תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Summary

Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. "משכית תמונת הלבנה-" מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות ו פוסט הוק Immunostainings.

Abstract

תמונה רציפה הלבנה-מספק דרך לא פולשנית לתייג SCS הבודד בNMJ. NMJ הוא סינפסה הגדולה ביותר של מערכת העצבים של היונקים וכהן כמנחה מודל ללמוד מבנה ותפקוד הסינפטי. במסופי האקסון מוטורי NMJs עכבר להקים אתרי מגע הבייגלה עם סיבי שריר. מנוע האקסון ומסופו הם המכוסים בSCS. במהלך העשורים האחרונים, מספר עכברים הטרנסגניים כבר נוצר כדי לחזות הנוירונים מוטוריים וSCS, לדוגמא ¹ Thy1-XFP ו PLP-GFP עכברים ^2, בהתאמה.

לאורך האקסונים מוטוריים, SCS axonal myelinating מסודר בהלא חופף internodes, מופרד על ידי צומת של Ranvier, כדי לאפשר התקדמות פוטנציאל פעולה קופצנית. בניגוד לכך, SCS טרמינל הסינפסה הם תאי גליה מיוחדים, אשר לפקח ולקדם עצביים, לעכל האקסונים מדריך מתחדש ופסולת. NMJs מכוסה היטב על ידי עד חצי תריסר הלא myelinating SCS מסוף - אלה, עם זאת, לא ניתן לפתור באופן אישי על ידי מיקרוסקופ אור, כפי שהם נמצאים בקשר ישיר קרום ^3.

כמה גישות קיימות בנפרד לדמיין SCS מסוף. אף אחד מאלה הם ללא רבב, אם כי. לדוגמה, מילוי צבע, שם תאים בודדים הם משופדים עם microelectrode צבע מלא, דורש להרוס את תאים שכותרתו לפני מילוי שנייה אחת. זה אינו תואם עם הקלטות זמן לשגות באות ^3. תיוג בעל רפאים "Brainbow" של SCS הושג באמצעות ביטוי קומבינטורית של חלבוני ניאון ^4. עם זאת, טכניקה זו דורשת שילוב של מספר transgenes ומוגבל על ידי דפוס הביטוי של היזמים בשימוש. בעתיד, ביטוי של חלבונים "צילום" בהחלפת SCS יכול להיות עוד ⁵ חלופיים. כאן אנו מציגים צילום הלבנה רציף, שבו תאים בודדים המולבנים, ותמונתם מתקבלת על ידי חיסור. אנו מאמיניםכי גישה זו - בשל הקלות והרבגוניות שלו - מייצגת תוספת קיימא לפלטת הטכנולוגיה של הנוירולוג, במיוחד כפי שהוא יכול להיות בשימוש בגוף חי והועבר לתאים מסוגים אחרים, אתרים או מינים ⁶ אנטומיים.

בפרוטוקול הבא, אנחנו פירוט היישום של מיקרוסקופיה confocal הלבנה רציפה ולאחר הזמן לשגות לSCS מסוף בexplants השרירים sterni triangularis. הכנה זו דקה, שטחית ונתחה בקלות עצבי שרירי ^7,8 הוכיחה שימושית ללימודים של NMJ פיתוח, פיזיולוגיה והפתולוגיה ^9. לבסוף, תסבירו כיצד שרירי sterni triangularis מוכנים לאחר הקיבוע לבצע קורלציה רזולוציה גבוהה confocal הדמיה, או בדיקות אימונוהיסטוכימיה ultrastructural.

Protocol

1. Triangularis Sterni Explant (איור 1)

תזמון: 15 דקות.

