כינון ניאו איילט בכבד של עכברים סוכרתיים על ידי העברת גני Helper תלוי adenoviral וקטור בתיווך

Summary

אנו מתארים היווצרות כבדה הניא איון בSTZ (streptozotocin)-מושרה עכברים סוכרתיים על ידי העברת גנים מNeurogenin3 (Ngn3) וBetacellulin (BTC) באמצעות וקטור עוזר תלוי adenoviral (HDAd) והיפוך של היפרגליקמיה. השיטה שלנו לוקחת את היתרונות של וקטורי adenoviral עוזר תלויים עימם היעיל ביותר בתמרת vivo וביטוי הגנים לאורך זמן.

Abstract

סוכרת מהסוג 1 נגרמת על ידי הרס התא T בתיווך אוטואימונית של תאים המייצרים אינסולין, בלבלב. עד עכשיו החלפת אינסולין היא עדיין הטיפול העיקרי, משום איון ההשתלה הוגבלה על ידי זמינות תורם ועל ידי הצורך בדיכוי חיסוני לטווח ארוך. המושרה האיון neogenesis על ידי העברת גנים מNeuogenin3 (Ngn3), גורם שעתוק איון שושלת הגדרה הספציפית וBetacellulin (BTC), גורם גדילת איון יש הפוטנציאל לרפא סוכרת מסוג 1.

וקטורי adenoviral (מודעות) הם וקטור העברת גנים יעיל ביותר, עם זאת, המודעות של הדור הראשונה יש כמה חסרונות לשימוש בגוף חי. מודעות עוזרים תלויות (HDAds) הן מודעות המתקדמות ביותר שפותחו כדי לשפר את פרופיל הבטיחות של הדור הראשון של מודעות ולהאריך ביטוי transgene ^1. הם חסרים רעילות כרונית כי הם חסרי רצפי קידוד נגיפי ^2-5 וישמרו רק המודעות cis אלements דרוש לשכפול וקטור ואריזה. זה מאפשר שיבוט של עד 36 גני KB.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה להפקת HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC ולספק הווקטורים האלה לעכברים חולים סוכרת STZ מושרים. התוצאות שלנו מראות כי הזרקה משותפת של HDAd-Ngn3 ו'האיים 'ניאו HDAd-BTC גורם בכבד והופכת היפרגליקמיה בעכברים סוכרתיים.

Protocol

1. לשבט את הגנים הטיפוליים לוקטור ההסעות HDAd

1. שיבוט העכבר Ngn3 וBTC cDNAs לוקטור פלסמיד pLPBL1 המכיל מקדם התארכות גורם נפוץ-1 (BOS) ופולי אות. בסיום, לאמת וקטורים על ידי ניתוח ולאחר מכן רצף subclone קלטות אלו ביטוי להסעת pΔ28 HDAd ⁶ פלסמיד.
2. וקטורי Digest HDAd הסעות ידי PmeI כדי לשחרר את עמוד שדרת פלסמיד, לטהר DNAs ידי מיצוי האלכוהול פנול / כלורופורם / isoamyl אחריו משקעי אתנול ולגבש מחדש עם מי transfection כיתה.

2. הפקת הווקטור adenoviral Helper תלוי

ייצור הווקטור HDAd כרוך שלבים מרובים שיש אחריו בזהירות לתוצאות אופטימליות.

2.1 Transfection

1. ימים לפני 116 תאי transfection, זרעי ⁷ למנה 6-סנטימטר להגיע confluent 70-80% ביום transfection.
2. שלוש שעות לפני transfection, להסיר בינוניות ומוסיפות 5 מ"ל של מדיום גידול טרי [ממ בתוספת 10% FBS ו 1% PSG (פניצילין, סטרפטומיצין וגלוטמין), Invitrogen].
3. Transfect 116 תאים עם DNA 10 מיקרוגרם משלב 1.2), תוך שימוש בערכת Transfection ProFectionR יונקים מPromega על פי הוראות היצרן.
4. למחרת, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מדיום גידול פי 2. הוסף וירוס עוזר (HV) ב 500 חלקיקי וקטור (סמנכ"ל) / סלולרית ל0.1 מ"ל של סידן ומגנזיום המכיל PBS (PBS + +) וכיסוי לתאים. נער בעדינות את הכלים באופן שווה להפיץ HV כל 10 דקות.
5. אחרי 60 דקות, להוסיף 1.5 מ"ל של מדיום תחזוקה (MEM, 5% FBS, PSG% 1).
6. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך תחזוקה בינונית ביום למחרת.
7. שים לב לתאי CPE (אפקט Cytopathic - תאים להיות מעוגלים ומנותק). יותר מ 80% מתאים צריכים להראות CPE 2 ימים לאחר הדבקה.
8. איסוף lysate תא הגולמי (CVL, תאים ובינוניים),dd 10% נפח של סוכרוז 40% ולאחסן ב -80 ° C. CVL תויג כמעבר 0 - (CVL-P0).

