Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

Resumo

Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

Resumo

O estudo de respostas de células para as alterações ambientais coloca muitos desafios experimentais: as células têm de ser trabalhada sob condições variáveis, muitas vezes, de uma forma comparativa. Placas com vários poços são usados ​​rotineiramente para comparar várias espécies diferentes ou linhas de células, mas permitem um controle limitado sobre a dinâmica do ambiente. Dispositivos microfluidicos, por outro lado, permite o controle dinâmico requintado nas condições do ambiente, mas é um desafio para imagem e distinguir mais do que algumas estirpes neles. Aqui nós descrevemos um método para facilmente e rapidamente fabricar um dispositivo micro capaz de aplicar condições de alterar dinamicamente a várias cepas de leveduras distintas em um canal. O dispositivo está concebido e fabricado por meios simples, sem necessidade de litografia suave. É composto por um canal de fluxo em forma de Y ligado a uma segunda camada portadora micropoços. As estirpes são colocados em micropoços separados, e visualizados sob as mesmas condições dinâmicas. Nós demonstrate a utilização do dispositivo para a medição das respostas de localização de proteínas de pulsos de alterações de nutrientes em diferentes estirpes de levedura.

Introdução

As células são constantemente reagindo a um ambiente de alterar dinamicamente, alterando o seu metabolismo, o perfil de transcrição e funções celulares. Para estudar estes fenômenos, os métodos capazes de quantificar essas mudanças são necessárias. Um tipo de leitura para tais respostas é a mudança de localização de factores de transcrição relacionados com stress, em resposta ao stress nutricional.

Microfluídico dispositivos ¹ ter sido usado para manipular dinamicamente as condições ambientais para as células ^2-4. Eles apresentam várias vantagens para imagens de células vivas: o ambiente do que as células podem ser controladas com precisão e alterados dinamicamente, as células podem estar vivas, com imagens em todas as vezes, incluindo durante a manipulação das condições externas, e os volumes de reagentes mínimos são obrigatórios. Uma concepção muito simples para um dispositivo de microfluidos, que permite a alternância entre duas condições, é um dispositivo em forma de Y ^2. Nós usam rotineiramente em forma de Y dispositivos microfluídicos que permitemaplicação de mudanças dinâmicas para as células do canal. Usamos este dispositivo para acompanhar as mudanças de localização de fluorescente etiquetado estresse fatores de transcrição relacionados em células de levedura. Nós seguimos essas mudanças sob novas condições nutricionais. Por exemplo, pode-se fornecer um impulso (ou uma série de impulsos) de glucose contendo meio dentro de um período de não-glicose média, com uma resolução muito fina temporal. Muitas vezes, em tais experiências, um está interessado em comparar as respostas de linhagens celulares diferentes (por exemplo, os mutantes diferentes, ou diferentes isolados selvagens). O canal em forma de Y é limitada a uma estirpe de cada um dos canais - se mais do que uma estirpe é utilizado, não há nenhuma maneira simples para distinguir entre as estirpes. Para superar isto, os canais podem ser usados ​​diferentes. Se quiser aplicar as mesmas condições dinâmicas para várias cepas, gostaríamos de combinar o conceito Y canais com múltiplos canais. Existem dois desafios na implementação desta solução: Pode ser difícil de aplicar tele mesmas condições, ao mesmo tempo para todos os canais, e não é uma limitação geométrica do número de canais de Y que podem ser montados em um único dispositivo. Fomos, pois, procurando uma maneira para visualizar várias linhagens em um canal em condições dinâmicas.

