의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

요약

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

초록

신경 판의 앞쪽 영역이 척추 망막에 상승을 제공하는 과정은 임상과 기초 모두 연구의 주요 초점이되고 있습니다. 망막 질환을 이해하고 치료에 대한 명백한 의료 관련뿐만 아니라, 척추 망막의 개발을 이해 neuronal 세포 유형 결정과 차별화 ^1-16에 대한 중요하고 우아한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 신경 망막은 틀에 박힌 층에 배치 여섯 개별 세포 유형 (신경절, 수평, amacrine photoreceptors, 양극성 세포와 뮐러 glial 세포), 대체로 모든 vertebrates ^12,14-18 사이에 보존되어있는 패턴으로 구성됩니다.

그대로 개발 배아에서 망막을 공부하는 것은 분명이 복잡한 기관은 계층 구조로 forebrain의 돌출부에서 어떻게 전개되는지 이해가 필요합니다 동안 이리저리 혜택을 많은 질문이 있습니다m 추정 망막 세포의 주요 세포 배양 ^7,19-23을 사용하여 방식을 채용. 예를 들어, 서로 다른 단계에서 제거 dissociated 조직의 세포를 분석하는 것은 하나는 다른 발달 단계에서 개별 셀의 사양의 상태를 분별 할 수있다 즉, 주변 조직 ^{8,19-22와의} 상호 작용의 부재에있는 세포의 운명 ^,24-33. 기본 세포 배양은 또한 탐정 특정 시약과 문화를 처리하고 단일 세포 수준 ^{5,8,21,24,27-30,33-39에} 결과를 분석 할 수 있습니다. Xenopus laevis의 연구 고전 모델 시스템은 초기 신경 발달 ^{19,27,29,31-32,40-42은} 망막 기본 세포 배양 ^{10,38,43-45에} 특히 적합한 시스템으로 제공하고 있습니다.

추정 망막 조직은 즉시 신경 유도 ^25,38,43 따라 개발 초기 단계에서 액세스 할 수 있습니다. 또한, 일을 부여태아의 각 셀 노른자의 공급을 포함에서 망막 세포가 버퍼 소금 솔루션으로 구성된 매우 간단한 정의 미디어에서 배양 할 수 있습니다, 따라서 부화 또는 기타 커 기반 제품 ^{10,24,44-45의} 혼란 효과를 제거 .

그러나, 주변 조직 및 후속 처리에서 망막 조직의 격리 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 결과적으로, 단일 세포의 해상도 칼슘 활동 및 유전자 표현 분석됩니다 기본 셀 문화를 준비하는 데 사용됩니다 Xenopus laevis의 망막 세포의 분해 및 분리하기위한 방법을 제시한다. 본 논문에서 제시 한 주제 자발적인 칼슘 과도의 분석이지만, 기술은 연구 질문 및 접근 방법 (그림 1)의 다양한 배열 광범위하게 적용됩니다.

프로토콜

모든 실험은 윌리엄과 메리의 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행됩니다. 이 프로토콜에서 참조 발달 단계 Nieuwkoop와 페이버 ^46에 따라 수 있습니다.