הגברת וקטור 2.2

1. הקפאה (-80 ° C, 3-5 דקות) / פשרה (37 מעלות צלזיוס, 1-2 דקות) 3 פעמים.
2. שכבת 0.5 המ"ל CVL השלים עם HV ב/ תא 200 סמנכ"ל ל116 תאי confluent בצלחת 6-סנטימטר, ולטלטל את הצלחת בעדינות כל 5 דקות. לאחר 30 דקות, מוסיף בינוני תחזוקת 1 מ"ל.
3. הוסף 1 מ"ל של תחזוקה למחרת בינונית. 2 ימים לאחר מכן, רוב התאים צריכים להראות CPE.
4. איסוף CVL ולאחסן ב -80 ° C (CVL-P1) כפי שתואר על צעד 2.1.8).
5. חזור על התהליך עבור 3 פעמים כדי לקבל CVL P2-P4.
6. לחלץ דנ"א (דם DNeasy & קיט רקמות, Qiagen) בין 0.2 מ"ל של CVL נאסף בP1-P4, ולנתח את הגברת הווקטור ידי qPCR באמצעות פריימרים HV וHDAd ספציפיים (טבלה 1). השתמש בקטע שבו HDAd מוגבר באופן אקספוננציאלי ביחס לHV (P3 באיור 2) לsubsequenלא הליך.
7. שיתוף להדביק 116 תאים confluent 90% בצלחת 15 סנטימטר עם 0.5 המ"ל CVL וHV ב 200 סמנכ"ל / תא. Rock מנת עדינות כל 5 דקות. לאחר 30 דקות, מוסיף 10 מ"ל של מדיום תחזוקה.
8. הוסף 5 מ"ל של מדיום תחזוקה לאחר 24 שעות.
9. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1500 למשך 5 דקות בדיוק 48 שעות לאחר הדבקה.
10. Re-להשעות תאים ב1 מ"ל של PBS + + סוכרוז המכיל 4% (P5) והקפאה ב-80 ° C.

ייצור בקנה מידה גדול HDAd 2.3

1. כדי להכין 116 תאים לזיהום בתרבית תאי השעיה, להעביר 116 תאי confluent ב8 x מנת 15-סנטימטר לתוך בקבוק 3 ליטר טווה ולהוסיף מדיום גידול השעיה (Joklik modified MEM בתוספת 5% FBS, מ"ג / מיליליטר hygromycin 0.1 ו 1% PSG) לליטר סופי 1, ומדגיר CO ₂ חממה עם ספינינג ב 60 סל"ד ^8.
2. הוסף 0.5 ליטר של מדיום טרי כל יום במשך 2 ימים (סה"כ 2 ליטר).
3. ספירת תאים ביום השלישי. תאים מוכנים לשימוש אם לא הגיעסה"כ מספר o תא של 1x10 ^9.
4. להקפיא / להפשיר P5 3 פעמים.
5. איסוף תאים מבקבוק 3 ליטר טווה ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות. לחסוך 100 מ"ל של supernatant מחדש להשעות את התאים.
6. העברת תאים לבקבוק טווה 250-מ"ל. הוסף P5 וHV ב/ תא 200 סמנכ"ל לתאים ודגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C ב 60 סל"ד.
7. תאי העברה ובינוני לבקבוק 3 ליטר טווה, להוסיף מדיום גידול השעית L 2. העברת השעית תא 1 מ"ל לטוב בצלחת 12-גם לשמור על התאים לCPE.
8. דגירת תאים בבקבוק טווה במשך 2 ימים בCO ₂ חממה ב 60 סל"ד.
9. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ומחדש להשעות עם 15 המ"ל 100 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0) ולאחסן ב -80 ° C (P6) עד טיהור.

