Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

Summary

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Abstract

התהליך שבו האזור הקדמי של הצלחת העצבית מעורר רשתית החוליות ממשיך להיות מוקד עיקרי של מחקר קליני ובסיסי. בנוסף לרלוונטיות הרפואיות הברורות להבנה וטיפול במחל רשתית, הפיתוח של רשתית החוליות ממשיך לשמש כמערכת מודל חשובה ואלגנטית לנחישות הבנה עצבית תא סוג ובידול ^1-16. הרשתית העצבית מורכבת משישה סוגים בדידים תא (גנגליון, photoreceptors amacrine, אופקי, תאים דו קוטביים, ותאי גליה מולר) מסודרים בשכבות סטריאוטיפיות, דפוס הנשמר במידה רבה בין כל החוליות ^12,14-18.

בעוד לומד רשתית בעובר מתפתח בשלמות נדרשה באופן ברור להבנה כיצד האיבר המורכב הזה מתפתח מבליטה של ​​המוח הקדמי למבנה שכבתי, ישנן שאלות רבות שתועלנה לכאן ולכאןמ העסקת גישות באמצעות תרבית תאים ראשוניות של תאי רשתית משוערים ^7,19-23. לדוגמה, ניתוח תאים מרקמות שהוסרו וניתקו בשלבים שונים מאפשר לאדם להבחין במצב של מפרט של תאים בודדים בשלבי התפתחות שונים, כלומר, גורלם של התאים בהיעדר אינטראקציות עם רקמות שכנות ^{8,19-22 ,24-33.} תרבית תאים עיקרית גם מאפשרת לחוקר לטיפול בתרבות עם חומרים כימיים מסוימים ולנתח את התוצאות ברמת תא בודדה ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, מערכת מודל קלסית ללימוד התפתחות עצבית מוקדמת ^{19,27,29,31-32,40-42,} משמשת כמערכת מתאימה במיוחד לתרבות הראשונית של תאי רשתית ^10,38,43-45.

רקמת רשתית משוערת היא נגישה מהשלבים המוקדמים של פיתוח, מייד לאחר השראה עצבית ^25,38,43. בנוסף, ניתן הבכל תא בעובר מכיל אספקה ​​של חלמון, תאי רשתית יכולים להיות מתורבתים בטכניקה פשוטה מאוד שהוגדרה בהיקף של תמיסת מלח שנאגר, וכך להסיר את ההשפעות המבלבלות של דגירה או מוצרים אחרים המבוססים על סרום ^10,24,44-45 .

עם זאת, הבידוד של רקמת הרשתית מרקמות סובבות ועיבוד שלאחר מכן מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה לנתיחה והניתוק של תאי רשתית בXenopus laevis שישמשו להכנת תרביות תאים ראשוניות שיהיו, בתורו, להיות מנותחים לפעילות הסידן וביטוי גנים ברזולוציה של תאים בודדים. בעוד הנושא שהוצג במאמר זה הוא הניתוח של הארעיים סיד ספונטניים, הטכניקה היא רחב ישימה למגוון רחב של שאלות מחקר וגישות (איור 1).

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש במכללת ויליאם ומרי. שלבי התפתחות הפניה בפרוטוקול זה הם על פי Nieuwkoop ופייבר ^46.