1. 해부

1. 세포 배양 매체와 실내 온도로 평형하는 칼슘 마그네슘 무료 매체 (CMF)를 허용합니다. 당신은 또한 0.1X 마크의 수정 된 벨소리의 (MMR) 산도를 7.4-7.6이 필요합니다.
2. 세포 배양 층류 후드에서 30 분 동안 UV 빛을 적용하여 다음 항목을 살균. (후드에 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 각 항목을 스프레이.)
   • 35mm 플라스틱 배양 접시.
   • 60mm 플라스틱 배양 접시.
   • 35mm Nunclon 표면 요리.
   • 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브.
   • P1000 micropipette (1,000 μl의 micropipette).
   • 에어로졸 방지 P1000 팁 (1,000 μl micropipette의 에어로졸 방지 도움말 참조).
   • 알코올방지 펜.
   • 포셉을 해부하고 좋아요.
   • * 15 ML 원뿔 튜브 (단 이미징 칼슘 활동).
   • * 만 칼슘 활동의 이미징을위한.
3. 후드는 UV 소독 및 솔루션은 실내 온도에 equilibrated이되면, 동네에서 70 %의 에탄올과 장소 미디어 병 장갑과 미디어 병 다운 스프레이, 후드에 판상 공기 흐름을 설정합니다.
4. 후드 내부 적절한 라벨을 보장 셀의 각 플레이트에 대해 P1000 micropipette으로 다음을 준비합니다.
   • 분해 플레이트 - 한 60mm 플라스틱 페트리 접시는 10 ML 셀 문화 매체를 포함.
   • 문화 판 - 한 35mm Nunclon 표면 요리는 2 ML 셀 문화 매체를 포함. (Nunclon 플라스틱 요리가 추가 된 접착제로 치료되지 않습니다.)
   • 하나의 빈 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 Explant 분리 관.
   • * 한 15 ML 원뿔 매튜브 15 ML 셀 문화 매체를 포함. 초과 Fluo4-AM 이미징 칼슘 활동 때를 세척하십시오.
5. 후드 내부, 각 분해 세션 P1000 micropipette (하나 이상의 망막이 한 세션에서 해부 할 수 있습니다)와 다음을 준비합니다.
   • 2 ML CMF를 포함하는 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시 - Explant이 판을 씻어.
   • Explant 분리 판 - 2 ML CMF를 포함하는 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시.
6. 후드 이외의 다음을 준비 :
   • 10 ML 0.1X MMR을 포함하는 셀의 접시 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시 - 플레이트를 개최.
   • 10 ML 0.1X의 MMR을 포함하는 셀의 접시 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시 - 형제 자매 플레이트.
   • Anesthetization 판 - 10 ML 0.1X MMR + 0.5 MG / ML MS-222 (tricaine)를 포함하는 분해 세션 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시.
7. Explant 해리 플레이트 (0.1 % 트립신 솔루션의 결과로)을 혼합 할 소용돌이에 CMF 40 μl 5 % 트립신을 추가하고 옆으로 설정합니다.
8. 단계 30 세입니다 배아를 해부하면, 분해 플레이트 (1 MG / ML Collagenase B 솔루션의 결과로), 용해와 옆 설정 소용돌이에 10 밀리그램 Collagenase B를 추가합니다.
9. 원하는 단계의 배아를 선택 비 멸균 전송 피펫으로 개최 플레이트에 전송, 고급 집게를 사용하여 vitelline 막을 (배아가 아직 부화하지 않은 경우)를 제거하십시오.
10. 전송 여러가 동일하게 비 멸균 전송 피펫으로 형제 자매 판으로 배아를 개최.
11. 배아 무대 25 이전 인 경우 비 무균 전송 피펫으로 Anesthetization 플레이트에 배아를 전송하고 움직임과 자극에 반응 중단 될 때까지 배아가 앉아 할 수 있도록, 그렇지 않으면 절개와 직접 진행합니다. 이 걸릴 수 있습니다최대 분합니다.
12. 박리 범위 (4X 목적, 10X 접안 렌즈)에서 절개 (그림 2)로 진행합니다.

배아 단계 25 세 이하 :