טיהור וקטור 2.4

1. הוסף 1.0 מ"ל של 5% deoxycholate נתרן לP6. מערבב בעדינות והדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
2. הוסף 400 μl של 2 מ 'MgCl _2, 300 μl של RNase (10 מ"ג / מ"ל), ו300 μl של DNase (10 מ"ג / מ"ל) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך השעה 1.
3. צנטריפוגה XG ב 6000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאסוף supernatant.
4. לעקר 65 צינורות ultracentrifuge NVT (Beckman) תחת אור UV במשך השעה 1 במכסת מנוע תרבית רקמה.
5. הוסף 2.8 מ"ל של פתרון צפיפות נמוכה CsCl (1.25 גרם / מ"ל), 2.8 מ"ל של פתרון הצפיפות CsCl צפיפות גבוהה ביסוד (1.41g/ml) ולאחר מכן 5-6 מיליליטר הכיסוי של supernatant למלא את הצינורית לצוואר. השתמש 100 מ"מ טריס-HCl (pH8.0) כדי למלא את הצינור במידת צורך.
6. צנטריפוגה ב 10 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 50000 סל"ד ב 10 ° C עם קמן LE-80k שימוש NVT-65 הרוטור.
7. נגב את האזור עם אתנול 70% עבור נקב מחט, ולאסוף את הלהקה המנצנץ הנמוכה עם מזרק 3-מ"ל המצויד במחט 22-G על ידי לנקב צד (איור 3 א). לפעמים להקת עוזר מאוד קלושה שניתן לראות מתחת ללהקת הווקטור הבולטת יותר. נסה לקבל כמה שיותר מהדואר להקת וקטור ככל האפשר, בלי להקת העוזר. זה מקובל בשלב זה, גם אם חלק מלהקת עוזרו aspirated, כפי שיופרד בצנטריפוגה הלילה לאחר שלהלן.
8. מניח את הרצועות שנאספו לתוך צינורות ultracentrifuge מעוקרים חדשים. מלא את הצינורות לצווארו על ידי כיסה 1.35 גרם / מיליליטר פתרון צפיפות CsCl.
9. צנטריפוגה ב 10 ° C ב 50000 סל"ד בן הלילה. לאסוף את הלהקה המנצנץ (איור 3 ב).
10. להעביר את הלהקה לדיאליזת קלטת (Slide-a-Lyzer, 10,000 MWCO, Thermo-מדעי).
11. דיאליזה נגד 3 L של 10 מ"מ autoclaved Tis-HCl, 7.2 pH המכילים 2 מ"מ MgCl ₂ ו 4% סוכרוז ב 4 ° C למשך הלילה.
12. הסר את וקטור HDAd מקלטת דיאליזה. 20 μl aliquot לכייל פיזי ו50 μl לאפיון ה-DNA. (הערה: לNgn3 וקטור, חזור פעמים "P6" שלושה וקטורים להשיג מספיק מאז התשואה של HDAd-Ngn3 היא עניה לעומת HDAd-BTC או HDAd ריק.)

2.5 אפיון של וקטורי HDAd

1. לקבוע את כייל הפיזי (סמנכ"ל / מ"ל) באמצעות צפיפות אופטית (OD). הוסף וקטור μl 20 או חיץ דיאליזה 20 μl לחיץ TE μl 380 המכיל 0.1% SDS ולדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מדוד OD ב260 ננומטר. כייל הפיזי = x 1.1 x OD260 10 ¹² x 20 (סמנכ"ל / מ"ל).
2. נתח את הזיהום על ידי HV qPCR. השתמש aliquot 50μl לחלץ דנ"א באמצעות רקמת DNeasy / ערכת חילוץ דנ"א דם (Qiagen). דלל את ה-DNA 1000-לקפל ולקחת 5 μl לניתוח qPCR באמצעות עוזר ופריימרים ספציפיים לוקטור (טבלה 1). זיהום העוזר צריך להיות פחות מ 1%, כפי שמוצג באיור 4 א.
3. השתמש כתם דרום לנתח את מבנה וקטור. ביצוע ניתוח דרום כתם ¹⁰ באמצעות בדיקה החוזרת למסוף הפוך (ITR). תוצאת הנציג מוצגת באיור 4 ב.
4. לקבוע ביעילות מבחנה. להדביק ידועמספר של 116 תאים בצלחת גם 12 עם וקטור HDAd ב 1000 / תא הסמנכ"ל ארבעה פעמים. קציר התאים לאחר 48 שעות ולחלץ רנ"א כדי לקבוע ביטוי של mRNAs Ngn3 וBTC ידי qRT-PCR (טבלה 1). נציג תוצאות מוצגות באיור 5.