1. בתור

1. אפשר בינוני תא תרבות והבינונית סידן מגנזיום חינם (CMF) כדי לאזן לטמפרטורת חדר. אתה גם צריך 0.1x של מארק שינוי הצלצול של (MMR) pH 7.4-7.6.
2. לעקר את הפריטים הבאים על ידי יישום אור UV למשך 30 דקות במכסת מנוע זרימה למינרית תרבות תא. (לרסס כל פריט עם אתנול 70% לפני ההכנסה למכסת המנוע.)
   • 35 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
   • 60 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
   • 35 מנות משטח Nunclon מ"מ.
   • 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל.
   • P1000 micropipette (1000 micropipette μl).
   • תרסיס P1000 טיפים עמידים (1000 טיפים עמידים תרסיסי micropipette μl).
   • אלכוהולעט עמיד.
   • ביתור פיין מלקחיים.
   • * 15 צינורות חרוטי מ"ל (רק לפעילות הסידן הדמיה).
   • * רק להדמיה של פעילות הסידן.
3. ברגע שמכסה המנוע כבר לעקר UV ופתרונות לי מתאזנים לטמפרטורת חדר, להפעיל את זרימת האוויר למינרית במכסת המנוע, לרסס את הכפפות ובקבוקי תקשורת עם אתנול 70% ומקום בקבוקי תקשורת במכסת המנוע.
4. בתוך מכסה המנוע להכין הבאה עם micropipette P1000 לכל צלחת של תאים, להבטיח תיוג מתאים.
   • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק המכילה 10 מ"ל בינוני סלולרי תרבות - פלייט Dissection.
   • צלחת אחת 35 מ"מ Nunclon משטח המכילה 2 מ"ל בינוני סלולרי תרבות - פלייט תרבות. (מנות פלסטיק Nunclon אינן מטופלים נוספים עם כל דבקים.)
   • 1.5 צינור Explant Tube אחד הריק המ"ל microcentrifuge דיסוציאציה.
   • * אחד 15 מיליליטר חרוטי בזמבחנה המכילה בינונית תא תרבות מ"ל 15. לשטיפה החוצה כאשר פעילות עודפת Fluo4-AM הדמית סידן.
5. בתוך מכסה המנוע, להכין את הדברים הבאים עם micropipette P1000 לכל מפגש דיסקציה (רשתית אחד או יותר יכולה להיות גזורה בפגישה אחת).
   • 35 מ"מ צלחת הפטר שמכילה אחד פלסטיק 2 המ"ל CMF - Explant שוטף את הצלחת.
   • 35 מ"מ צלחת הפטר שמכילה אחד פלסטיק 2 המ"ל CMF - פלייט דיסוציאציה Explant.
6. מחוץ למכסת המנוע להכין את הדברים הבאים:
   • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק לצלחת של תאים המכילים 10 המ"ל 0.1x MMR - מחזיק את הצלחת.
   • צלחת אחת 60 מ"מ פטרי פלסטיק לצלחת של תאים המכילים 10 מ"ל MMR 0.1x - פלייט אחים.
   • 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק אחד בכל הפעלת נתיחה המכילה 10 המ"ל 0.1x MMR + 0.5 מ"ג / מיליליטר MS-222 (tricaine) - צלחת הרדמה.
7. הוסף טריפסין 40 μl 5% בCMF לפלייט Explant דיסוציאציה (וכתוצאה מכך 0.1% פתרון טריפסין), המערבולת לערבב, ומניח בצד.
8. אם לנתח עובר שהוא יותר צעיר מן השלב 30, להוסיף 10 מ"ג collagenase B ל פלייט Dissection (וכתוצאה מכך פתרון 1 מ"ג / מיליליטר collagenase B), המערבולת לפזר ומניח בצד.
9. בחר עובר של השלב הרצוי, להעביר לצלחת אחזקות עם פיפטה העברה אינה סטרילי, ולהסיר את קרום vitelline (אם העובר עדיין לא בקעה) באמצעות מלקחיים עדינים.
10. להעביר כמה עוברים זהים מבוים לפלייט האחים עם פיפטה העברה הלא סטרילית.
11. אם העובר הוא השלב 25 או קודם לכן, להמשיך ישירות עם נתיחה, אחרת תעביר את העובר לצלחת ההרדמה עם פיפטה העברה אינה סטרילי ומאפשרים לעובר לשבת עד תנועה ותגובה לגירויים נפסקים. זה יכול לקחתעד דקה.
12. המשך בדיסקציה (איור 2) תחת ביתור (אובייקטיבי 4X, עינית 10X).