1. הכן את מכשירי ניתוח: 2 זוגות של מלקחיים, 1 זוג מספריים, 1 זוג מספרי האביב, צלחת תרבית רקמה 1 (10 סנטימטרים). מראש מבעבעים-(מינימום 15 דקות) מקורר (4 ° C) הפתרון של רינגר עם 5% CO _2/95% O _2. מלא צלחת תרבית רקמה 15-סנטימטר עם קרח ולכסות אותו עם לוחית מתכת. הכן מיקרוסקופ נתיחה ולמקם את צלחת 15-הסנטימטר עם קרח מתחת להיקף הנתיחה כדי לקרר את explant במהלך נתיחה.
2. קטלני להרדים את העכבר על ידי מנת יתר isoflurane (או כל שיטה אחרת שאושרה לקורבן). רסס את העכבר עם אתנול 70% על מנת למנוע זיהום פרווה של explant. להלבנת SC, השתמש עכברי PLP-GFP, אשר ניתן לחצה Thy1-OFP3 או Thy1-Membow13 להדמיה סימולטני של האקסון.
3. שימוש בזוג מספרי גדול, לעשות חתך קו אמצע שלהעור מעל עצם החזה ושני חתכים מקבילים לקצה התחתון של כלוב הצלעות.
4. השימוש בזוג מספרי גדול, להסיר את העור, לפתוח את דופן הבטן, ולבצע חתכים מקבילים לצלעות את כל הדרך חזרה לעמוד השדרה. ואז לנתח את שרירי החזה על ידי ביצוע חתכים קרובים יותר להחדרה בשרירי עצם החזה.
5. חותך את הסרעפת הפתוחה ממש מתחת לסחוס xiphoid ולנתח את הסרעפת יחד הוספות costal.
6. מחזיק את כלוב צלעות על ידי תהליך xiphoid עם סט של מלקחיים, להתחיל לחתוך את הצלעות את עמוד השדרה, קרוב ככל האפשר להוספות שלהם. קיצוצי השמאל וימין צריכים להתכנס מעל הלב כלפי manubrium sterni. נסה להימנע מחיתוך כלי דם גדולים (במיוחד את ורידי subclavian). ראות טובה יותר מושגת על ידי הרמת הכנת עדינות תוך אחיזה בתהליך xiphoid עם מלקחיים.
7. לעשות חתך רוחבי מתחת manubrium sterniולהעביר explant לתוך צלחת 10-הסנטימטר עם פתרון ₂ בועות-CO של רינגר המקורר 5% _2/95% O. מניח את צלחת 10-הסנטימטר על לוחית המתכת המכסה את צלחת תרבית רקמת 15-הסנטימטר מלא בקרח. צריכים לעשות את כל צעדים נוספים תחת המיקרוסקופ לנתיחה.
8. בעזרת מספרי האביב קטנים להסיר שאריות של בלוטה התימוס, הצדר, סרעפת (בפנים) ושרירי חזה (חיצוניים; איור 1B-D).
9. כדי להתאים את המנה לexplant 3.5-הסנטימטר, לנתח את כל הצלעות שלא להכניס לעצם החזה. הדרך טובה ביותר לעשות שימוש במספרי האביב קטנים וחיתוך רקמות שבבין צלעות (האיור 1E).
10. הצמד explant sterni triangularis עצבי השריר לתוך צלחת Sylgard המצופית 3.5-סנטימטר רקמת התרבות באמצעות סיכות minutien (קצר ל< 4 מ"מ; האיור 1G). שתי סיכות צריכות לעבור את חלקי סחוס (לבן) של עצם החזה. הכנס לפחות שתי סיכות דרך הצלעות הן בצד השמאל וימין של הexplant הדואר מכוון לחלקי הסחוס הרכים והימנעות מהצלעות מתחת או קרוב לשריר triangularis. ככל שיותר סיכות משמשות, טוב יותר (בדרך כלל משתמשים באנו 8-10). כפי שאתם להצמיד הכנה, לוודא שהצלעות מפוזרות במקצת, תקן את השריר למצב מתוח במקצת.
11. אופציונלי: דמיינו אתרים המכילים קולטניים אצטילכולין סינפטיים ידי הוספת bungarotoxin מצמיד את צבעי Alexa (ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל בפתרון _2-בועות של רינגר 5% CO _2/95% O). דגירת explant הצמיד בצלחת מצופית Sylgard לדקות 15-20 בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים עם פתרון _2-בועות של רינגר 5% CO _2/95% O.

2. SCS הלבנה ומיקרוסקופיה זמן לשגות אופציונלית (איור 2)

תזמון: 30 - 45 דקות + 1 אופציונלית - 5 שעות לזמן פקיעה.

