklara transfer yem proteinlerin bir inceltme serilerini göstermektedir (01:03, dört dilüsyonları genellikle yeterlidir) edin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir.
5. PBST 3x yıkayın. 2 ug / mL, oda sıcaklığında 1 saat boyunca fare anti-sıçan Cd4d3 4 IgG (OX68) inkübe 100 ul ekleyin.
6. PBST 3x yıkayın. PBST /% 2 BSA ile 1:5,000 seyreltide anti-fare alkalin fosfataz 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.
7. PBST 3x yıkayın ve kalan deterjan kaldırmak için PBS içinde son bir yıkama gerçekleştirin. 1 mg / dietanolamin tamponu (% 10 dietanolamin (v / v), 0.5mM _MgCl2, 10 mM _NaH3, pH9.8, 4 ışıktan korunan saklandığında, 104 mL Substrat 100 ul ekleme° C).
8. Bir saat sonra, 405 nm'de absorbans ölçümü. Temsilci yem normalizasyon sonuçlar Şekil 3A 'de gösterilmiştir.
9. Bir streptavidin kaplı plakanın her biyotin-bağlama bölgeleri doygun hale getirmek için yeterli olan seviyelerde ifade edilir yem proteinleri, seyreltilmemiş halde kullanıldığı zaman, Vivaspin yoğunlaştırıcılar (Vivascience, 10kDa MWCO) kullanılarak konsantre edilmelidir. Bir rehber olarak, tipik bir yem proteini (~ 80 kDa) ile ~ 5 mikrogram bir 96 plaka doyurmak için yeterli olduğunu tahmin ediyoruz.
   1. Yüksek seviyelerde ifade edilen proteinleri yem streptavidin kaplı plakası doygun hale getirmek için yeterli bir konsantrasyona PBST /% 2 BSA ile seyreltilir edilebilir. Yemler aktivitesi bunlar streptavidin kaplı levha bütün biyotin bağlanma yerleri doyurmak sağlamak için seyreltme veya konsantrasyonu sonra rechecked edilmelidir.

3.2 Prey normalleşme

1. Β-laktamaz kullanılarak av proteinleri ifade edildiği azından göreceli düzeylerini ölçmekenzim aktivitesi.
2. İlk olarak, PBST av protein /% 2 BSA ihtiva eden tampon süpernatan bir seyreltme dizi yapmak. Daha sonra, bir 242 uM (0.125 mg / mL) nitrosefin çözeltisi (Calbiochem), 60 uL için seyreltmeleri 20 uL ekleyebilir.
3. Derhal oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 485 nm dakikada bir absorbans ölçümü alır, bir mikrotitre plakası okuyucuya aktarma plakası. Temsilci av normalizasyon sonuçlar Şekil 3b'de gösterilmektedir.
4. Santrifüj konsantratörü örnekleri kullanılarak Konsantre veya nitrosefin arasında ~ 2 nmol dk ^-1 cirosunun bir eşik aktivite ulaşmak için bunları PBST /% 2 BSA ile sulandırın. Tüm nitrosefin ~ 7 dakika içinde hidrolize edilir, uygulamada, bu elde edilir.

4. AVEXIS Eleme Usulü

1. PBST bir streptavidin kaplı plaka yıkayın.
2. Her bir kuyuya PBST / 2% BSA 100 mcL ekleyin ve her zamanda içinde herhangi bir sahte proteinlerine bağlanma siteleri engellemek için 30 dakika inkübe edin.

[İpucu: yıkama adım sonra herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için, plaka tiplenmeden - şiddetle - kağıt havlu üzerine]

3. Bir lavabo üzerinde plaka akıllı hareketiyle engelleme çözümü çıkartın ve uygun kuyulara 100 uL normalize biyotinile monomerik yem ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
4. Plaka upturning ve akıllıca bir lavabo üzerine hafifçe vurarak plakadan yem örnekleri çıkarın ve PBST 3 kez yıkayın.
5. Normalize pentamerized yırtıcı 100 uL, her sıra için yapı ve 1 saat için oda sıcaklığında inkübe edilir, aşama 4,4 olarak yıkanması ve sadece PBS ile bir son yıkama gerçekleştirmek ekleyin.
6. 242 uM nitrosefin çözeltisi (500 uL DMSO içinde nitrosefin 5 mg çözülür, daha plakalara eklemeden önce filtre 0.22 uM ile 40 ml PBS içinde nitrosefin seyreltilmiş ve iyice geçmesi ve sonra karıştırarak), 60 uL ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe . Olumlu etkileşimler görülebiliryılından bu yana gözle sarı nitrosefin kırmızı bir renk hidrolize olur. Bir plaka okuyucu kullanarak 485 nm'de absorbans okuyarak ölçmek. Tipik bir plaka ve kantitatif Şek. 4.