לעוברי שלב 25 או צעיר יותר:

13. חזרת עוברים לפלייט Dissection עם פיפטה העברה הלא סטרילית.
14. שימוש בשני זוגות של מלקחיים עדינים, לעשות חתך midsagittal בצד הגחון של העובר, מתחיל בקצה האחורי וממשיך עד לבלוטת המלט בחלק הקדמי של העובר.
15. בזהירות לפתוח את העובר על ידי אחיזה או הקצה לחתוך ומתפשט שמאלה וימינה. הדבר מביא לעובר עם הצד הגבה פונה אל פלייט Dissection, ועם אקטודרם הגחון פרוש לחשוף האנדודרם ומזודרם בפנים.
16. בגין הסרת האנדודרם ומזודרם (איור 2 א ו -2). השכבה הראשונה וגדולה ביותר של רקמה זו היא מאוד "רכה" בהופעה עםתאים גדולים וארגון ברור קטן.
17. לאחר הסרת שכבה זו, וsomites notochord יהיו גלוי. לניגוד טוב יותר, להעביר את העובר לצלחת נפרדת 60 מ"מ פטרי פלסטיק המכילה 10 מ"ל בינוני סלולרי תרבות ו100 μl של פתרון 1% מסולפט הנילוס הכחולה (במים) במשך 2-3 דקות לפני ההעברה בחזרה לפלייט Dissection. זה יהיה כתם אקטודרם, somites, וnotochord לזיהוי והתמצאות קלים יותר.
18. ההתמקדות בחלק הקדמי של העובר, להסיר בזהירות את notochord וכל שנותר מזודרם חושף את המוח ושלפוחית ​​אופטית (האיור 2C).
19. ברגע שהמוח והשלפוחית ​​אופטית חשופים לחלוטין, השתמש במלקחיים לנתק את הצינור העצבי ואקטודרם הבסיסי רק האחורי למוח.
20. הפעל את החלק הזה (המוח ושלפוחית ​​אופטית) על כך שאקטודרם הוא על העליונה.
21. נזהרים שלא לפגוע בשלפוחית ​​האופטית הבסיסית, בזהירות מחדשלהזיז את אקטודרם (האיור 2D).
22. לבסוף, באמצעות מלקחיים, להפריד את השלפוחית ​​האופטית מהמוח (איור 2D ו2E).

לעוברים מבוגרים יותר משלב 25:

23. בעוד העובר הוא בצלחת ההרדמה, להסיר את החלק הגחוני של העובר עם מלקחיים.
24. לניגוד טוב יותר, להעביר את העובר לצלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מימ המכילות 10 מ"ל ו 100 0.1x MMR μl של 1% סולפט הנילוס הכחול במשך 2-3 דקות לפני ההעברה לצלחת Dissection. זה יהיה כתם הכחול אקטודרם.
25. ברגע בצלחת Dissection, למשוך בחזרה אקטודרם גבי הרשתית (או שלפוחית ​​אופטית לבמת עוברי 26-30) (האיור 2F ו2G). אם סולפט הנילוס הכחולה היה בשימוש, אקטודרם יהיה מוכתם בכחול אבל רקמת הרשתית הבסיסית לא.
26. הסר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית בזהירות עם forceps (האיור 2H, ט 2, וי 2). זה מועיל כדי להחזיק את העובר במקום עם זוג אחד של מלקחיים ולהסיר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית עם השני.

2. התפרקות של רקמות ותאי ציפוי של

הערה חשובה - כאשר העברת רקמות, אל תאפשרו רשתית או שלפוחית ​​אופטית לגעת שום גבולות אוויר נוזליים, ואם זה קורה בתאי lyse.

1. ברגע שהשלפוחית ​​או הרשתית האופטית כבר גזורה, להעביר בזהירות לExplant שוטף את הצלחת עם P100 micropipette באמצעות טיפים עמידים תרסיסים ולאפשר לשבת במשך 30 שניות.
2. העברת 80 μl של טריפסין 0.1% בCMF מפלייט דיסוציאציה Explant לTube דיסוציאציה Explant.
3. שימוש micropipette P100 וטיפים עמידים תרסיס, להעביר את הרשתית או שלפוחית ​​אופטית מExplant שוטף את הצלחת לExplant Dissociatiברכבת תחתית, הימנעות מהעברת explants לשטוף פתרון.
4. אפשר לנתק את הרקמה ברכבת התחתית דיסוציאציה Explant לשעה 1 בטמפרטורת חדר. רשתית אחת שמשה לצלחת, עם זאת נציין, כי ניתן להשתמש בצלחת ליותר מאדם אחד שירצה בכך כדי להגדיל את מספר תאים לכל צלחת.
5. לצלחת התאים, תחילה להסיר לאט 40 μl של הפתרון מהרכבת התחתית דיסוציאציה Explant ולמחוק באמצעות micropipette P100 וטיפים עמידים בתרסיס. שימוש P100 סט עד 40 μl וטיפים עמידים תרסיס, להעביר את התאים (עכשיו שיש ניתקת הרקמה) לצלחת התרבות. כאשר aspirating התאים לצלחת, פיפטה לאט ולשמור על התאים בשטח קטן במרכז הצלחת.

הערה: אם תמונות מרובות של התאים הן שיש לנקוט בכל הניסוי, לצרף רשת (Cellattice) לחלק התחתון של צלחת התרבות חזק עם טיפה קטנה של דבק מגע. זה יאפשר תמונות של תאים זהים באורינטציות זהות שיש לנקוט בנקודות שונות בהליך.

6. אפשר התאים לשבת באין מפריעים במשך שעה לפחות 1 לדבוק צלחת Nunclon. לאחר פרק זמן זה, הם חייבים להיות מטופלים בעדינות, או שהם יכולים להיות מנותקים.
7. תאים מתרבים לשלב רצוי על ידי התבוננות בעוברי האחים, אשר גודלו באותה הטמפרטורה כמו תאים. אם תאי חיים שאינם בשימוש למניפולציה נוספת, הם יכולים להיות קבועים בפתרון MEMFA בשלב זה.

הערה חשובה: רוב הניסויים שלנו הם קבועים בתוך 6 שעות של ציפוי לתאים. אריכות הימים של התאים בתרבית תלויה בשלב שבו הרקמה הייתה גזורות וכמות החלמון עדיין קיימות בתאים, התאים הגזורים מצעיר (שלבי neurula) להישאר בריאים בתרבות עבור 5-6 ימים ואילו תאים שנרכשו עוברים מבוגרים (שחי ראשןשלבים) יישארו קיימא בתרבות במשך 2-3 ימים.

3. הדמית סיד ^47-49

פרוטוקול זה משתמש בסידן הרגישה מיקרוסקופיה Fluo4 AM-confocal ולכמת ארעיים הסידן בתאים בודדים. כל הצעדים באמצעות Fluo4-AM צריכים להתבצע הרחק מאור, כFluo4-AM הוא רגיש לאור. כל הכביסות שיש להוסיף או להסיר באמצעות micropipette P1000 וטיפי אירוסול עמידים. Pipetting צריך להיעשות לאט ובכיוון הקצה של הצלחת כדי לא להפריע לתאים. תקשורת לא השתנתה, כי התרבויות הנן קבועות בדרך כלל בתוך 6 שעות של ינותח. לתרבויות לטווח ארוך, התקשורת צריכה להיות שונה מדי יום.

1. Fluo4-AM מאוחסן ב -20 ° C, ואנו מציעים אחסון ב5 aliquots μl. לפני השימוש, להפשיר aliquot μl 5 של Fluo4 AM-הרחק מאור ולהוסיף 2 μl של Pluronic F-127 ישירות לaliquot זה.
2. לאחר culturing התאים לסכום הרצוי של זמן (לפחות1 שעות), הסר 1 מ"ל של מדיום תרבית התאים מצלחת התרבות. הוסף את זה לFluo4-AM וPluronic, ערבוב על ידי pipetting העדין.
3. לאט לאט להעביר את כל הפתרון הזה חזרה לקצה צלחת התרבות של התאים להיות צלם ולהשאיר את התאים בתמיסה באין מפריע במשך שעה 1 לספוג Fluo4-AM זה.
4. כדי לשטוף את עודפי Fluo4 AM-ממדיום תרבית התאים, להשלים את הסדרה לשטוף הבאה:
   • הסר 1 מ"ל של מדיה מהצלחת.
   • הוסף 3 מ"ל של תקשורת סלולרית תרבות הטריה (מצינור 15 מיליליטר החרוטים) לצלחת.
   • לבצע שתי שטיפות נוספות, בכל פעם שמוציאה לאט 3 מ"ל של תמיסה מהצלחת והוסיפה 3 מ"ל של תקשורת סלולרית תרבות הטריה.
5. התאים אמורים להיות עכשיו ב4 מ"ל של מדיום תרבות תא ומכילים Fluo4-AM. Fluo4-AM הוא בקע enzymatically פעם בתוך התא, ומונע ממנו לצאת מלשדר את התא או לכל תאים בממברנה כפותים.
6. לפני טעינת הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ confocal הדמיה, לצייר קו אדום אנכי עם סמן קבע על הצלחת, תוך שמירה על כיסוי על מנת למנוע את זיהום חלקיקי סמן התרבות. הקו האנכי נמשך למטה בצד של צלחת פטרי (הבסיס של צלחת פטרי, ולא את המכסה). מטרתו היא מצביעה על הכיוון של צלחת התרבות ביחס לשדה ראייה, כך שההתמצאות והתיאום המדויקת של התאים הבודדים יכולות להיות הוקמו מחדש בשלב מאוחר יותר.
7. הצלחת עכשיו הוא מוכן להעמסה על הבמה של מיקרוסקופ confocal להדמיה. דמיינו את התאים באמצעות הגדרות שדה הבהירות בסריקת ליזר מיקרוסקופ confocal (אובייקטיבי 20X). מצא את שטח של תאים צפופים שלא מכיל גושים, רצוי עם שדה הראייה שמכיל את מספרי הרשת הגדולות על coverslip Cellatice לעשות למצוא את אותו שדה ראייה קלה מאוחר יותר כאשר הדמית התרבות לאחר בsiהכלאת טו. לפני ההדמיה, להתמקד במורד דרך התרבות ולקחת תמונת שדה בהירה של הרשת מתחת לתאים כדי להקליט את המיקום והכיוון של תרבות התאים. זה מאפשר להתכנסות של התאים לניתוח שלאחר מכן.
8. הרם את מישור המוקד וללכוד תמונה בהירה תחום התאים לפני הדמית סידן מתחיל (איור 3 א).
9. ברגע שמטוס המרכז של התאים הוא בפוקוס, הצלחת מוכנה להדמיה של פעילות הסידן. הגדרות תשתנינה בהתאם למיקרוסקופ ויישום. אנחנו תמונת התאים באמצעות ליזר ננומטר ארגון 488 ל1, 2, או 12 שעות עם הפרמטרים הבאים:
   • 1 תמונות hr:
     • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב4% מכוח mW 30 המרבי שלו.
     • סרוקות פעם אחת כל 4 שניות (900 סריקות לשעה).
   • 2 תמונות hr:
     • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב4% מכוח mW 30 המרבי שלו.
     • סרוק פעם אחת בכל8 שניות (450 סריקות לשעה).
   • 12 תמונות hr:
     • ליזר ננומטר ארגון 488 סריקות ב2% מכוח mW 30 המרבי שלו.
     • סרוקות פעם אחת בכל 48 שניות (75 סריקות לשעה).

פרמטרים אלה יגרמו לקבוצה של סטילס 900 תמונות מסגרת עבור כל מסגרת זמן. פעילות סיד אז ניתן להקליט באמצעות ניתוח רמות קרינה מעל את התמונות כמובן הזמן (איור 3 ב ') עם השימוש ביישום עיבוד תמונה כגון ImageJ ^50.

4. תיקון תאים

1. בעקבות הדמיה, תאים יכולים להיות קבועים למשך 30 דקות על ידי הסרת 3 מ"ל של תמיסה מהצלחת והוספת 1 המ"ל 2X MEMFA למ"ל נותר 1 מתוך תקשורת התרבות.
2. לאחר קיבוע, להסיר MEMFA ומייבש תאים עם סדרה של 5 כביסות דקות, כל אחד בנפח של 1 מ"ל:
   • 25% אתנול בתמיסת מלח 1X פוספט שנאגר-(PBS).
   • 50% אתנול ב1X PBS.
   • 75% אתנול בSDD H ₂ O (מים מזוקקים deionized סטרילית).
   • החלף את השטיפה האחרונה עם המ"ל 1 100% אתנול וצלחת חנות ב -20 ° C.