3. טיפול בעכברים סוכרתיים ידי HDAd-Ngn3 ו- BTC

3.1 אינדוקציה של סוכרת בעכברים והזרקה של וקטורי HDAd

1. הכנת STZ: הכן את חיץ ציטרט 0.1M, ולהתאים לPH 4.3-4.5. סנן זה דרך מסנן מזרק 0.22 מ"מ. שימוש במים סטריליים לדלל זה ל0.01 M Na ציטראט pH 4.2-4.5. לפזר כמות מתאימה של STZ (סיגמא) בפתרון זה כדי להשיג ריכוז סופי של 12.5 מ"ג / מ"ל. בריכוז זה אין משקעים. שמור על פתרון STZ זה ב 4 ° C עד השימוש. להביא את הטמפרטורה של פתרון ההזרקה לטמפרטורת חדר מייד לפני ההזרקה. שאול פתרון STZד להיות מוכן טרי בכל יום והזריק בתוך דקות 5-10 של מומס.
2. הזרק STZ פתרון intraperitoneally זה (10 μl / GM כדי להשיג מינון של 125 מיקרוגרם משקל / g גוף), בשעתי הערב בין השעות 5-7 (לפני שהאורות כבויים במתקן העכבר והעכברים להתחיל להאכיל באופן פעיל), בשני ימים עוקבים ^9.

3.2 הניטור גלוקוז עכברים והזרקה של וקטורי HDAd.

1. עכברים מהירים ל6 שעות ומשקל גוף ומידת הגלוקוז בדם שבועי עד עכברים יש היפרגליקמיה (≥ 250mg/dl). השתמש Glucometer נגיעה אחת לדם שנאסף על ידי חיתוך זנב. ברגע שרמת סוכר בדם היא ≥ 250 מ"ג / ד"ל, בדוק מחדש הגלוקוז בדם שוב ב48 שעות לאחר 6 שעות במהירות כדי להבטיח היפרגליקמיה ודם מתמשך גלוקוז הוא בתחום היעד לטיפול: 250-500 מ"ג / ד"ל.
2. טיפול בעכברים עם היפרגליקמיה מתמשכת על ידי הזרקה תוך ורידית אחת של וקטורי HDAd דרך וריד זנב. המינון הכולל הוא וקטור 6x10 ¹¹ סמנכ"ללכל קבוצות הטיפול (ב0.25 מ"ל): ¹¹ 5x10 סמנכ"ל Ngn3 1 x10 ¹¹ הסמנכ"ל BTC לקבוצת טיפול משולב; 5x10 ¹¹ סמנכ"ל Ngn3 + 1x10 ¹¹ סמנכ"ל לNgn3 קבוצה; ^ו11 הסמנכ"ל BTC + וקטור 1x10 5x10 ¹¹ סמנכ"ל ריק לקבוצה וBTC 6x10 וקטור ¹¹ סמנכ"ל ריק לקבוצת ביקורת.
3. הזרקת וריד זנב. שים את העכברים לTailveiner עוצר (טלביזיה-150, Braintree המדעי Inc), ולהשתמש במים חמים כדי להרחיב את ורידי הזנב, לנקות את הזנב עם אלכוהול 70%. לשמור על זנב מתחת למקום ההזרקה בין אגודל ואצבע של היד, השתמש ביד אחרת להזרקה. לפני הזרקה לוודא שאין בועות במזרק (באמצעות מחט 30 ^{1/2 גר} ומזרק 1 מ"ל). הכנס מחט ולהזריק וקטור לאט. אם המחט היא בווריד, בזק של דם ניתן לראות בטבורה של המחט וגם לא קיימת התנגדות בהזרקה. לאחר הסרת המחט, החזק את אתר ההזרקה עם גזה לעצירת דימומים לפני חזרת עכברי to כלוב.
   אם המחט היא לא בווריד קיימת התנגדות משמעותית להזרקה תת עורית וwheal קטן מתעורר. בשלב זה להסיר את המחט ונסה שוב באתר אחר.

3.3 ניתוח של השפעות של טיפול HDAd-Ngn3 + HDAd-BTC.

1. צג גלוקוז 6 שעתי צום ומשקל גוף שבועי לאחר טיפול וקטור.
2. איסוף דם מוריד saphenous הווריד או זנב ברגל כל 2 שבועות לאינסולין assay (ELISA ערכת אינסולין מאוס, Mercodia) ואנזימי כבד (AST ו ALT ריאגנטים אינפיניטי, Thermo Scientific) באמצעות ערכות מסחריות.
   1. הנח את העכבר בצינור לא אטום 50 מ"ל פלקון עם חורים שנעשו בסוף הסגור.
   2. ראשו של העכבר הוא בסוף הסגור של הצינור ורגליים והזנב בצד הפתוח של הצינור. כדי לאסוף דם מהרגל השמאלית, להאריך את רגל השמאל מחוץ לצינור ועדינות לצבוט את העור של הירך בין האגודל לאצבע כדי לשתק את הרגל.
   3. להשתמשמכונת גילוח כדי להסיר את השיער מהשוק / אזור רגל תחתונה, כדי לחשוף את וריד saphenous, אשר נמצא בצד הלטרלי של הרגל התחתונה. נקה את העור המגולח עם אלכוהול 70% ולתת לו להתייבש.
   4. לנקב את וריד saphenous עם מחט מד 25, לאסוף את הדם עם צינור CB300 Microvette (Sarstedt) ולשים את הצינורות על הקרח.
   5. לחץ על אתר לנקב עם גזה לעצירת דימומים לפני ההחזרה לעכברים לכלובים.
   6. צנטריפוגה את הצינורות ב3000 XG למשך 5 דקות, לקחת את supernatant והחנות ב -20 ° C לניתוח נוסף.

3.4 בצעו בדיקת העמסת סוכר (GTT) בגיל 6 שבועות לאחר טיפול.

1. מומס D-גלוקוז (סיגמא) במים מזוקקים כדי להפוך גלוקוז 15% (15 ג'/ 100 מ"ל) וסטרילי מסנן גלוקוז.
2. עכברים מהירים עבור 6 שעות. השתמש בכרית חמה כדי לחמם את העכברים ולאסוף את הדם (0 נקודת זמן דקות). אז מזריק 1.5 גרם / קילו IP D-גלוקוז (10 μl / גרם של גלוקוז 15%).
3. Colבוחר בי דם בגיל 15, 30, 60, 120 דקות.
4. למדוד את רמת הסוכר ואינסולין בכל הדוגמות האלה.

ניתוח רקמות 3.5 להעריך את הביטוי של הווקטורים ולהעריך את האינדוקציה של האיון neogenesis.

בכל הצעדים הללו הבקרות הנדרשות אמין לפרש את התוצאות כוללות: (1) וקטור ריק טופל עכברים סוכרתיים (2) עכברים שאינם סוכרתיים ו( 3) לבלב שאינו סוכרתי המשמש כביקורת חיובית לביטוי האיון הורמונים מסוימים וגורמי שעתוק.

1. כבד ולבלב בקציר 3 ו 6 שבועות לאחר טיפול. מחלקים ל 2 חלקים, הראשון להקפאת צמד בחנקן נוזלי ובאחסון -80 ° C לרנ"א והפקת חלבונים, והשנייה כדי לתקן עם 10% פורמלין לילה לניתוח אימונוהיסטוכימיה.
2. חלץ רנ"א ידי פרוטוקול סטנדרטי ולנתח ביטוי של הורמונים מסוימים איון וגורמי תעתיק, יחד עם Ngn3 וBTC לconfirביטוי מ 'וקטור, בכבד על ידי qRT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים ^{9, 10.}
3. חלץ אינסולין ו-c-פפטיד מהכבד על ידי שיטת חילוץ חומצת אתנול ולכמת ידי ELISA ערכה מסחרית (assay אולטרה רגיש לאינסולין, Mercodia, C-פפטיד ELISA ערכה, Wako).
4. בצע immunostaining להורמונים מסוימים איון (אינסולין, גלוקגון, PP, SST) יחד עם גורמי שעתוק ספציפיים איון בפרפין המוטבע ^{9 סעיפים, 10.} הביטוי של Ngn3 וBTC יכול גם להיות מאושר על ידי immunostaining.

4. נציג תוצאות

אנו משובטים Ngn3 וBTC cDNA לתוך pΔ28 וקטורים מונעים על ידי האמרגן eIF2a כל מקום (BOS) ונוצרו HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC. כפי שמוצג באיור 2, זיהום HV יחסי ירד באופן משמעותי (רומז הגברת וקטור יותר והגברת עוזר פחות) במעבר 3. לכן, השתמשתי P3 לייצור וקטור שלאחר מכן. אחרי 1השיפוע רציף CsCl וultracentrifugation, אספו את להקת הווקטור הנמוכה ביותר ולאחר מכן אספו את הלהקה המקבילה לוקטור HDAd בultracentrifugation השני (איור 3) חלבי. וקטור HDAd המטוהרים היו פחות מ 1% מזיהום HV (איור 4 א) על ידי qPCR ולא היה זיהום עוזר גלוי בדרום סופג (איור 4 ב), המעיד על איכות מספיקה לעירוי וקטור לעכברים. ניתוח נוסף כלל ביטוי transgene על ידי זיהום של 116 תאים. ברמות ביטוי ה-mRNA של Ngn3 וBTC היו גבוהות יותר בתאים נגועים על ידי וקטור מעל 10,000 כפול בהשוואה לאלו בתאים נגועים שאינם (איור 5).

HDAd-Ngn3 ו- BTC שאחר כך הזריק לעכברים חולים סוכרת STZ מושרים באמצעות הזרקת וריד זנב עם וקטור ריק מוזרק ועכברי HDAd-BTC הזריקו סוכרתיים המשרתים כשליטה שלילית. היפרגליקמיה התהפכה והפרשת אינסולין גלוקוז מגורהשוחזר בעכברים שטופלו HDAd-Ngn3 והן HDAd-BTC אך לא בעכברים שטופלו עם וקטור גן יחיד או וקטור ריק שליטה (איור 6). הטיפול המושרה איון neogenesis HDAd-Ngn3-BTC וזה היה נבדק ועל ידי assaying אינסולין ו-c-פפטיד תוכן כולל (איור 6E) עם עכברים שאינם סוכרתיים, סוכרת ריקה וקטור טופלו משרתים כקבוצת ביקורת. הנוכחות של פפטיד C ואינסולין ביחסי equimolar מאשרת כי האינסולין להתגלות בכבד אכן נמצא מסונתז בכבד. RT-qPCR אשר כי הכבד של עכברים שטופל HDAd-Ngn3-BTC הביע כל הורמוני איון ספציפיים וגורמי שעתוק ^9. אימונוהיסטוכימיה הראתה תאי אינסולין חיוביים בכבד של עכברים שטופלו HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC, אך לא תאים לאינסולין חיוביים נצפו בעכברים שטופלו עם וקטור ביקורת (איור 7). אנחנו גם אשרנו כי לא היו איונים יורית בלבלב של treate Ngn3-BTCעכברי ד בהשוואה לאיים הרבים בלבלב שאינו סוכרתי. וקטור (Ngn3 וBTC) יחד עם גורם איון ספציפי שושלת שעתוק (PDX-1 וNkx6.1) ביטוי הוערך גם על ידי immunostaining של הכבד (איור 7).

איור 1. תרשים זרימה של ריפוי גנטי של עכברים סוכרתיים באמצעות מערכת וירוס עוזר תלויה. ראשית, Ngn3 וBTC, בקלטת מונעת על ידי אמרגן BOS בכל מקום, הם משובטים לתוך HDAd המעבורת (pΔ28) וקטורים. HDAd מיוצר על ידי מספר צעדים, כולל transfection, קטעים סידוריים של הגברה, וזיהום בקנה מידה גדול ואחריו טיהור וקטור. לאחר אפיון האיכות, HDAds מוזרק לוריד בעכברים סוכרתיים STZ מושרים דרך וריד זנב. את ההשפעות של טיפול מוערכות על ידי מדידת רמת סוכר, משקל גוף, ועל ידי GTT ניתוח של ביטוי גניםבכבד.

איור 2. הגברת וקטור HDAd נחישות. הדנ"א מופק ממעבר לP4 P0 באמצעות ערכות חילוץ DNA (Qiagen). DNA הוא דילול דנ"א 1000 מתקפל ו5μl משמש לזמן PCR אמיתי (qPCR). פריימרים Helper ווקטור ספציפי משמשים. עקומות סטנדרטיות מופקות על ידי דילולים סידוריים (10 ^-5 עד 1 ng / ml) של וקטור (פנלים העליונים) HDAd הסעות פלסמיד וHV פלסמיד. שימוש בעקומות הסטנדרטיות וערכי Ct למספר עותק וירוס הווקטור ועוזר מחושב ויחס HDAd / HV זמם כאחוז מסך הווירוס (עוזר + HDAd). לפיכך, הגברת וקטור יחסית מחושבת לפי: [מספר וקטור העתק / (מספר + עותק וירוס עוזר וקטור)]. בדוגמא שהוצגה (פנל תחתון) הגברת הווקטור HDAd plateaued בP4, בעוד HDAd היחסי / HV גובר בP3. לכן, P3 נבחר לשלב הבא.

איור 3. להקות וקטור HDAd יציגות לאחר ultracentrifugation הצפיפות CsCl הרציף. וקטור HDAd מטוהר מתרבות טווית 3L מעל שיפוע הצפיפות CsCl רציף. () לאחר ultracentrifugation שיפוע הצפיפות הראשונה, להקת וקטור המנצנץ אחת גלויה (חץ) מתחת פסולת תא אטומה (CD). הלהקה המנצנץ (חץ) נאספת לצנטריפוגה שיפוע הצפיפות השנייה. (ב) לאחר ultracentrifugation שיפוע הצפיפות השנייה, הלהקה המנצנץ (חץ) נאספת לדיאליזה.

איור 4. ניתוח של זיהום וירוס עוזר. הדנ"א מופק מנגיף מטוהר 50μl וזיהום עוזר הואssessed כמו באיור 2. האיור מציג זיהום עוזר של HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC הוא פחות מ 1%.