[Tip: plakaların tüm muhtemel etkileşimler tespit edilir sağlamak için 16 saat süreyle 4 ° C 'de yer almalıdır halde Pozitif etkileşimler, genellikle oda sıcaklığında 2 saat içinde gözlenmiştir. Biz de bu çizikler / parmak izi gibi mikrotitre plaka plastik üzerine çöken nitrosefin ve kusurları bazen hiçbir belirgin nitrosefin hidrolizi rağmen 485 nm artefactual yanlış pozitif yol bulduk. Bu görsel kuyularda nitrosefin ciro kayıt plakaların fotoğrafını çekmek için bu nedenle tavsiye edilir.]

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Bir temsili AVEXIS eleme plakası bir örneği, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bir de nitrosefin substrat hidroliz (kırmızı sarı) dikkat etmem gerekiryaklaşık on dakika içinde pozitif kontrol kuyuları (antikor-aracılı avını yakalama kontrolü ve aynı zamanda pozitif kontrol etkileşim hem de). Ekran içinde bazı etkileşimler de bu zaman dilimi içinde görülür, ama diğerleri daha uzun sürebilir (birkaç saat) görünür. Tipik olarak, yaklaşık% 0.4-0.6 (taranan her 150-250 etkileşim için olumlu bir etkileşim) bir isabet oranı taranan protein kütüphaneleri bağlı olarak tipiktir.

Şekil 1.. AVEXIS kullanılarak cep tanıma işlemlerine aracılık eden reseptör-ligand etkileşimlerinin belirlenmesi. Şematik membran-gömülü reseptör proteinler arasında yapılan etkileşimleri üzerinden bilgi alışverişi iki etkileşim hücreleri (A ve B) gösterir. AVEXIS özellikle çok zayıf bir etkileşim kuvvetleri ile karakterize edilir yeni reseptör-ligand çiftleri tanımlamak için tasarlanmış bir ölçülebilir proteininin etkileşime tahlil oluşturmaktadır. Böylece RekombinantHer iki hücre hücre yüzey reseptör repertuarının tamamını ectodomain temsil luble protein kütüphaneleri (hücre tipi A) veya monomerik biyotin etiketli yemler (hücre tipi B) pentamerik β-laktamaz etiketli kurbanlarına olarak ya derlenmektedir. Avların pentamerisation bile çok geçici etkileşimler tespit edilebilir, böylece genel bir avidite kazancı etki etmek için ectodomains yerel konsantrasyonunu artırır. Yem kütüphane streptavidin kaplı plakalar üzerine dizilmiş ve sistematik av proteinleri ile etkileşimleri nedeniyle tahkikat edilir. Kısa bir yıkamadan sonra, herhangi bir yakalanan beslenmez av ile ilişkili β-laktamaz aktivitesi kullanılarak tespit edilir.

Şekil 2. Yem ve yem yapı tasarımı. (A) Sıçanlarda Cd200 reseptör protein hücre yüzeyi reseptör proteinler tamamını ectodomains tespit edilir ve primerler yem hem yapmak için tasarlanmış bir örnek olarak verilmiştirve yırtıcı ifade yapıları. CDNA ve çevrilmiş protein sekansı N-terminal sinyal peptidi ile sıçan Cd200 bir membran-kapsayan transmembran bölgeyi gösterilmiştir. Bir duyu primeri Cd200 cDNA sekansı için tam bir eşleşme dizisinin 25 bazlar takip eden bir 5 'Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal Kozak sekansı dahil etmek için tasarlanmıştır. Antisense astar bir Asci sitesi ve hemen yukarı seçilen ectodomain kesme kalıntı bulunan tam eşleşme dizisinin 25. üsleri içerir. Rat Cd4d3 +4 etiketi ile çerçeve içinde ectodomain tutmak için, Asci sitesi Gly-Ala-Pro olarak tercüme edilmelidir. (B) yem ve yırtıcı ifade yapıları şematik gösterimleri. Her Notl ve Asci siteleri ve Cd4d3 +4 etiketi ile çevrili reseptör ectodomains içerir. Yemler, özellikle bir plazmid bir salgılanmış Bira enzimi ile ifade kotransfeksiyonu ile monobiotinylated edilebilir bir C-terminali peptid sekansı içerirler. Kurbanlarına pentamerisation sırası tarafından takip edilmektedirkıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve β-laktamaz enzim.

