Un dispositif microfluidique pour l'étude de plusieurs souches distinctes

Résumé

Nous présentons une méthode simple pour produire des dispositifs microfluidiques capables d'appliquer les mêmes conditions dynamiques à plusieurs souches distinctes, sans avoir besoin d'une salle blanche ou lithographie douce.

Résumé

L'étude des réponses cellulaires aux changements environnementaux pose de nombreux défis expérimentaux: les cellules doivent être imagé dans des conditions changeantes, souvent de manière comparative. Plaques multipuits sont couramment utilisées pour comparer différentes souches ou des lignées cellulaires, mais de permettre un contrôle limité sur la dynamique de l'environnement. Dispositifs microfluidiques, d'autre part, de permettre exquise contrôle dynamique des conditions environnantes, mais il est difficile d'image et de distinguer plus de quelques souches en eux. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer facilement et rapidement un dispositif microfluidique capable d'appliquer les conditions changent dynamiquement à de multiples souches de levures différentes dans un même canal. L'appareil est conçu et fabriqué par des moyens simples, sans la nécessité d'une lithographie douce. Il se compose d'un canal d'écoulement en forme de Y attaché à une seconde couche hébergeant micropuits. Les souches sont placés dans des micropuits distincts, et imagée dans exactement les mêmes conditions dynamiques. Nous démonstrate l'utilisation du dispositif de mesure de la localisation des protéines réponses à des impulsions de changement de nutriments dans différentes souches de levure.

Introduction

Les cellules sont constamment réagir à un environnement changeant dynamiquement, en changeant leur métabolisme, profil transcriptionnel et fonctions cellulaires. Pour étudier ces phénomènes, les méthodes qui permettent de quantifier ces changements sont nécessaires. Un type de lecture de ces réponses est le changement dans la localisation des facteurs de stress liés à la transcription en réponse à un stress nutritionnel.

Dispositifs de microfluidique ¹ ont été utilisés pour manipuler dynamiquement des conditions environnementales dans les cellules ^2-4. Ils présentent plusieurs avantages pour l'imagerie de cellules vivantes: l'environnement des cellules peuvent être contrôlées avec précision et dynamique a changé, les cellules peuvent être imagée en direct à tout moment, y compris lors de la manipulation des conditions extérieures, et des volumes de réactifs minimales sont requises. Une conception très simple pour un dispositif microfluidique, permettant une alternance entre deux conditions, est un dispositif en forme de Y ^2. Nous utilisons régulièrement en forme de Y dispositifs microfluidiques qui permettentapplication des changements dynamiques aux cellules dans le canal. Nous utilisons ce dispositif pour suivre les changements de localisation des facteurs de stress marquées par fluorescence de transcription liés à des cellules de levure. Nous suivons ces changements dans l'évolution des conditions nutritionnelles. Par exemple, nous pouvons fournir une impulsion (ou une série d'impulsions) de glucose milieu contenant dans un délai de plus de glucose et moyen terme, à une résolution temporelle très fine. Souvent, dans ces expériences, on est intéressé à comparer les réponses des souches cellulaires différentes (par exemple, différents mutants ou différents isolats sauvages). Le canal en forme de Y est limitée à une souche dans chaque canal - si plus d'une souche est utilisé, il n'existe pas de moyen simple de faire la distinction entre les souches. Pour remédier à cela, les différents canaux peuvent être utilisés. Si nous voulons appliquer les mêmes conditions dynamiques de plusieurs souches, nous tenons à associer le concept Y-canal avec de multiples canaux. Il ya deux défis dans la mise en œuvre de cette solution: Il peut être difficile d'appliquer til mêmes conditions en même temps à tous les canaux, et il existe une limitation géométrique au nombre de canaux en Y qui peuvent être montés dans un seul appareil. Nous avons donc cherché un moyen pour visualiser plusieurs souches dans un canal dans des conditions dynamiques.