איור 5. כתם ניתוח המבנה של וקטור HDAd. דרום מתבצע כפי שתואר לעיל (אוקה K, et al.). 1 ליין: DNA מוירוס העוזר; ליין 2: ה-DNA מP3; 3 ליין: DNA מP4; הליין 4: המטוהרים vectopr. חיצים פתוחים מצביעים להקות נגזרות וירוס helper והחיצים המלאים מצביעים להקות ITR נגזרות מוקטור HDAd.

איור 6. רמת ביטוי של Ngn3 או BTC ב116 תאים נגועים בוקטור HDAd Ngn3 או HDAd-BTC. 116 תאים ב12 גם צלחות שהם נגועים בוקטור HDAd Ngn3 או HDAd-BTC או ריק ב1000 / תא סמנכ"ל למשך 2 ימים. CeLLS נקצר ורנ"א כלל מופק באמצעות ריאגנט Trizol. qRT-PCR מתבצע באמצעות Ngn3 או פריימרים BTC ספציפיים. Ngn3 היחסי או ביטוי mRNA BTC בלמעלה מ 10,000 פי בתאים נגועים בHDAd-Ngn3 או HDAd-BTC. הדמות נדפסה מDev.Cell 2009 מרץ; 16 (3): 358-73; Yechoor et. אל., באישור Elsevier.

איור 7. העברת גנים של HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC בעכברים סוכרתיים STZ מושרים מוביל להיפוך של סוכרת ואינדוקציה של האיון neogenesis בכבד. () גלוקוז פלזמה ו (ב) משקל גוף של עכברים סוכרתיים STZ מושרים טופלו HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC. (ג) גלוקוז ואינסולין בפלזמה-GTT IP בגיל 6 שבועות לאחר טיפול. (ד) נציג מכתים אינסולין בכבד 12 שבועות לאחר טיפול. * P <0.05 (לעומת קבוצת וקטור ריקה). הדמות נדפסה מפיתוח. Cell 2009 מרץ; 16 (3): 358-73; Yechoor ואח', באישור Elsevier..

שם	פריימר קדימה	להפוך פריימר
עוזר	GACCATCAATCTTGACGACC	ATGTCGCTTTCCAGAACCC
וקטור	TTGGGCGTAACCGAGTAAG	ACTTCCTACCCATAAGCTCC
Ngn3	AAGAGCGAGTTGGCACTCAG	TCTGAGTCAGTGCCCAGATG
BTC	GCACAGGTACCACCCCTAGA	TGAACACCACCATGACCACT

טבלת 1. רצפי פריימר.

Discussion

HDAds פותח כדי להתגבר על החולשה של המודעות של הדור הראשונה ולרתום ליישום ריפוי גנטי. עם זאת, אתגרים טכניים יישארו. לדוגמה, HDAd דורש HV לאריזה של HDAd והגברת וקטור הוא לא יעיל כמו מודעות של הדור הראשונה. HV הוא מודעת הדור ראשונה וכל זיהום של פשרת HV היעילות של HDAd. לכן, transfection היעיל ביותר ותנאים אופטימליים לכל קטע סידורי הם קריטיים. פרמטר קריטי נוסף לייצור וקטור הוא שמעבר (P1-P4) אמור לשמש למעבר 5 לאחר שמשמש באופן ישיר כבידוד לתאי השעיה. הניסיון שלנו, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות על ידי שימוש במעבר שבו שיעור הווקטור HDAd הוא גדל באופן דרמטי בקטע הבא (P3 באיור 2). התשואה של וקטורי HDAd תלויה בקלטות transgene. במהלך ייצור וקטור, שני transgenes לידי ביטוי מפני ששני הגנים נמצאים תחתאמרגן בכל מקום. Ngn3 הוא גורם שעתוק וBTC הוא גורם גדילה, אשר טוען כי גורם HDAd וקטור מבטא שעתוק אשר עשוי להשפיע על משפחה של תאים מעכבת הגברת וקטור בעוד שהורמון הגדילה מסייע בשכפול להביע וקטור ואריזה.