Şekil 3. Yem ve yırtıcı proteinlerin Normalisation. Yem normalleşme (A) Temsilcisi örnekler. Dört farklı diyaliz yem süpernatan bir inceltilmiş serileri bir anti-CD4 monoklonal antikoru etiketi kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Dört yemler farklı düzeylerde 1> 2> 3> 4 de ifade edilir. Yemler, her sıra içinde biyotin bağlanma yerleri doldurur bir eşik seviyesi normalize edilmesi gerekir. Yüksek-ifade yemler proteini muhafaza etmek için seyreltilmiş olabilir (örneğin yem 1 ~ 1:100 seyreltilmiş olabilir), ve kötü ifade yemler yoğunlaştı. Düşük dilüsyonlarda Azalmış okumalar bazen eksik diyaliz nedeniyle indirekt D-biotin varlığı atfedilebilecek bazı yemler (örneğin yem 2) gözlenir. (B) proteinler avlayan hangi seviyeleri eski vardırpreslenmiş bir β-laktamaz substrat, nitrosefin ile hidroliz hızı kullanarak ölçülür. Gösterilen örnekte, üç kurbanlarına farklı seviyelerde ifade edilir: av 1> 2> 3. Preys (örn. av 1) ~ 7 dakika içinde 14.5 nmol nitrosefin hidroliz tamamlamak için karşılık gelen ~ 2 nmol dak ^-1, bir aktivite normalize edilmesi gerekir. Bu örnekte, diğer kurbanlarına taramasında kullanımdan önce konsantre edilmelidir.

Şekil 4. Temsilcisi AVEXIS tarama sonuçları. (A) temsili bir AVEXIS eleme plakasının bir fotoğraftır. Bir av proteini 41 farklı yemler karşı probed ve olumlu bir etkileşim sıra E2 tespit edilir. Tarama plakalarda kullanılan kontroller şunlardır: Cd200R ile (yem)-Cd200R (av) eşik dilusyondaki kullanılan Kayalıklarında yırtıcı sıçan Cd200: bütün av protein yakalamak için bir biyotinile anti-CD4 antikoru iyi (G6), bir kontrol etkileşim eklendi (H3), 1:10 (H4) ve 1:100 (H5). Negatif kontroller vardı: Bir Cd4d3 +4 yem av protein (H1) taranan ile probed ve Cd200R avını (H2). (B) üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir, aynı ekranın absorbans değerleri Kantitasyonu. Veri noktaları ortalama ± SD vardır.

Tartışmalar

Canlı hücreler in vivo olarak incelenirse, bunların plazma membranları son derece dinamik davranışları sergilerler: onlar ulaşın ve komşularıyla ² ile iletişim olarak uzanan ve kesintili olarak membran prosesleri. Bu temasların birçok arabuluculuk membran-gömülü reseptör proteinler arasındaki fiziksel etkileşim bu son derece hareketli davranış izin verecek şekilde son derece zayıf olduğu için evrim geçirmiştir. Bu 50 uM olarak zayıf gibi monomerik etkileşimi son derece güçlü ^2,10 meydan roman etkileşimleri tespit yapar fizyolojik reseptör yoğunlukları ⁹ spontan etkileşimleri sürmek için yeterli olabileceği tahmin edilmiştir. Düşük yalancı pozitiflik oranı ile ölçeklenebilir bir şekilde uygulanabilir protein etkileşimleri: Burada anlatılan AVEXIS yöntemi geçici ekstraselüler proteini tespit için hassas bir yöntem sağlar. Diğer yöntemler ölçülebilir, hücre dışı etkileşimler ^11-15 algılamak için geliştirilmiştir ikenAVEXIS bir avantaj gibi yem ve av faaliyetleri gibi deneysel parametrelerin düşük yalancı pozitiflik oranı ³ korurken bile (t _1/2 ≤ 0,1 s) etkileşimlerin zayıf algılamak için sayısal edilmiş olmasıdır. Buna ek olarak, akıcı ve sağlam numune hazırlama usul diğer testlere göre çok daha büyük ölçekte uygulanacak bu testte sağladı ve biz son ~ 16,500 potansiyel etkileşimleri üzerinde ¹⁶ toplam sistematik bir etkileşim ekranı tarif var.