13. 비 살균 전송 피펫으로 분해 플레이트에 배아를 전송합니다.
14. 고급 집게 두 쌍을 사용하여 뒤쪽 끝에 시작하고 배의 앞 부분에 시멘트 선을 통해 지속적으로, 배의 복부 측면에 midsagittal 몫을합니다.
15. 컷 중 하나 가장자리를 물체를 움켜 왼쪽과 오른쪽 확산에 의해 배아를주의 깊게을 엽니 다. 분해 플레이트에 직면하고있는 등쪽면과 배아에서, 그리고 복부 외배엽있는이 결과는 내 endoderm과 중배엽을 나타 내기 위해 열려 확산.
16. endoderm 및 중배엽 (그림 2A와 2B)을 제거 시작합니다. 이 조직의 첫 번째이자 최대 규모의 층은 다음과 같은 모양이 매우 "보송 보송"입니다대형 세포와 거의 분명 조직입니다.
17. 이 항목을 제거한 후 somites 및 notochord이 표시 될 것입니다. 더 나은 대비를 들어, 10 ML 셀 문화 매체 및 분해 플레이트로 다시 전송하기 전에 2-3 분에 대한 나일 블루 황산의 1 % 솔루션 100 μl를 (물)를 포함하는 별도의 60mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 이동합니다. 이 쉽게 식별 및 방향 설정을 위하여 외배엽, somites 및 notochord을 얼룩 것입니다.
18. 배의 앞 부분에 초점을 조심스럽게 notochord과 뇌와 광 소포 (그림 2C)를 노출 남은 중배엽를 제거합니다.
19. 뇌 및 광 소포가 완전히 노출되면 뇌에 단 뒤 신경 튜브 및 기본 외배엽을 잘라야 포셉을 사용합니다.
20. 외배엽이 위쪽에 있도록 통해이 부분을 (뇌와 광 소포) 설정합니다.
21. 조심스럽게 기본 광 소포을 손상하지 않도록 조심을 다시 촬영(그림 2D) 외배엽 이동합니다.
22. 마지막으로, 집게를 사용하여, 뇌 (그림 2D 및 2E)에서 광 소포를 구분합니다.

: 단계 25보다 배아는 세 이상

23. 배아는 Anesthetization 플레이트에 있지만, 집게로 태아의 복부 부분을 제거합니다.
24. 더 나은 대비를 들어, 10 ML 0.1X MMR과 분해 플레이트로 전송하기 전에 2-3 분 1 % 나일 블루 황산 100 μl를 포함하는 60mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 이동합니다. 이 외배엽의 파란색 얼룩 것입니다.
25. 일단 분해 플레이트에서, 망막 (또는 배아 단계 26-30를위한 광 소포) (그림 2 층과 2G)를 놓인 외배엽을 뒤로 빼는거야. 나일 블루 황산이 사용 된 경우, 외배엽은 파란색 얼룩이 있지만 기본 망막 조직 안됩니다.
26. 구경을 조심스럽게 망막 또는 광 소포를 제거rceps (그림 2H, 2I, 그리고 2J). 그것은 포셉 한 쌍의와 장소에 배아를 개최하고 망막 또는 다른과 광 소포를 제거하는 도움이 될 것입니다.

2. 조직 및 셀 도금의 분리

중요 참고 - 조직을 전송하면, 망막이나 시신경 소포는 공기 - 액체 경계를 터치하는 것을 허용하지 않습니다, 이러한 경우가 발생하면 세포가 lyse합니다.

1. 광 소포 또는 망막이 해부되면, 조심스럽게 에어로졸 방지 방법을 사용하여 p100 micropipette으로 판을 씻어 30 초에 앉아서 할 수 Explant로 전송할 수 있습니다.
2. Explant 분리 튜브에 Explant 해리 판에서 CMF의 0.1 % 트립신의 80 μl를 전송합니다.
3. p100 micropipette 및 에어로졸 방지 팁을 사용하여 Explant에서 망막 또는 광 소포를 전송하면 Explant Dissociati에 플레이트를 씻어튜브에 explants의 전송을 피하는 것은 솔루션을 씻어.
4. 조직은 실온에서 1 시간 동안 Explant 분리 튜브에 해리 할 수 있습니다. 한 망막이 판 당 사용되었다, 그러나 우리는 그렇게 판 당 세포의 수를 늘리기 위해 원하는 경우 하나 이상의 당 플레이트를 사용하는 것이 가능하다는 것을 유의하십시오.
5. 판 세포를하려면 먼저 천천히 Explant 분리 관에서 솔루션 40 μl를 제거하고 p100의 micropipette 및 에어로졸 방지 방법을 사용하여 폐기하십시오. p100 세트 40 μl 및 에어로졸 방지 팁을 사용하여 문화 플레이트에 세포를 (현재 조직이 dissociated 가지고) 전송할 수 있습니다. 접시에 세포를 aspirating 때, 천천히 피펫과 접시의 중앙에있는 작은 영역에 세포를 유지.

참고 : 셀의 여러 이미지가 실험을하는 동안 촬영 할 경우, 문화 판의 아래쪽에 그리드 (Cellattice)를 첨부 을 선택합니다. 이 동일한 방향에서 동일 셀의 이미지가 프로 시저에서 다른 지점에서 촬영 할 수 있습니다.

6. 세포가 Nunclon 판을 준수하는 데 적어도 1 시간에 방해받지 앉아 할 수 있습니다. 이 시간 이후, 그들은 매우 부드럽게 처리해야합니다거나 분리 될 수 있습니다.
7. 세포와 같은 온도에서 키운하는 형제 배아를 관찰하여 원하는 단계에 문화 셀. 라이브 세포가 더 조작을 위해 사용하지 않는 경우이 시간에 MEMFA 솔루션에 고정 할 수 있습니다.

중요 참고 : 실험을의 대부분은 세포를 도금 6 시간 내에 해결됩니다. 문화의 세포의 수명은 조직을 해부 한의 단계와 세포에 남아있는 난황의 양에 따라 달라집니다, 세포에서 얻은 반면 젊은 (neurula 단계)에서 해부하는 세포는 5~6일에 문화 건강 유지 이전 배아 (올챙이 수영) 단계 2-3 일 동안은 문화에 가능한 상태로 유지됩니다.

3. 칼슘 이미징 ^47-49

이 프로토콜은 칼슘에 맞는 개별 셀에 칼슘 과도을 수량화 할 수 Fluo4-AM 및 공 촛점 현미경을 활용합니다. Fluo4-AM을 사용하는 모든 단계 Fluo4-AM 민감한 빛으로 빛으로부터 멀리 수행해야합니다. 모든 세차는 추가 또는 P1000 micropipette 및 에어로졸 방지 방법을 사용하여 제거해야합니다. Pipetting는 천천히 세포 방해가되지 않도록하기 판의 가장자리를 향해 수행해야합니다. 문화는 일반적으로 해부하고 6 시간 내에 고정되어 있기 때문에 미디어는 변경되지 않습니다. 장기적인 문화를 들어, 미디어는 매일 변경해야합니다.

1. Fluo4-AM는 -20 ° C에 저장되어있다, 우리는 5 μl aliquots에 저장하는 것이 좋습니다. 사용하기 전에, 거리에 빛의 Fluo4는-AM의 5 μl 나누어지는을 해동하여 직접 나누어지는에 Pluronic F-127의 2 μl를 추가합니다.
2. 시간의 원하는 금액을 배양 후 세포 (적어도1 시간), 문화 판에서 세포 배양 매체 1 ML를 제거합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합, Fluo4-AM과 Pluronic이를 추가합니다.
3. 천천히 이미징 될 수있는 세포의 문화 판의 가장자리에 다시이 솔루션의 모든 전송 및 Fluo4-AM을 흡수하는 1 시간에 방해받지이 솔루션에서 셀을 둡니다.
4. 씻어 세포 배양 매체에서 Fluo4-AM 초과, 다음 세탁 시리즈를 완료 :
   • 접시에서 미디어 1 ML을 제거합니다.
   • 판에 새로운 세포 배양 매체 3 ML을 (15 ML 원뿔 튜브에서) 추가합니다.
   • 두 개의 세차 때마다 천천히 접시에서 솔루션의 3 ML을 제거하고 신선한 세포 배양 매체의 3 ML을 추가를 수행합니다.
5. 전지는 현재 세포 배양 매체 4 ML에 있어야하고 Fluo4-AM을 포함해야합니다. Fluo4-AM은 효소 세포의 diffusing 아웃이나 막 바인딩 된 구획에 방지, 세포 내부에 한 번 흘리고있다.
6. 문화를 오염 아이콘 입자를 방지하기에 커버를 유지하면서 이미지의 공 촛점 현미경의 무대에 접시를로드하기 전에 음식에 영구 마커와 수직 빨간색 선을 그립니다. 수직 라인은 페트리 접시 (페트리 접시가 아니라 뚜껑의베이스)의 측면을 그려집니다. 의 목적은 개별 셀의 정확한 방향과 정렬이 나중에 지점에서 다시 설정 될 수 있도록 시야와 관련하여 문화 판의 방향을 나타냅니다.
7. 판은 이제 이미지에 대한 공 촛점 현미경의 무대에로드 할 준비가되었습니다. 공 촛점 현미경 (목적 20X)를 스캔 레이저에 밝은 필드 설​​정을 사용하여 셀을 표시합니다. 나중에 쉽게보기의 동일한 필드를 찾는 할 수있는 Cellatice의 coverslip에있는 큰 격자 번호가 포함 된보기의 필드로 바람직하게는, clumps을 포함하지 않습니다 조밀 한 셀의 영역을 발견하면시에서 후 영상 문화를부엉의 하이브리드. 영상에 앞서, 문화를 통해 다운 집중하고 세포 배양의 위치와 방향을 기록 할 수있는 세포 아래의 격자의 시야 이미지를. 이 이후의 분석을위한 세포의 재배치 할 수 있습니다.
8. 초점 평면을 높이고, 시작 칼슘 이미징 (그림 3A) 이전 셀의 시야 이미지를 캡처합니다.
9. 세포의 중심 비행기 초점이되면 판은 칼슘의 활동 영상을위한 준비가되었습니다. 설정 현미경과 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 우리는 이미지가 다음 매개 변수 1, 2, 또는 12 시간을위한 아르곤 488 nm의 레이저를 사용하여 세포를 :
   • 1 시간 이미지 :
     • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 4 %를 검색합니다.
     • 매 4 초 (시간 당 900 검사)는 한 번 스캔합니다.
   • 2 시간 이미지 :
     • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 4 %를 검색합니다.
     • 매번 스캔8 초 (시간 당 450 스캔).
   • 12 시간 이미지 :
     • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 2 %에 검색합니다.
     • 모든 48 초 (시간 당 75 스캔)은 한 번 검색합니다.

이 매개 변수는 각 시간 프레임에 대한 900 여전히 프레임 이미지의 집합을 야기 할 것이다. 칼슘 활동은 그런 다음 ImageJ ⁵⁰ 이미지 처리 응용 프로그램의 사용과 시간 코스 이미지 (그림 3B)를 통해 형광 수준을 분석하여 기록 할 수 있습니다.

4. 셀을 고정

1. 이미징 후, 세포는 접시에서 솔루션의 3 ML를 제거하고 문화 미디어의 남은 1 ML에 1 ML 배 MEMFA을 추가하여 30 분에 고정 할 수 있습니다.
2. 고정 후, MEMFA을 제거하고 5 분 세차 각 1 ML의 볼륨 일련의 세포를 탈수 :
   • 1X 인산염 버퍼 생리 (PBS)에 25 % 에탄올.
   • 1X PBS의 50 % 에탄올.
   2 O (무균 deionized 증류수)의 리> 75 % 에탄올.
   • -20 ° C. 1 ML 100 % 에탄올과 매장 판으로 마지막 빨래를 교체

참고 : 메탄올도 이러한 세차와 스토리지 사용하실 수 있습니다.

5. 현장 하이브리드 화에 형광등 (물고기)

앤더슨 연구소 ^52에서 설명한 것처럼 세포 배양에 대한 수정 ⁵¹ 설명 문화는 Xenopus의 표준 물고기 프로토콜을 사용하여 assayed 할 수 있습니다. 앤더슨 연구소 프로토콜에 대한 수정은 아래에 나열되어 있습니다. 별도로 명시하지 않는 한 모든 세차는 약 1 ML의 권 35 밀리미터 Nunclon 판에 실시하고 있습니다. 솔루션 (으)로 Sive 외에 정의되어 있습니다. ⁵³ 달리 명시되지 않는 한.

중요 참고 : 용 이미징 셀에 원위치 하이브리드 화에 수행 할 때 fluorescein-라벨 RNA 프로브를 사용하지 마십시오칼슘 활동. 안티 fluorescein 항체는 잔류 셀에 Fluo4-AM과 문화의 모든 셀에 긍정적 인 신호를 발생할 수 있습니다에 바인딩됩니다.

1 일 : Permeabilization 및 하이브리드

1. Rehydration 세차는 저장에 사용되는 탈수 용매로 등급해야합니다. 우리의 실험 세차는 1X PBS에서 에탄올로 등급이되었습니다.
2. rehydration 후, 실온에서 5 분마다 1X PBS에 세포 세 추가 번 씻는다.
3. 팔콘 튜브에 아세트산 무수물의 62.5 μl와 0.1 M triethanolamine (산도 8.0)의 25 ML을 섞어서 철저 앤더슨 연구소 ⁵² 프로토콜에 같은 논의 분산 될 때까지 빠르게 섞는다. 실온에서 10 분에이 혼합물 문화를 품다. 아세트산 무수물 치료 후, 실온에서 5 분을 위해 1X 생리 나트륨 구연산 (SSC)에서 세포를 씻어.
4. 마지막 SSC 세척을 제거하고 세포를 permeabilize하기 위해 10 분에 0.2 M HCL (sdd H ₂ O)을로 교체.
5. 5 분에 1X PBS에 두 세차와 HCL을 씻으십시오.
6. 60 ° 6 시간의 최소 흔들어 물 욕조에서 C에서 다우 버퍼에 Prehybridize하지만이 심각하게 신호를 해짐에 따라 하루 아침에 prehybridize하지 않습니다.
7. 희석 프로브의 750 μl (정화 프로브로부터 1:250 희석)에 8-14 시간에 대한 ° C 60 박 잡종을 만들다. 1.0-1.5에서 프로브 농도 범위를 정화 μg / μl.

일 2 : 언 바운드 프로브 및 항체 배양의 제거

8. 프로브를 제거하고 60 0.2X SSC에 5 분을 위해 문화를 세정 ° C. 60 ° C.에 1 시간에 신선한 0.2X SSC에 씻어
9. 물 목욕에서 문화를 제거하고 5 분 동안 실온에 적응 할 수 있습니다.
10. 5 분 동안 실온에서 0.2X SSC에 씻어.
11. 0.1 % 트리톤 - X-100 (PBT)와 1X PBS에서 15 분 동안 씻는다.
12. 내생 peroxidases을 비활성화하려면, PBT의 2 % H ₂ O ₂ 용액에서 1 시간에 씻는다.
13. 을 1X 트리스에서 15 분 세척과 린스 0.1 % 십대 초반 20 (TBST)와 식염 버퍼링.
14. 상온에서 1 시간을위한 Maleic 산 버퍼 (적인 mAb)의 2% 차단 시약에 차단합니다. 우리는이 차단 방법은 PBT 20 % 양 혈청에서 차단의 이전 방법에 비해 감도를 증가하는 것으로 확인되었습니다.
15. 4 ° C.에서 하룻밤 POD-복합 항체의 1:1,000 희석을 포함적인 mAb의 2퍼센트 차단 시약의 1 ML에 문화를 품다

3 일 : 언 바운드 항체의 제거 및 형광 개발

16. 항체 솔루션을 제거하고 실온에서 5 분에 TBST 3 번 씻어.
17. 지속적으로 속도가 느린 속도로 흔들면서 실온에서 15 분에 TBST에 4 번 씻으십시오.
18. 10 분 동안 실온에서 PBT에 두 번 씻으십시오.
19. PBT에 희석 1:200 fluorescein-tyramide 또는 1시 25분 Cy3 tyramide의 750 μl을 적용합니다. 상온에서 5 분 동안 배양 및 2.5 μl 0.3 % H _2를 추가 O _2. 신호가 개발 할 수 있도록 40 분에 즐겨요.
20. 락과 상온에서 TBST에서 15 분마다 최소 4 번 씻으십시오.
21. 신호가 완전히 개발되면, 1X PBT에서 5 분 동안 씻어.
22. 4 ° C.에서 1 상온에서 시간과 1X PBS의 저장소에 1X MEMFA에 수정

6. 이미지 생선 결과 및과 공동 등록 칼슘 이미징 데이터

1. 생선이 완료되면, 세포 배양 플레이트는 어떤 세포가 특정 프로브에 대한 긍정적 인 형광 신호를 표시 결정하는 이미징 있습니다. 칼슘 이미징 동안 공부 뷰의 정확한 필드를 찾아 칼슘 이미지 프레임의 방향에 판을 정렬 Cellattice의 coverslip을 사용합니다.
2. 세포의 중심 비행기에 집중하고 최대 1 MW 전력 (그림 3C)의 15 %에 헬륨 - 네온 HeNe 543 nm의 레이저를 사용하여 하나의 고해상도 이미지를보세요.
3. 칼슘 이미징 프로토콜에서 가져온 이미지를 설정 원본 900 프레임에서,이미지 처리 프로그램 (예 : ImageJ ^50)의 사용을 통해 관심 지역으로 개별 셀 (ROIs)를 식별합니다. 시간 형광 쌍의 값 (그림 4)를 나타내는 데이터 요소의 집합으로 투자 수익 (ROI) 형광 데이터를 추출합니다.
4. 칼슘 이미지 (그림 3D)에서 확인 ROIs과 물고기 결과 이미지를 입혀 라.
5. 프로브에 대한 부정적 프로브에 대한 긍정적, 또는 알 수없는 각 투자 수익 (ROI)을 등록 - 투자 수익 (ROI)에 해당하는 셀이 더 이상 물고기 이미지의 시야에서 찾을 수 수있는 경우 인치
6. 다른 해부하는 단계 (그림 5A 및 5C) 또는 다른 생선 프로브 (그림 5B와 5D)에 대한 긍정적 인 세포들 사이에서 칼슘의 활동 수준을 비교하는 통계 분석 스크립트를합니다 (MATLAB 또는 다른 프로그래밍 언어로 설계)를 사용하여 프로세스 ROI 형광 데이터입니다. 우리가 실험실에서 사용 된 모든 스크립트는 요청시 자유롭게 사용할 수 있습니다.

결과

성공적으로 해부하는 광 소포 (단계 25)와 retinae (무대 35)의 예는 2E와 2J 그림에 표시됩니다. 이 프로토콜이 개발의 여러 단계에서 사용할 수 있지만, 더 실험에 대한 정확성을 보장하기 위해 만 망막 조직을 얻는 것이 중요합니다. 조심스럽게 모든 단계에서 표피를 제거하고 포셉의 망막 조직을 주사하지 않도록. 단계 35 세 이상에서, 렌즈는 망막 위에 맑은 층으로 간주 할 수 있으며, ?...

토론

모든 vertebrates에서 보존 아르는 잘 특징 세포 유형으로, 망막은 셀 타입 사양과 차별화에 관한 분자 - 세포 프로세스를 공부에 유용한 모델을 제공합니다. 기본 세포 배양은 유전자 발현, 단백질 역학, 그리고 칼슘 및 단일 셀 해상도 수준의 전기 활동을 포함한 과정의 광범위한 조사를위한 강력한 방법을 갖게. 여기에 우리가 추정 망막 개발하고 기본 세포 배양의 매우 초기 단계에서 쉽게 액세스 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
			Dissections 및 배양을위한
BD 팔콘 쉬운 그립 조직 문화 요리, 35mm	어부	08-772A
일회용 폴리스티렌 페트리 요리, 60 X 15mm	어부	0875713A
35mm Nunclon 표면 배양 접시 (Airvent 포함)	어부	12-565-91
뒤몽 좋은 집게 (Dumostar # 55)	어부	NC9341917
Cellattice 마이크로 지배 플라스틱 coverslip, 25mm	어부	50-313-17
에틸 m-Aminobenzoate Methanesulfonate 소금 (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin 황산	엔조 생명 과학	380-003 - G025
Gibco 트립신 (1:250) 파우더	생명 기술	27250-018
클로스 트리 디움 histolyticum에서 Collagenase B	로슈	11088831001
페니실린 - 스트렙토 마이신	Gibco	15140-122
나일 블루 황산 (선택 사항)	Pfaltz & 바우어	N05550
500 ML 진공 필터 / 저장 병 시스템, 0.22 μm 기공 33.2 cm 두 CN 막	코닝	430758
			칼슘 이미징을위한
Fluo-4는 DMSO의 1 ㎜ 솔루션, 영구 세포 AM	생명 기술	F-14217
물에 Pluronic F-127 10 % 솔루션	생명 기술	P-6866
LSM 510 공 촛점 현미경 시스템	Zeiss	모델 중단
시약 차단	로슈	11096176001
			현장 하이브리드 화에 형광등 (물고기)의 경우
안티 Digoxigenin-POD, 팹 조각	로슈	11207733910
안티 - DNP-HRP 항체	Perkin-엘머	NEL747A
Cy3NHS 에스테르	GE 헬스 케어	PA13101
NHS-Fluorescein	열 과학	46,409
포름 아미드, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA 타입 IX	시그마 - 알드리치	R3629
돼지 창자 점막에서 헤파린 나트륨 소금,	시그마 - 알드리치	H3393-250KU
고맙네	시그마 - 알드리치	C3023
			표 2. 특정 시약 및 장비.
			용액 참고 내용 세포 배양 매체 장과 스피처 2009 년 54 116 MM NaCl 0.67 MM KCl 이 MM CaCl 2 1.31 MM MgSO 4 4.6 MM 트리스 1퍼센트 (V : V) 페니실린 / 스트렙토 마이신 HCL와 7.8 산도를 조정합니다. 0.22 μm의 CN 필터를 통과하여 소독을 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C.에 저장 칼슘 마그네슘 무료 매체 (CMF) 번지 외 1994 년 42,. 번지와 스피처, 1995 55 116 MM NaCl 0.67 MM KCl 4.6 MM 트리스 0.4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1퍼센트 (V : V) 페니실린 / 스트렙토 마이신 HCL와 7.8 산도를 조정합니다. 0.22 μm의 CN 필터를 통과하여 소독을 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C.에 저장 Maleic 산 버퍼 (적인 mAb) Sive 외., 2000 53 100 MM maleic 산성 150 MM NaCl (산도 7.5). 10X 마크의 수정일 Ringers (MMR), Sive 외., 2000 53 100 MM NaCl MM KCl 1 ㎜ MgSO 4 이 MM CaCl 2 5 MM HEPES pH는 NaOH와 7.4로 조정 0.1X MMR은 50 MG / ML gentamicin 황산과 산도가 NaOH와 7.4로 조정이 포함되어 있습니다. MEMFA 솔루션, 10X Sive 외., 2000 53 0.1 M를 처리 (PH 7.4) 이 MM EGTA 1 ㎜ MgSO 4 3.7 %의 포름 알데히드 10X 솔루션은, 포름 알데히드없이, 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 포름 알데히드는 (표준 37% 주식의 10분의 1 볼륨) 신선한 추가됩니다. 현장 하이브리드 화 버퍼에서 Siv전자 외., 2000 53 50 % 포름 아미드 5 배 SSC 1 MG / ML Torula RNA 100 MG / ML 헤파린 1X Denhart의 솔루션 0.1 % 십대 초반 20 0.1 % 챕스 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 페니실린과 스트렙토 마이신은 우리의 문화 미디어에 사용되는 동안 솔루션. * Gentamicin, 항생제는 우리 MMR 솔루션에서 사용됩니다.