מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.

Abstract

המחקר של תגובות תא לשינויים סביבתיים מציב אתגרים ניסיוניים רבים: תאים צריכים להיות צלמו בתנאים משתנים, לעתים קרובות באופן השוואתי. צלחות Multiwell משמשות באופן שגרתי להשוואת זנים רבים ושונים או קווים סלולריים, אבל תאפשרנה שליטה מוגבלת על דינמיקת הסביבה. התקני microfluidic, לעומת זאת, מאפשרים שליטה דינמית מעולה על התנאים סביבו, אבל זה מאתגר לתמונה ולהבחין יותר מכמה זנים בם. כאן אנו מתארים שיטת קלות ובמהירות לייצור מכשיר מסוגל ליישם תנאים משתנים באופן דינאמי לזני שמרים שונים מרובים בערוץ 1 microfluidic. המכשיר תוכנן ויוצר באמצעים פשוטים, ללא צורך ביתוגרפיה הרכה. הוא מורכב מערוץ זרימה בצורת אות V מצורף לשכבה שנייה מחסה microwells. הזנים ממוקמים בmicrowells הנפרד, וצלמו תחת בדיוק מאותם תנאים דינאמיים. אנו הדגמהnstrate השימוש במכשיר למדידת תגובות לוקליזציה חלבון לפולסים של שינויים תזונתיים בזני שמרים שונים.

Introduction

תאים כל זמן מגיבים לסביבה דינמית, על ידי שינוי חילוף החומרים שלהם, פרופיל שעתוק והפונקציות סלולריות. כדי ללמוד על תופעות אלו, שיטות שניתן לכמת שינויים נדרשות. סוג אחד של readout לתגובות כאלה הוא השינוי בלוקליזציה של גורמי שעתוק קשורים לחץ בתגובה ללחץ תזונתי.

מכשירי microfluidic ¹ היו בשימוש באופן דינמי לתפעל תנאים סביבתיים לתאי ^2-4. הם מציגים מספר יתרונות להדמית תא חייה: הסביבה של התאים ניתן לשלוט במדויק ובאופן דינמי השתנתה; תאים יכולים להיות חי בהדמיית בכל העת, לרבות במניפולציה של תנאים חיצוניים, וכרכים מגיבים מינימאליים נדרשים. עיצוב פשוט מאוד למכשיר microfluidic, המאפשר להתחלפות בין שני תנאים, הוא מכשיר בצורת אות V ^2. אנו משתמשים באופן שגרתי מכשירי Y בצורה המאפשרים microfluidicיישום של שינויים דינמיים בתאים בערוץ. אנו משתמשים במכשיר זה כדי לעקוב אחר שינויי לוקליזציה של גורמים מתויגים fluorescently לחץ הקשורים שעתוק בתאי שמרים. אנו עוקבים אחר שינויים אלה תחת תנאים משתנים תזונתיים. לדוגמה, אנו יכולים לספק לדופק (או סדרה של פולסים) של גלוקוז המכיל בינוני תוך תקופה של אי גלוקוז בינוני, ברזולוציה של זמן עדינה מאוד. לעתים קרובות בניסויים כאלה, אחד הוא מעוניין בהשוואת התשובות של זני תאים שונים (לדוגמה, מוטציות שונות, או מבודד בר שונה). ערוץ Y בצורה מוגבלת לזן אחד בכל ערוץ - אם זן אחד או יותר משמש, אין דרך פשוטה להבדיל בין הזנים. כדי להתגבר על זה, ערוצים שונים ניתן להשתמש. אם אנחנו רוצים להחיל את תנאי הדינמיקה זהות לזנים רבים, ברצוננו לשלב את מושג ה-Y ערוץ עם מספר רבים של ערוצים. ישנם שני אתגרים ביישום פתרון זה: זה יכול להיות קשה ליישם tהוא אותם תנאים באותו זמן לכל הערוצים, וקיים מגבלה גיאומטרית למספר ערוצי Y שיכול להיות מצויד במכשיר אחד. לפיכך, אנו מחפשים את הדרך לצפייה במספר זנים בערוץ אחד בתנאים דינאמיים.