1. העברת מנת Sylgard המצופית של 3.5 סנטימטר לשנינות מצוידת confocal מיקרוסקופh ארגון ליזר (488 ננומטר אורך גל) ויעדי טבילה במים (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA ו100x, 1.0 NA או 60x, 0.9 נ"א).
2. אופציונלי למיקרוסקופיה זמן לשגות: הוספה Sylgard מצופית 3.5 סנטימטר צלחת לטבעת חימום, להתקין את מערכת superfusion ובדיקת טמפרטורה (איור 2 א). ודא שאף אחד מהם לגעת explant, השפה של המנה או ציפוי Sylgard. מחמם את המדגם כדי 33-35 מעלות צלזיוס להלבנת SC ללא זמן לשגות, בטמפרטורת החדר היא טובה יותר, כמו תאים להראות פחות דינמיקה בין צעדי הלבנה.
3. במטרה לבחון אוויר 4x דפוס עצבוב של שרירי sterni triangularis ולמצוא להקת endplate sterni triangularis. לעבור ל20x אובייקטיבי חרוט הטבילה ולהתחיל לחפש אזורים שטחיים בתוך להקת endplate (צלעות שמעליה אזורים הם מועמדים טובים). שינוי אובייקטיבי למטרה או 100x 60x חרוט הטבילה לבדוק NMJs הבודד. אידיאלי הוא NMJ כי הוא מכוסה על ידי מספר SCS והוא ממוקם מאוד superficially (איור 2 ב '). אם תבצע הדמית זמן לשגות אחרי הלבנה, בחר עד 3 NMJs שקרובים יחסית יחד כדי להגדיל את התשואה.
4. לרכוש תמונת confocal של NMJ לפני צילום הלבנת SCS הבודד (איור 2 ב '). (להדמיה ברזולוציה מלאה, למשל בFV1000 מיקרוסקופ אולימפוס, להשתמש, אובייקטיבי 100x 1.0 ו -2.5 NA זום, שתוצאת דגימת נייקוויסט המוגבלת של ~ 0.1 מיקרומטר לפיקסל).
5. "פרק" 488 קרן ליזר ננומטר מרכזי בגרעין של SC משתמש בכוח מקסימאלי למשך 5 שניות (לחלופין דפוס יעיל סריקה באזור קטן של עניין ניתן להשתמש, כגון פונקציה "טורנדו הסריקה" במיקרוסקופ אולימפוס; כפי שאנו משתמשים confocal מיקרוסקופ, הליזר הוא מרוכז למטוסי תמונת הצמד ומכאן, ב488 ננומטר עם מטרה של 1.0 NA, <0.5 מיקרומטר קוטר). מחדש להתמקד בתא ושופט הלבנת תוצאה. אם יש צורך לחזור על הלבנת צעד שוב עד רמות GFP הם להפחיתד לרמות רקע קרוב. לרכוש תמונה אחרי הלבנה (האיור 2C). זה קריטי כדי לוודא שהאזור המולבן הוא מחוץ לכל חפיפה בין שני תאים - אם יש חפיפה, הלבנה בתא שני תהיה ברורה.
6. חזור על שלב מעל עד שכל אבל אחד SC הם מולבנים (איור 2D-E). האחרון "המולבן" SC מתאים למיקרוסקופיה confocal זמן לשגות. לשחזר תאים בודדים על ידי חיסור של תמונות, לדוגמא שימוש בתוכנת פוטושופ, כדי להתוות מורפולוגיה SC אחת ושטח (האיור 2F). להיות מודע לכך שהפחתת 2 המגים מוסיפה רעש (למשל על ידי יבואם ב" שכבות "רצופות בפוטושופ ולאחר מכן הגדרת הערוץ מלמעלה" הבדל "בתפריט הנפתח בחלק העליון של כרטיסיית ערוצים). זה יכול היה לעקוף באמצעות פונקציה "despeckle" בערוצים לפני החיסור וחיתוך משם כל רקע שאינו ברור מקורןתא מולבן. כדי לייעל, לעומת זאת, זה יכול להיות נחוץ כדי להתאים את הבהירות של שני הערוצים בחלון "הרמות". התמונה המתקבלת של התא המולבן היא על גבי התמונה המקורית של סינפסה, פסאודו הצבועה בגוון ייחודי ושקוף לצבוע את השטח של התא המולבן בתמונה המקורית (מלעשות את זה עבור כל מולבן והאחרון , תאים מולבנים תמונה שמוצגת בתוצאות תרשים 2F).
7. אופציונלי: מיקרוסקופיה confocal התחל זמן לשגות אחרי הלבנה כל אבל אחד SCS. קח תמונה במרווחי זמן קבועים (למשל כל 5 עד 10 דקות). השתמש בכוח הליזר קטן ככל האפשר. עד 3 NMJs ניתן הדמיה באותה הישיבה.
8. לעשות מפה של NMJs הנושן על ידי לקיחת תמונה ב100x ללא זום, אז תמונות של האזור באמצעות 20x ויעדי 4x (איור 2G-I). "המפה" זו נחוצה כדי למצוא NMJs הבא אימונוהיסטוכימיה של שריר קבוע.
9. לתמונהעיבוד, להמיר תמונות בודדות לתחזיות בעצמה מרבית ולשמור בפורמט TIFF. מערבב את כל זמן נקודתי Z-מוקרנים לתוך ערימה וליישר בxy, למשל באמצעות התוסף "stackreg" ¹⁰ בפיג'י (חבילה המבוססת על תוכנת הקוד הפתוח ImageJ; המכונים הלאומיים לבריאות).