Tahlil, bir çözünür rekombinant protein parçası ifade etmek mümkün olduğu için herhangi bir proteini üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinler gibi bir N-terminal sinyal peptit içeren protein içerir. Yakın zamanda şimdi bize yemler ¹⁷ olarak tip II proteinleri ifade edebilecekleri vektörler bir paketi tasarladık. Deneyi, genellikle bu tür iyon taşıyıcı olarak multipass zar proteinleri için uygun değildirs ya da doğru bir plazma zarı bağlamı dışında katlanmış olması olası değildir beri pompalar. Biz zebrabalıkları ^3,16,18, insan, fare ve P. hücre dışı proteinler farklı bir sistem çeşitliliği için bu başvurmuş ve başarıyla ifade ettiler etkileşim ekranlar için falciparum.

Bir AVEXIS ekran kurmak için gerekli kaynakları açısından, biz önemli bir darboğaz seçimi, inşaat, ve ifade plazmid dolu sıralama olduğunu bulduk. Yöntemi bu yönü ~ 100 yem ve yırtıcı yapılar yapmak için bir yıl kadar sürebilir, ancak, gen sentezi azalan maliyet, şimdi projenin bu yönü dış kaynak ticari lehine. Büyük bir titreme doku kültürü inkübatör (biz bir INFORS HT Multitron Hücre kullanın) ile birlikte memeli ekspresyon sistemi ifade ve ~ 100 yem ve yırtıcı proteinleri bir ay kadar normalleştirmek için tek bir araştırmacı sağlar. Proteinler üretilen ve s, normalize edilir kezetkileşimleri için creening rahatlıkla günlük işlenen on iki kadar 96-plakaları ile hızlıdır. Bu tür proteinleri çok sayıda üretimi kolaylaştırmak için geliştirilmiş ki yalnızca ısmarlama ekipmanı paralel bir 0.22μm filtre ile beş süpernatanlar kadar geçmesi için kullanılan bir sıkıştırılmış hava tazyikli bir piston.

Bu etkileşimlerin bazıları ³ tespit edilebilir ancak literatürde (yanlış negatif) beklenen etkileşimleri göre cevapsız olabilir etkileşimlerin ana sınıfı, homophilic etkileşimleri vardır. Beklenen etkileşimleri tespit edilmez durumlarda, bu daha sonra immobilize yem proteinleri ile daha fazla etkileşim engeller av proteinler (bir av "maskeleme" etkisi) tarafından homophilic etkileşimlerin oluşumundan dolayı olduğuna inanıyorum. Etkileşimler tespit edilir frekansı taranan proteini kütüphanesinin içeriği bağlıdır. Okuyucu için bir rehber,> 30 bir ekran olarak, Zebrabalıkları immünglobülin süper ailesi içinde 000 etkileşimleri 188 pozitif sonuçlandı -% 0.6 ^3,16,18 bir frekans. Herhangi bir olumlu hit doğrulamak için yapılabilir çok çabuk kontrol etkileşimi yem-av yönelimleri hem de tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için;, aynı etkileşimi bir yem ya olarak bağlayıcı proteinlerin mevcut olup olmadığına bakılmaksızın tespit edilebilir olduğunu ya da bir av. Bu davranış gözlemledik ileri geri çalışma zaman, bağlayıcı sonradan yüzeysel plasmon rezonans kullanılarak saflaştınlmış protein bağlayıcı doğrudan doyabilen göstererek spesifik olarak gösterilmiştir. Bizim yapay yem proteinleri pentamerising tarafından bağlanma isteğini artırmak, çünkü biz nicelik etkileşim gücünü karşılaştırmak için uygun tahlil düşünmüyoruz olduğu vurgulanmalıdır. Biz monomerik proteinler ve yüzey plazmon rezonans kullanmak etkileşimlerin biyofiziksel bağlama parametrelerini elde etmek. Son olarak, bir kez bir etkileşim tespit edilmiştir, hitestin gh throughput doğası, antikorlar veya etkileşimi engellemek küçük moleküller gibi reaktifler için ekrana test uyum nispeten kolay hale getirir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Cat. Numara	Yorumlar
Freestyle medya	Invitrogen	12338018
Nitrosefin	Calbiochem	484400
SA kaplı mikrotitre plakalar	Nunc	734-1284
OX68 antikoru	AbDSerotec	MCA1022R
Diyaliz boru	Delmek	PN68100
Polimiksin B	Sigma	P4932
D-biotin	Sigma	B4639-5G
Yüzey-104	Sigma	1040-506
Vivaspin-20 santrifüj konsantratörü	Sartorius	VS2002
0,22 um filtreler	Nalgene	190-2520