כאן אנו מתארים מכשיר microfluidic 2 שכבתי המיועד לזנים מרובים הדמיה בערוץ 1 באותם תנאים דינמיים. השכבה התחתונה מורכבת הדק PDMS עם שורה של חורים. שכבה זו מחוברת לcoverslip זכוכית יצירת בארות שלתוכו אנו מניחים את הזנים השונים, דבקותם בConcanavalin לזכוכית. השכבה השנייה היא מכשיר microfluidic בצורת אות V שנוצר באמצעות שיטת נייר הדבק ^5. לאחר שהניח את הזנים בבארות השכבה השנייה מיושרת במהירות ובמצורפת לראשון, יצירת ערוץ אחד עם כמה בארות המכילות את הזנים השונים. מכשיר זה מאפשר סופי לאחר מספר זנים בערוץ אחד, שבו כלזנים כפופים לאותם תנאים באותו הזמן בדיוק. כל תהליך התכנון וייצור יכולים להיעשות על benchtop, תוך שימוש באמצעים פשוטים, ללא יתוגרפיה הרכה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. יצירת מאסטר ויסקי קלטת ⁵

1. לצייר או להדפיס את הפריסה רצויה microchannel, להתרחב, על נייר. במקרה שלנו העיצוב מורכב משני ערוצים בצורת אות V, כל 3 מ"מ רחב (איור 2).
2. כיסוי זכוכית שקופית עם שכבות של נייר דבק. מספר השכבות יקבע את הגובה של הערוץ (כ 60 מיקרומטר לשכבה). אנחנו השתמשנו 3 שכבות נייר דבק.
3. הנח את עיצוב הפריסה על משטח שטוח. יישר את השקופית על תבנית העיצוב. בזהירות לחתוך את הסרט בשקופית הזכוכית עם אזמל על פי הפריסה.
4. הסר את הנייר הדבק מכל האזורים של שקופית הזכוכית, למעט אלו בפריסה של microchannel.
5. הנח את השקופית בתנור חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות. לנקות בעדינות עם אתנול.

2. בודת מכשיר microfluidic PDMS

1. מערבב את מרכיבי הבסיס וריפוי של PDMS כפי שהומלץ על ידי היצרן. אנו משתמשים 10:01יחס בין הבסיס לסוכן ריפוי. יוצק על 30 מ"ל של תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי לגובה של ~ 0.5 סנטימטר. הדגה PDMS בואקום במידת צורך. להטביע את שקופיות הזכוכית בPDMS עם נייר הדבק בדוגמת פונה כלפי מעלה. הצבת התבנית לאחר PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין השקופיות ובתחתית צלחת. תרופה ל48 שעות על 65 מעלות צלזיוס, ולוודא את הצלחת היא אופקית באמצעות רמת בועה.
2. בצלחת פטרי חדשה 90 מ"מ לשפוך 3 מ"ל של PDMS תערובת, וכתוצאה מכך שכבה על 0.5 מ"מ עמוק. (אם coater ספין זמין, ניתן להשתמש בו בשלב זה).
3. דגה ולרפא כמו ב2.1.
4. בעדינות לחתוך את מכשיר microfluidic לגודל רצוי עם אזמל. שכבה זו ניתן לכנות "שכבת הזרימה".
5. גזור חתיכה בגודל דומה של השכבה הדקה PDMS מהמנה השנייה פטרי. זו ניתן לכנות "שכבת הבארות".
6. השתמש אגרופן ביופסיה בגודל המתאים (אנו משתמשים מזהים מ"מ 1.2) כדי לנקב חורים לפתחי הכניסה והשקעים בשכבת הזרימה.
7. הנח את שכבת הבארות בשקופית זכוכית עבה על פריסת העיצוב ואגרוף את הבארות, באמצעות 2 מ"מ אגרופן ביופסית זהות, בתיאום עם את microchannels על הפריסה.
8. נקה שתי שכבות PDMS כמו גם 24 מ"מ coverslip זכוכית x 60 מ"מ עם אתנול. להתייבש באוויר ולשמור על ניקיון.
9. פלזמה לטפל גם coverslip הזכוכית ובארות השכבה PDMS או באמצעות חרט סטנדרטי הפלזמה (עבור מליטה שאינה הפיכה) או מוחזק ביד ⁶ treater עטרה למליטה הפיכה. זהירות למקם את שכבת הבארות על גבי coverslip לגרום להידבקות (איור 3). לשפשף בעדינות את כל בועות אוויר (במידת צורך).