Ici, nous décrivons un dispositif à deux couches microfluidique destiné aux souches d'imagerie multiples dans un canal dans les mêmes conditions dynamiques. La couche inférieure est constituée de couches minces PDMS avec une rangée de trous. Cette couche est attachée à la lamelle de verre créant des puits dans lequel nous allons placer les différentes souches, les faire adhérer à la concanavaline A sur le verre. La seconde couche est un dispositif en forme de Y microfluidique créé en utilisant la méthode du ruban adhésif ^5. Après avoir placé les souches dans les puits de la seconde couche est rapidement alignée et fixée à la première, la création d'une chaîne de plusieurs puits qui contiennent les différentes souches. Ce dernier dispositif permet de suivre plusieurs souches dans un canal, où tous lessouches sont soumis aux mêmes conditions à la même heure. Toute la conception et de la production qui peut être fait sur la paillasse, avec des moyens simples, sans la lithographie douce.

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Protocole

1. Création d'un Master Scotch-ruban ⁵

1. Dessiner ou imprimer souhaité mise à microcanaux, à l'échelle sur du papier. Dans notre cas, la conception se compose de deux canaux en Y, chacun 3 mm de large (figure 2).
2. Couvrir d'un verre coulissant avec des couches de scotch. Le nombre de couches détermine la hauteur du canal (environ 60 um par couche). Nous avons utilisé 3 couches scotch.
3. Placer le schéma de configuration sur une surface plane. Aligner la glissière sur le modèle de conception. Découpez soigneusement le ruban adhésif sur la lame de verre avec un scalpel en fonction de la mise en page.
4. Enlever le scotch de toutes les régions de la lame de verre, sauf ceux de la mise en page du microcanal.
5. Placer la lame dans un four de chauffage à 65 ° C pendant 2-3 min. Nettoyer délicatement avec de l'éthanol.

2. Fabrication d'un dispositif microfluidique PDMS

1. Mélanger la base et composants durcisseurs de PDMS comme recommandé par le fabricant. Nous utilisons une 10:01rapport de la base à l'agent de durcissement. Verser environ 30 ml de mélange PDMS dans une boîte de Petri à une hauteur de ~ 0,5 cm. Dégazer le PDMS dans le vide si nécessaire. Plonger la lame de verre dans le PDMS avec du scotch à motifs vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d'air entre la lame et le fond plat. Cure de 48 h à 65 ° C, en s'assurant que le plat est à l'horizontale à l'aide d'un niveau à bulle.
2. Dans un nouveau plat de Pétri de 90 mm verser 3 ml de mélange PDMS, résultant en une couche d'environ 0,5 mm de profondeur. (Si la tournette est disponible, il peut être utilisé pour cette étape).
3. Degas et guérir qu'en 2.1.
4. Découper délicatement le dispositif microfluidique à la taille désirée avec un scalpel. Cette couche sera appelée "couche d'écoulement".
5. Découpez un morceau de taille similaire de couche mince PDMS à partir du second plat de Pétri. Ce sera dite "couche de puits".
6. Utiliser un perforateur de taille appropriée biopsie (On utilise 1,2 mm de diamètre) à percer des trous pour les entrées et les sorties de la couche d'écoulement.
7. Placer la couche de puits sur une lame de verre d'épaisseur sur la configuration d'poinçon et hors des puits, en utilisant 2 mm ID biopsie perforateur, en alignement avec les micro-canaux sur la mise en page.
8. Nettoyer les deux couches de PDMS ainsi que de couvre un verre 24 mm x 60 mm avec de l'éthanol. Sécher à l'air et à garder propre.
9. Plasma traiter à la fois la lamelle de verre et la couche de PDMS puits en utilisant soit graveur plasma standard (pour les non-réversible collage) ou un dispositif de traitement à main corona ⁶ pour collage réversible. Placer soigneusement la couche de puits au-dessus de la lamelle couvre-objet pour provoquer l'adhérence (figure 3). Frottez doucement les bulles d'air (si nécessaire).