3. קיבעון ואימונוהיסטוכימיה (איור 3)

תזמון: לינה.

1. העברת explant לתוך צינור תגובה 50-מ"ל מכיל לפחות 15 מ"ל 4% PFA על ידי הסרת הסיכות בזהירות. לאחר תיקון קיר בית החזה קדמי המכיל את שרירי sterni triangularis לשעה 1 בקרח. יש לשטוף את רקמה קבועה עם 0.1 M גליצין ב PBS (כדי להרוות מקבע השיורי ולכן להפחית רקע) במשך לפחות 10 דקות. דוגמאות ניתן לאחסן בנקודה זו ועיבוד מאוחר יותר.
2. העברת explant קבוע לצלחת 10-סנטימטר Sylgard מצופית רקמת תרבות מלאה עם 0.01 M PBS. גזור את צורת טרפז עם סי 1דה במקביל לעצם החזה והשני דרך מעברי עצם לסחוס - זה מכיל את שריר triangularis על פני השטח שלו. הסרת צלעות תחתונות עם (כלומר טרנס חזה) לחתוך אופקי כך שקצה הזנב של שריר triangularis ניתן לגשת באופן חופשי (איור 3A-D).
3. הכנס מזרק כמו סיכה בחלק העליון של הטרפז (איור 3E). השתמש במזרק המצורף למזרק 1 מ"ל ומלקחיים כדי להסיר את שריר triangularis על פני השטח על ידי החזקתה בעדינות אל פינת זנב של השריר ושימוש במחט כמייקרו אזמל. ודא כי קיצוצים נעשים במקביל למישור של קיר בית החזה. ברגע שחלק הזנב של השרירים משתחרר, הכנס זריקת הרגעה נוספת כמו סיכה מתחת לשריר דרך קיר בית החזה - זה משתק את ההכנה ומאפשר הפעלת משיכה עדינה על השריר באמצעות מלקחיים (איור 3F). כפי שאתה חותך tiss חיבורהוספות UE, "לקלף" את השרירים מבית החזה. חותך מצורף זנב אחרון במספרי האביב. הסר שאריות שומן וכלי דם באמצעות מלקחיים. היזהר שלא לקרוע את העצבים. הערה: השתמש במערכות נפרדות של כלים וצלחות לעבודה עם רקמה חייה וקבועה.
4. התחל אימונוהיסטוכימיה (באמצעות פרוטוקול סטנדרטי) על ידי העברת דגימות רקמה לפתרון חסימה לשעה 1 בייקר בטמפרטורת חדר. נפח הקטן ביותר האפשרי להכתמה הוא 200 μl באמצעות צלחת 96 היטב.
5. החל נוגדן ראשוני המדוללים בפתרון חסימה, 200 μl לטוב, לילה ב 4 ° C במטרף.
6. שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות.
7. החל נוגדן משני מתאים ל1-2 שעות בטמפרטורת חדר דילול בחסימת פתרון.
8. שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות.
9. הר במדיום נגד דהייה (למשל Vectashield) וcoverslip.
10. שקופית מניח על צלחת מתכת מגנטית, מגנט מקום על גבימהמדגם לשטח לכמה שעות או למשך לילה ב 4 ° C. לאטום בלכה לציפורניים.