הערה: מתנול יכול לשמש גם לשטיפות אלו ולאחסון.

5. פלורסנט כלאה באתר (FISH)

תרבויות ניתן assayed באמצעות פרוטוקול הסטנדרטי לדגי Xenopus כמתואר ⁵¹ עם תיקונים לתרבית תאים כפי שמתואר על ידי אנדרסון מעבדת ^52. שינויים שבוצעו במעבדת אנדרסון הפרוטוקול מפורטים להלן. כל הכביסות מתבצעות על 35 צלחות Nunclon מ"מ בנפחים של כ 1 מ"ל, אלא אם צוינה אחר. פתרונות כמוגדרים בסייב et al. ⁵³ אלא אם צוין אחר.

הערה חשובה: אין להשתמש בfluorescein שכותרתו RNA בעת ביצוע בדיקות כלאה באתר על תאים לצפו ביפעילות הסידן. נוגדני Anti-fluorescein יהיו לאגד שיורי Fluo4 AM-בתאים ועלולים לגרום לאיתות חיובית בכל התאים בתרבית.

יום 1: Permeabilization והכלאה

1. כביסות החזרת נוזלים צריכות להיות מדורגות להתייבשות הממס המשמש לאחסון. על הניסויים שלנו, מתרחץ קבלו ציונים לאתנול ב1X PBS.
2. בעקבות התייבשות, לשטוף את התאים שלוש פעמים נוספות ב1X PBS למשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת חדר.
3. ערבב 25 מ"ל של 0.1 מ 'triethanolamine (pH 8.0) עם 62.5 μl של אנהידריד אצטית בצינור פלקון ומערבב במהירות עד שהתפזר ביסודיות כפי שפורט בפרוטוקול ⁵² מעבדת אנדרסון. דגירת תרבויות בתערובת זו למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בעקבות טיפול אנהידריד אצטית, לשטוף תאים בציטרט הנתרן המלוח 1X (SSC) למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. הסר את שטיפת SSC האחרונה ולהחליף עם 0.2 M HCl (בSDD H ₂ O) למשך 10 דקות לpermeabilize תאים.
5. לשטוף את HCl עם שתי כביסות ב1X PBS למשך 5 דקות.
6. Prehybridize בחיץ איש ב 60 ° C באמבט מים רועד למינימום של 6 שעות, אבל לא prehybridize הלילה כמו זה קשה מפחית אות.
7. להכליא בין הלילה ב 60 המעלות צלזיוס למשך 8-14 שעות ב750 μl של חללית מדוללת (1:250 דילול מחללית מטוהרת). מטוהר טווחי ריכוז בדיקה 1.0-1.5 מיקרוגרם / μl.

יום 2: הסרת Probe הפזור ודגירת נוגדן

8. הסר את החללית ולשטוף תרבויות למשך 5 דקות ב0.2X SSC ב 60 ° C. שטוף בטרי 0.2X SSC לשעה 1 ב 60 ° C.
9. הסר תרבויות מאמבט המים ולאפשר להם להסתגל לטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
10. שטוף ב0.2X SSC בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
11. שטוף במשך 15 דקות ב1X PBS עם 0.1% Triton-X-100 (PBT).
12. כדי להשבית peroxidases אנדוגניים, לשטוף לשעה 1 _ב2% 2 פתרון H ₂ O בPBT.
13. לשטוף עם שטיפת 15 דקות ב1X טריס נאגרה מלוחה עם 0.1% Tween 20 (TBST).
14. לחסום במגיבים חסימה של 2% במאגר חומצת Maleic (MAB) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר. אנחנו גילינו ששיטת חסימה זו מגבירה את הרגישות בהשוואה לשיטות הקודמות של חסימה ב20% כבשים בסרום PBT.
15. דגירת תרבויות ב1 מ"ל של מגיב 2% חסימה בMAB מכיל 1:1,000 דילול של נוגדן POD מצומדות לילה ב 4 ° C.

יום 3: הסרת הנוגדן פזור ופיתוח פלואורסצנטי

16. הסר פתרון נוגדן ולשטוף 3 פעמים בTBST למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
17. לשטוף 4 פעמים בTBST למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר ואילו ברציפות מתנדנד במהירות איטית.
18. לשטוף פעמים בPBT בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
19. החל 750 μl של 1:200 Cy3 tyramide tyramide-fluorescein או 1:25 בדילול PBT. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולהוסיף 2.5 μl 0.3% H ₂ O _2. רוק עבור 40 דקות כדי לאפשר לאות לפיתוח.
20. שטוף לפחות 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד בTBST בטמפרטורת חדר עם נדנדה.
21. ברגע שהאות התפתחה באופן מלא, למשך 5 דקות לשטוף ב1X PBT.
22. תקן ב1X MEMFA לשעה 1 בטמפרטורת חדר וחנות ב1X PBS ב 4 ° C.

6. תוצאות דגים לתמונה ובשיתוף עם הרשמת נתוני הדמית סיד

1. עם השלמת דגים, צלחות תרביות תאים הם צלמו כדי לקבוע אילו תאים להציג אות פלואורסצנציה חיובית לבדיקה נתונה. השתמש coverslip Cellattice למצוא את התחום המדויק של נוף למד במהלך הדמית הסיד וליישר את הצלחת לכיוון של מסגרות התמונה הסידן.
2. תתמקד למישור המרכז של התאים ולקחת תמונה ברזולוציה גבוהה יחידה באמצעות ליזר ננומטר הליום ניאון HeNe 543 ב 15% מכוחה המרבי 1 mW (האיור 3C).
3. במסגרת המקורית 900 סט של תמונות שצולמו מפרוטוקול הדמית סידן,לזהות תאים בודדים כמו אזורים של עניין (Rois) באמצעות השימוש בתוכנת עיבוד תמונה (כגון ImageJ ^50). לחלץ את נתוני קרינת החזר על השקעה כערכה של נקודתי נתונים המייצגים ערכי זוג הזמן פלואורסצנטי (איור 4).
4. כיסוי תמונת תוצאות הדגים עם Rois זיהה מתמונות הסיד (האיור 3D).
5. הרשמה לכל החזר על השקעה חיובית לבדיקה, שלילי לבדיקה, או לא ידוע - במקרה שהתא המתאים להחזר על ההשקעה כבר לא ניתן למצוא בתוך שדה הראייה של תמונת הדגים.
6. נתוני קרינת ROI תהליך באמצעות תסריטי ניתוח סטטיסטיים (כפי שתוכנן באמצעות MATLAB או שפת תכנות אחרת) כדי להשוות בין רמות פעילות סיד שלבים שונים גזורים (האיור 5A ו5C) או תאים חיוביים לבדיקות דגים שונות (5B האיור ו5D). כל הסקריפטים משמשים במעבדה שלנו זמינים באופן חופשי על פי דרישה.

תוצאות

דוגמאות לשלפוחית ​​נתחה בהצלחה אופטית (שלב 25) ורשתיות עיניים (שלב 35) מוצגות באיורי 2E וי 2. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשלבים שונים של פיתוח, זה הוא קריטי להשגת רקמת רשתית רק כדי להבטיח דיוק לניסויים נוספים. מוציא בזהירות את האפידרמיס בכל השלבים ולהבטיח כי...

Discussion

עם סוגי תאים המאופיינים היטב הנשמרים לאורך כל החוליות, הרשתית מספקת מודל שימושי לחקר התהליכים מולקולריים התאיים המסדירים מפרט ובידול סוג תא. תרבית תאים ראשונית מקנה שיטה רבה עצמה לחקר מגוון רחב של תהליכים, כולל ביטוי גנים, דינמיקת חלבון וסידן ופעילות חשמלית ברמת רזו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
			לניתוחים וculturing
מנות BD פלקון קלות גריפ רקמות תרבות, 35 מ"מ	דיג	08-772A
כלים חד פוליסטירן פטרי, 60 15 מ"מ x	דיג	0875713A
35 מנות מ"מ Nunclon Surface פטרי (עם Airvent)	דיג	12-565-91
דומון פיין מלקחיים (Dumostar # 55)	דיג	NC9341917
Cellattice מייקר קבע coverslip פלסטיק, 25 מ"מ	דיג	50-313-17
אתיל-מ-Aminobenzoate Methanesulfonate המלח (MS-222)	חבר הפרלמנט Biomedicals, LLC	103106
סולפט גנטמיצין	אנזו מדעי חיים	380-003-G025
Gibco טריפסין (1:250) אבקה	חי טכנולוגיות	27250-018
Collagenase B מClostridium histolyticum	רוש	11088831001
פניצילין סטרפטומיצין	Gibco	15140-122
סולפט בלו נייל (אופציונלי)	Pfaltz & באואר	N05550
מערכת סינון אבק 500 מ"ל / אחסון בקבוקים, 0.22 מיקרומטר ממברנה הנקבובית 33.2 סנטימטר 2 CN	קורנינג	430758
			לדימות סידן
Fluo-04:00 פתרון 1 מ"מ DMSO, תא קבוע	חי טכנולוגיות	F-14217
ה-F-127 10% פתרון Pluronic במים	חי טכנולוגיות	P-6866
מערכת מיקרוסקופ LSM 510 Confocal	Zeiss	דגם הופסק
חסימת מגיב	רוש	11096176001
			לפלורסנט כלאה באתר (FISH)
אנטי Digoxigenin-POD, שברי Fab	רוש	11207733910
נוגדן אנטי DNP-HRP	פרקין אלמר-	NEL747A
Cy3NHS אסטר	GE Healthcare	PA13101
NHS-fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, deionized	Amresco	0606-950ML
Torula רנ"א, הסוג IX	סיגמה אולדריץ	R3629
מלח נתרן הפארין, מרירית מעי חזירית	סיגמה אולדריץ	H3393-250KU
בחורים	סיגמה אולדריץ	C3023
			טבלת 2. ריאגנטים וציוד ספציפיים.
			פתרון עיון תוכן בינוני תא תרבות צ'אנג ושפיצר, 2009 54 116 המ"מ NaCl 0.67 mM KCl 2 המ"מ CaCl 2 1.31 mM MgSO 4 4.6 mM טריס % 1 (v: v) פניצילין / סטרפטומיצין התאם pH ל 7.8 עם HCl. סנן לעקר על ידי עובר דרך מסנן CN מיקרומטר 0.22. לאחסן ב 4 ° C. סידן מגנזיום בינוני חינם (CMF) הגו et al, 1994 42;. גו ושפיצר, 1995 55 116 המ"מ NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM טריס 0.4 המ"מ EDTA % 1 (v: v) פניצילין / סטרפטומיצין התאם pH ל 7.8 עם HCl. סנן לעקר על ידי עובר דרך מסנן CN מיקרומטר 0.22. לאחסן ב 4 ° C. מאגר החומצה Maleic (MAB) Sive et al., 2000 53 100 חומצת maleic mM 150 המ"מ NaCl (pH 7.5). אצבעותיו של מארק השינוי (MMR), 10X Sive et al., 2000 53 100 המ"מימ NaCl mM KCl 1 המ"מ MgSO 4 2 המ"מ CaCl 2 5 מ"מ HEPES חומציות מותאמת ל7.4 עם NaOH 0.1x MMR מכיל גם 50 מ"ג / המ"ל גנטמיצין סולפט והחומציות מותאם ל 7.4 עם NaOH. פתרון MEMFA, 10X Sive et al., 2000 53 0.1 מגבי M (pH 7.4) 2 המ"מ EGTA 1 המ"מ MgSO 4 3.7% פורמלדהיד פתרון 10X, ללא פורמלדהיד, ניתן לאחסן ב 4 ° C. פורמלדהיד הוסיף טרי (1/10 נפח של 37% מניות רגילות). במאגר ההכלאה באתר סיבדואר et al., 2000 53 50% פוראמיד SSC 5X 1 מ"ג / המ"ל Torula רנ"א 100 מ"ג / המ"ל הפרין הפתרון של 1X Denhart 0.1% Tween 20 בחורי 0.1% 10 mM EDTA. פתרונות. * גנטמיצין, אנטיביוטיקה, משמש בפתרונים שלנו, תוך MMR פניצילין וסטרפטומיצין משמשים בתקשורת התרבות שלנו.