עם סוכרת בהנחה לממדים של מגיפה, גישות חדשות לשחזור המוני ב-תא יש צורך. בדו"ח זה, אנו מתארים שיטות כדי לרתום את היתרונות של וקטורי HDAd לחולל העברת גנים מאיון גורם שושלת-הגדרת שעתוק, Ngn3 יחד עם גורם גדילת האיון, betacellulin לגרום neogenesis איון באזורי periportal של הכבד. כדי להעריך את היעילות של זה, חשוב לבחור עכברים עם היפרגליקמיה יציבה ולהבטיח שבקרות מתאימות תמיד כלולות. על הניסויים של העברת הגן הזה, הווקטור הריק טופל עכברים סוכרתיים תמיד צריכים להיות מנוצלים. בנוסף, באמצעות HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC טופל בנפרד סוכרתי מיילce משמש כדי לבדוק את התרומה האישית של שני הגנים האלה באיון neogenesis. היות שהנתונים שלנו מראים שNgn3 בלבד מספיק כדי לגרום לאיון neogenesis, אבל התוספת של גורם הגדילה, BTC, משמשת כדי להגדיל את התגובה שמובילה לאינדוקציה חזקה של האיון neogenesis. כמו כן, חשוב לבדוק שביטוי וקטור מושגת אכן ברקמת המטרה, הכבד וגם להוכיח שהאינסולין המאושר בפלזמה של עכברים שטופלו לא בא מאיונים שיורית בלבלב, על ידי הוכחת העדר הלבלב איונים בעכברים הסוכרתיים.

לסיכום, היתרון של מערכת HDAd-הווקטור להעברת גנים טמון ביכולתה הגבוהה השיבוט, תמרה יעילה וביטוי גנים לאורך זמן בכבד ברעילות כרונית מינימום, כמו גם טבעה של אינטגרציה של הגנום שאינו וקטור למארח כרומוזום. המגבלות העיקריות הן הצעדים המורכבים כרוכים בדור ושלהביישום vivo מוגבל בעיקר בכבד בסרוטיפ המודעות הפופולריים ביותר 5. איילט neogenesis יכול להיגרם לשחזר אינסולין פלזמה וסבילות לגלוקוז בעכברים סוכרתיים באופן מלא על ידי גרימת neogenesis איון בכבד על ידי העברת גנים של גורם איון שושלת המגדיר שעתוק, Ngn3 יחד עם גורם גדילת האיון, betacellulin. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול האופטימלי כדי לייצר באיכות גבוהה HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC, ולהדגים טכניקות כדי לגרום ולהעריך neogenesis איון בכבדים של עכברים סוכרתיים להפוך היפרגליקמיה.

הערה: הווקטורים הנגיפיים ושורות התאים שתוארו כאן הם זמינים ממעבדת וקטור ייצור הליבה, סוכרת מרכז מחקר, ביילור לרפואה (http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731). כמה ערכות מסחריות זמינות גם ליצירת וירוסי HDAd (למשל Microbix biosystEMS Inc).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
ערכת Transfection יונקי ProFectionR	Promega	E1200
קיט דם ורקמות DNeasy (50)	Qiagen	69504
Perfecta SYBR הירוק SuperMix, rox	Quanta Biosciences	95055-500
deoxycholate נתרן	סיגמא	D6750-25G
MEM אבקה	Invitrogen	61100087
סטרפטומיצין פניצילין	סיגמא	15140122
FBS	אטלנטה ביולוגית	S11150
L-גלוטמין	Invitrogen	25030-081
Hygromycin B	סיגמא	H0654-1G
MEM EAGLE JOKLIK	סיגמא	M0518-10L
RNase	רוש	10109169001
DNase, כיתה השנייה	רוש	10104159001
Streptozocin	סיגמא	s0130
זכוכית טווה צלוחיות	קורנינג	4500-3L
זכוכית טווה צלוחיות	קורנינג	4500-250
הסט-lyzer casset	פירס CH	PI66380
צינור optiseal פולי allomer, 11.2 מ"ל	Beckman Coulter	362181
קילו צסיום כלוריד 1	JT4042-2	VWR
Beckman LE-80k	Beckman Coulter	ultracentrifuge האופטימלי LE-80k
לסנן	VWR	28143-338
חובצת 500 מ 'צינוראני	קורנינג	431123
tailveiner עוצר	בריינטרי המדעי, INC	tv-150
אינסולין, העכבר ELISA	Mercodia	10-1247-01
microvette CB300	Sarstedt	16.443.100
D-גלוקוז	סיגמא	G8270
עכבר C-פפטיד ELISA Kit	Wako טהור תעשיות כימיות בע"מ	# 631-07231
נוגדן רקן אנטי אינסולין	Abcam	ab7842
נוגדן עז נגד Pdx1	מתנת ד"ר כריסטופר רייט
עכבר אנטי Ngn3 נוגדן	מאגד ביולוגיה של תא בטא, אונ. פנסילבניה	AB2013
עכבר אנטי Nkx6.1 נוגדן	מאגד ביולוגיה של תא בטא, אונ. בפנסילבניהlvania	F64A6B4
נוגדן אנטי betacellulin	מדעי התא	PAAQ1
(SGPT) SET המגיב הצבע ALT.	אבחון Teco	A526 - 120
AST / (SGOT), סט מגיב Endpoint צבע	אבחון Teco	A561-120