Descrevemos aqui um dispositivo de duas camadas destinado a microfluídico estirpes de imagens múltiplas em um canal, nas mesmas condições dinâmicas. A camada inferior é constituída por PDMS fina com uma fileira de furos. Esta camada está ligada à lamela de vidro de furos em que irá colocar as diferentes estirpes, aderindo-as com concanavalina A para o vidro. A segunda camada é um dispositivo em forma de Y microfluídico criados usando o método da fita adesiva ^5. Depois de colocar as estirpes nas cavidades da segunda camada é rapidamente alinhados e ligados com a primeira, a criação de um canal com vários poços que contêm as diferentes estirpes. Este dispositivo permite a última sequência de várias estirpes de um canal, onde todosestirpes são submetidos às mesmas condições, no momento exacto mesmo. Este conjunto e processo de produção pode ser feito sobre a bancada, usando meios simples, sem litografia suave.

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Protocolo

1. Criando um Mestre ^Scotch-5

1. Desenhar ou imprimir desejado disposição de microcanais, à escala, no papel. No nosso caso, o desenho consiste em dois canais em forma de Y, cada uma com 3 mm de largura (Figura 2).
2. Cobrir uma lâmina de vidro com camadas de fita adesiva. O número de camadas irá determinar a altura do canal (cerca de 60 mM por camada). Foram usados ​​3 camadas de fita adesiva.
3. Coloque o projeto de layout em uma superfície plana. Alinhe o slide sobre o padrão de design. Cuidadosamente cortar a fita na lâmina de vidro com um bisturi de acordo com o layout.
4. Retire a fita adesiva de todas as regiões da lâmina de vidro, exceto aqueles no layout do microcanal.
5. Colocar as lâminas em um forno de aquecimento a 65 ° C durante 2-3 min. Limpar cuidadosamente com etanol.

2. A fabricação de um dispositivo micro PDMS

1. Misturar a base e os componentes de cura de PDMS, tal como recomendado pelo fabricante. Nós usamos uma mistura 10:1proporção da base para o agente de cura. Verter cerca de 30 ml da mistura de PDMS em uma placa de Petri a uma altura de ~ 0,5 cm. Desgasificar o PDMS em vácuo, se necessário. Corrediça submergir o vidro no PDMS com a fita Scotch padronizada voltada para cima. Colocar o padrão após o PDMS, evita a formação de bolhas de ar entre a corrediça e inferior do prato. Curar durante 48 horas a 65 ° C, garantindo que o prato está horizontal utilizando um nível de bolha.
2. Num prato de 90 milímetros novo Petri despeje 3 ml de mistura de PDMS, o que resulta em uma camada de cerca de 0,5 mm de profundidade. (Se um revestidor de rotação estiver disponível, ele pode ser usado para esta fase).
3. Degas e curar, como em 2.1.
4. Gentilmente cortar o dispositivo micro para o tamanho desejado com um bisturi. Esta camada será chamado de "camada de fluxo".
5. Corte um pedaço do mesmo tamanho de fina camada de PDMS da placa de Petri segundo. Isto irá ser chamado de "camada poços".
6. Usar um perfurador de biópsia de tamanho apropriado (Usamos 1,2 mm ID) para os furos para as entradas e as saídas da camada de fluxo.
7. Coloque a camada poços numa lâmina de vidro de espessura sobre a topografia e perfurador de poços, utilizando 2 mm ID perfurador de biópsia, em alinhamento com os microcanais no layout.
8. Limpar ambas as camadas de PDMS, bem como uma lamela de vidro de 24 mm x 60 mm com etanol. Ar seco e manter limpo.
9. Plasma tratar tanto a lamela de vidro e da camada de PDMS poços usando etcher plasma padrão (para ligação não-reversível) ou de um tratador de mão corona ⁶ para ligação reversível. Coloque cuidadosamente a camada de poços em cima da lamela para provocar a adesão (Figura 3). Esfregue suavemente para fora todas as bolhas de ar (se necessário).

3. Experimento imagens de células

1. Certifique-se de que você tem a mídia desejada pronto em seringas apropriadas ligadas a tubos flexíveis de plástico com diâmetro interno de 0,02 "(Tygon) na bomba de seringa.
2. Crescer S. cerevisiae para a fase desejada de YPD líquido. Vortex completamente e local μ 300l de cada estirpe num tubo de microcentrífuga.
3. Coloque suavemente 1 ul de Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml em cada poço. Lavar Concanavalina excesso Um de cada poço duas vezes com cuidado pipetando água.
4. Enquanto a Concanavalina A secagem é, estirpes lavar duas vezes com 300 ul de meio sem glicose SC. Lavagem glucose residual das paredes das células contribui para a aderência adequada Concanavalina A.
5. Células Vortex cuidadosamente. Pipetar 0,75 jil ou menos de cada suspensão de células no seu próprio bem (Figura 3). Gentilmente lavar células residuais com meio rico. Os dois passos seguintes devem ser realizadas rapidamente, a fim de evitar que as células se esgote.
6. Plasma tratar o chip e os poços, cuidadosamente, com o tratador de mão corona, tomando cuidado para não bater os poços diretamente. Com cuidado, coloque o chip nos poços, prestando muita atenção ao alinhamento entre os dois (este passo pode ser feito sob um estereoscópio). Pressione suavemente a aderir as duas camadas de PDMS. Encher lentamente o dispositivo completamente com cerca de 50 ul de meio rico, certificando-se de nenhuma bolha de ar é deixado no interior do canal.
7. Conectar o dispositivo, inserindo os tubos para as entradas adequadas e iniciar o fluxo de mídia. Ter cuidado para que nenhuma bolha de ar são introduzidas no dispositivo, tal como estas podem ser difíceis de remover, isto pode ser conseguido através de desconectar uma entrada ou saída e batendo suavemente no dispositivo em que as bolhas são, tendo cuidado para não romper a lamela de vidro.
8. Colocar sob microscópio e encontrar os pontos de imagem apropriados em cada poço.
9. Manter as células sob fluxo de meio rico durante 1 hora ou mais para permitir a recuperação, se necessário.
10. Iniciar a experiência: usamos fluxo constante de cada uma das duas bombas de seringa para impedir o refluxo dos meios de comunicação, alterando as taxas de fluxo relativas, como desejado. Configuração da bomba A a 0,8 ml / hr e B da bomba para 0,2 ml / hr resulta em meio A que flui ao longo de 80% da largura do canal (Fig. 4). Isto pode ser dinamicamente cpendurado alterando os dois caudais. As novas condições estabilizar dentro de segundos ao longo de todo o comprimento do canal ^2.

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Resultados

Para demonstrar a separação entre as diferentes estirpes que imaged duas estirpes de levedura distinguíveis em poços alternados. Imagiologia dos poços cheio mostra nenhuma fuga de células entre os poços (Figura 5a, b). Ambas as estirpes possuem o factor de transcrição MSN2 marcado com YFP. Para testar o efeito simultâneo de alterar dinamicamente condições, as taxas de fluxo ligado em dois canais de entrada, criando um passo de não-glicose média, o que resultou na localização de MSN2-YFP ...

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Discussão

Neste artigo, apresentamos um método de bancada simples para criar um dispositivo micro que permite seguintes cepas de leveduras simultaneamente vários em condições dinâmicas. Na sequência de várias estirpes de um canal fornece uma ferramenta fiável para comparar dinâmica de respostas de células individuais em várias estirpes. Uma vantagem da nossa abordagem é a capacidade para fabricar o dispositivo com técnicas simples sem a necessidade de uma sala limpa. Na verdade, nós também realizaram o protocolo pu...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente / Equipamento	Companhia	Número de catálogo
PDMS-184 SYLGARD	Dow Corning EUA
Exsicador de vácuo	Nalgene	5310-0250
Biópsia perfuradores	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15,074 (1,2 mm)
Bombas de seringa	Chemyx	Fusão 200
Corona tratador	Electro-técnica produtos	BD-20
Tubagem Tygon	Tygon	S-54-HL
Concanavalina-A	Sigma	C7275
Fita adesiva	3M Scotch	Fita Transparente 1/2 "