3. ניסוי הדמיה ניידת

1. ודא שיש לך את המדיה הרצויה מוכן במזרקים המתאימים מחוברים לצינורות פלסטיק גמישים בקוטר הפנימי של 0.02 "(Tygon) במשאבת המזרק.
2. לגדול ס זני cerevisiae לשלב הרצוי בYPD הנוזלי. מערבולת ביסודיות והמקום 300 μl של כל זן לתוך צינור microcentrifuge.
3. מניח בעדינות μl 1 מתוך Concanavalin (סיגמא) 2 מ"ג / מ"ל ​​לכל באר. לשטוף את Concanavalin עודף מכל באר מים פעמים על ידי pipetting בעדינות.
4. בעוד Concanavalin מתייבש, לשטוף פעמים עם 300 זנים של μl בינוני SC חסר גלוקוז. כביסת גלוקוז השיורי מקירות התא מסייעת דבקות ראויה לConcanavalin א
5. תאי ורטקס ביסודיות. פיפטה μl 0.75 או פחות מכל השעית תא לתוך היטב משלו (איור 3). לשטוף בעדינות את תאי שייר עם מדיום עשיר. את שני השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות כדי למנוע מתאים מתייבשים.
6. פלזמה לטפל בשבב ואת הבארות באופן יסודי באמצעות treater עטרת כף יד, נזהר שלא לפגוע בבארות באופן ישיר. זהירות למקם את השבב על הבארות, הקדשת תשומת לב לתיאום בין השניים (צעד זה יכול להיעשות תחת סטריאוסקופ). לחץ בעדינות על לדבוק בשתי השכבות של פ"דטרשת נפוצה. לאט לאט למלא את המכשיר לחלוטין עם כ 50 מדיום עשיר μl, ולוודא אין בועות אוויר השאיר בתוך הערוץ.
7. חבור את המכשיר, החדרת הצינורות אל פתחי הכניסה המתאימים ולהתחיל זרימת מדיה. תדאג שלא בועות אוויר הוכנס למכשיר כמו אלה יכולים להיות מסובכים להסרה, וזאת ניתן להשיג על ידי ניתוק כניסה או יציאה ועדינות קשה על המכשיר שבו הבועות, נזהר שלא לשבור את coverslip הזכוכית.
8. מקום תחת מיקרוסקופ ולמצוא נקודתי הדמיה מתאימות בכל אחד גם.
9. לשמור על התאים תחת זרימה בינונית עשירה ל1 שעות או יותר כדי לאפשר התאוששות במידת צורך.
10. התחל את הניסוי: אנו משתמשים זרימה מתמדת מכל אחת משתי משאבות המזרק כדי למנוע זרימה חוזרת של התקשורת, שינוי ספיקות יחסי כרצונך. הגדרת משאבת A ל 0.8 מ"ל / שעה והמשאבה B ל -0.2 תוצאות מ"ל / שעה במדיום זורם מעל 80% מרוחב התעלה (איור 4). זה יכול להיות דינאמי גנתלה על ידי שינוי שתי הספיקות. התנאים החדשים לייצב בתוך שניות לאורך כל אורכו של הערוץ ^2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים שצלמנו שני זני שמרים הנבדלים בבארות חלופיות. הדמית בארות מלאות לא מראות זליגת תא בין הבארות (איור 5 א, ב). שני הזנים יש MSN2 גורם השעתוק תויג YFP. כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתנאי סימולטני באופן דינמי, שהחלפנו את הספיקות בשני ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת benchtop מכשיר microfluidic המאפשר בו זמנית מספר זני שמרים הבאים בתנאים דינאמיים. לאחר מספר זנים בערוץ אחד מספק כלי אמין להשוואה בין דינמיקה של תגובות תא בודדות בזנים מרובים. אחד יתרונות של הגישה שלנו הוא היכולת להמציא את המכשיר בטכניקות פ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב / ציוד	חברה	מספר קטלוגים
PDMS-SYLGARD 184	Dow Corning ארה"ב
ייבוש אבק	Nalgene	5310-0250
ביופסית בוקרים	טד פלה בע"מ	אריס Uni-Core 15076 (2 מ"מ), 15074 (1.2 מ"מ)
משאבות מזרק	Chemyx	היתוך 200
קורונה treater	מוצרי אלקטרו technic	BD-20
צינורות Tygon	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-	סיגמא	C7275
נייר דבק	3M ויסקי	קלטת שקופה 1/2 "