3. Expérience d'imagerie cellulaire

1. Assurez-vous que le support souhaité dans des seringues prêtes appropriés reliés à des tubes en plastique flexibles d'un diamètre intérieur de 0,02 "(Tygon) dans la pompe seringue.
2. Cultivez S. cerevisiae à la phase désirée dans YPD liquide. Vortex fond et lieu à 300 μl de chaque souche dans un tube à centrifuger.
3. Placez délicatement 1 pl de la concanavaline A (sigma) 2 mg / ml dans chaque puits. Laver la concanavaline A l'excès de chaque puits deux fois par pipetant doucement l'eau.
4. Alors que la concanavaline A est le séchage, laver deux fois avec 300 souches ul de milieu SC dépourvu de glucose. Lavage du glucose résiduel à partir des parois cellulaires permet une bonne adhérence à la concanavaline A.
5. Vortex cellules à fond. Pipeter 0,75 pi ou moins de chaque suspension cellulaire dans son propre puits (figure 3). Lavez délicatement les cellules résiduelles avec un milieu riche. Les deux étapes suivantes doivent être effectuées rapidement afin d'empêcher les cellules de se tarir.
6. Plasma traiter la puce et les puits à fond en utilisant l'appareil de traitement corona à main, en faisant attention de ne pas frapper directement les puits. Placez délicatement la puce sur le puits, en accordant une attention particulière à l'alignement entre les deux (cette étape peut être effectuée sous un stéréoscope). Appuyez doucement sur pour faire adhérer les deux couches de PDMS. Remplir lentement l'appareil complètement avec environ 50 ul milieu riche en s'assurant qu'aucune bulle d'air ne reste dans le canal.
7. Connectez l'appareil, insérer les tubes dans les entrées appropriées et commencer à flux média. Veillez à ce que les bulles d'air sont introduits dans l'appareil, car ils peuvent être difficiles à enlever, ce qui peut être accompli en débranchant une entrée ou de sortie et en tapotant doucement sur le périphérique où les bulles sont, en faisant attention de ne pas casser la lamelle de verre.
8. Placez-le sous microscope et trouver des points d'imagerie appropriées dans chaque puits.
9. Maintenir les cellules dans un milieu riche écoulement pendant 1 heure ou plus pour permettre la récupération en cas de besoin.
10. Commencez l'expérience: nous utilisons flux constant de chacun des deux pompes à seringues pour empêcher le retour des médias, en changeant les débits relatifs au choix. A la mise en pompe à 0,8 ml / h et la pompe B et 0,2 ml / hr élément de support d'un écoulement au-dessus de 80% de la largeur de la chaîne (figure 4). Cela peut être dynamiquement cpendu en changeant les deux débits. Stabiliser les nouvelles conditions dans les secondes sur toute la longueur de la chaîne ^2.

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Résultats

Pour démontrer la séparation entre les différentes souches nous imagée deux souches de levures distinctes dans les puits de rechange. Imagerie la pleine puits montre aucune fuite cellulaire entre les puits (figure 5a, b). Les deux souches ont le même facteur de transcription MSN2 marqués avec la YFP. Pour tester l'effet simultané de manière dynamique l'évolution des conditions, nous avons changé les débits dans les deux canaux d'entrée, créant ainsi une étape de milieu sans glu...

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Discussion

Dans cet article, nous présentons une méthode de paillasse simple pour créer un dispositif microfluidique qui permet suivants souches de levures plusieurs simultanément dans des conditions dynamiques. Après plusieurs souches dans un canal fournit un outil fiable pour comparer la dynamique des réponses des cellules individuelles dans des souches multiples. Un avantage de notre approche est la capacité à fabriquer le dispositif avec des techniques simples, sans la nécessité d'une salle blanche. En fait, nous...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif / équipement	Entreprise	Numéro de catalogue
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning USA
Dessiccateur à vide	Nalgene	5310-0250
Biopsie puncheurs	Ted Pella Inc	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15 074 (1,2 mm)
Pompes à seringues	Chemyx	Fusion 200
Corona purificateur	Electro-techniques des produits	BD-20
Tuyau Tygon	Tygon	S-54-HL
Concanavaline-A	Sigma	C7275
Ruban adhésif	3M Scotch	Ruban transparent 1/2 "