תוצאות

דוגמה לexplant sterni triangularis המוכן לצלחת הדמיה מוצגת באיור 1G. explant זה מתאים במיוחד עבור vivo ההדמיה NMJs לשעבר כשרירי triangularis מורכבים מכמה שכבות של סיבי שריר בלבד. זה מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה מexplants נגזר מקווי עכבר מהונדסים שגולת הכותרת או SCS (PLP-GFP ...

Discussion

SC שיטת ההלבנה מוצגת כאן היא פשוט, מהירה ותכליתית: (i) הוא מאפשר לחשוף מורפולוגיה SC אחת ודינמיקה ידי מיקרוסקופיה confocal מבוססת על transgene בודד - אשר מהווה יתרון משמעותי בעת שילוב לדוגמא הגישה למודלים למחלות הדורשים אללים נוספים . (Ii) היא השיטה מהירה, כמנתיחה לקיבעון זה נ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה (דוגמה)	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
70% (כרך / כרך) פתרון אתנול	רוט	T913.1	בבקבוק תרסיס
isoflurane	Forene, אבוט		כל מאושרת הרדמה אחרת יכולה לשמש להרדמה קטלנית
עכברים הטרנסגניים (PLP-GFP)			שיופק ממקורות שצוטטו
מיקרוסקופ נתיחה עם תאורה קרה אור	אולימפוס SZ51		מצויד בשוט KL 1500 LCD
מלקחיים #2	כלי מדע פיין	11233-20
מלקחיים # 5	כלי מדע פיין	11295-00
מספריים, רפואי גדול	כלי מדע פיין	14108-09
מספריים, אביב זווית קטן	כלי מדע פיין	15033-09
תנור בקו	וורנר מכשירים	SF-28
חימום טבעת למנות של 3.5 סנטימטר	וורנר מכשירים	64-0110 DH-35
2 מערכת בקרת טמפרטורת ערוץ	וורנר מכשירים	TC-344B
מערכת משאבת superfusion			שהותקן
צלחת תרבית רקמה 15-סנטימטר	Sarstedt	83.1803.003	מלא בקרח ומכוסה על ידי לוחית מתכת
צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר	Sarstedt	83.1802.003	עם הפתרון של רינגר חומץ
צלחת תרבית רקמה 3.5 סנטימטרים	Sarstedt	83.1800.003	מלא בSylgard פולימר
Sylgard פולימר	Dow Corning	ערכת אלסטומר Sylgard 184 סיליקון
confocal מיקרוסקופ	אולימפוס	FV1000	עם ארגון ליזר
צינור תגובה 50-מ"ל	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA ב PBS	סיגמא	P6148
0.5 25 מ"מ צינורית מ"מ x	Neolab	E-1510
מזרק 1 מ"ל	Neolab	E-1496
נוגדן synaptophysin	Invitrogen	18-0130	ארנב
נוגדן משני	Invitrogen	-11012	אלכסה 594
צלחת 24 היטב	Sarstedt	83.1836
0.01 M PBS	סיגמא	P4417
0.1 מ 'גליצין ב PBS	רוט	3790.1
coverslips	Neolab	E-4132
שקופיות	Neolab	E-4121
Vectashield	מעבדות וקטור	H-1000
פיני minutien × 10	כלי מדע פיין	26002-20	קצר ל< 4 מ"מ
α-Bungarotoxin מצמיד את אלכסה 594	Invitrogen (בדיקות מולקולריות)	B-13423
			חסימת פתרון
0.01 M PBS
0.2% Triton-x100	רוט	3051.3
10% סרום עיזים רגיל	Abcam	ab7481
1% אלבומין בסרום שור	סיגמא	A7030
			צלצלן מבעבע עם 95% O 2/5% CO 2
125 המ"מ NaCl	סיגמא	S7653
2.5 המ"מ KCl	סיגמא	P9333
1.25 מ"מ nah 2 PO 4	סיגמא	S8282
26 המ"מ 3 NaHCO	סיגמא	S6297
2 המ"מ CaCl 2	סיגמא	21114
1 המ"מ MgCl 2	סיגמא	63020
גלוקוז 20 מ"מ	סיגמא	G7528
			טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים.