Sıralı Nöromusküler Kavşağı'nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Özet

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir ve Post-hoc Immunostainings.

Özet

Foto-ağartma Sıralı NMJ tek tek SC'ler etiketlemek için bir non-invaziv bir yol sağlar. NMJ memeli sinir sisteminin büyük sinaps ve sinaptik yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya modeli yol gösterici olarak görev yapmıştır. Fare NMJs Motor akson terminalleri olarak kas lifleri ile simit benzeri iletişim siteleri oluşturur. Motor akson ve terminali SC'ler tarafından kılıflı edilir. Geçtiğimiz on yıl içinde, çok sayıda transgenik farelerin sırasıyla Thy1-XFP ¹ ve Plp-GFP fareler ² örneğin, motor nöronlar ve SC'ler görselleştirmek için üretilmedi.

Motor akson boyunca myelinating aksonal SCs sıçrayabilen aksiyon potansiyelinin yayılmasını sağlamak için, Ranvier düğümler yoluyla ayrılmış ve çakışma internod düzenlenmiştir. Buna karşılık, sinaps terminal SC'ler izlemek ve nörotransmisyon teşvik, enkaz ve kılavuz rejenere aksonların sindirmek özelleşmiş glia hücreleri vardır. NMJs sıkıca yarım düzine olmayan myel kadar kapsamındadırTerminal SC'ler inating - onlar doğrudan membran temas ^3'te olduğu gibi bu, ancak, ayrı ayrı, ışık mikroskobu ile çözülemez.

Çeşitli yaklaşımlar bireysel terminali SC'ler görselleştirmek için var. Bunların hiçbiri olsa, kusursuz vardır. Örneğin, tek hücreler bir boya ile doldurulmuş bir mikroelektrot kazığa olan boya dolgu, ikinci bir doldurma önce bir etiketli hücre tahrip gerektirir. Bu sonraki time-lapse kayıt ³ ile uyumlu değildir. SC'ler Çok-spektral "Brainbow" etiketleme floresan proteinlerinin kombinatoryal ifadesi ⁴ kullanılarak elde edilmiştir. Ancak bu teknik, çeşitli transgenlerin bileşiminden oluşur ve ikinci promoterlerin salgılama modeli ile sınırlıdır. Gelecekte, SCs içinde "foto-değiştirilebilir 'proteinlerin ekspresyonu daha başka bir alternatif ⁵ olabilir. Burada ardışık fotoğraf beyazlatma tek hücre ağartılmış, nerede ve çıkarılması ile elde ettikleri görüntüyü sunmak. İnanıyoruzBu yaklaşım - kolaylığı ve çok yönlülük nedeniyle - in vivo kullanılan ve diğerleri hücre tipleri, anatomik siteleri veya türlerin ⁶ transfer edilebilir özellikle sinirbilimci teknoloji paletine kalıcı yanı, temsil eder.

Triangularis sternumun kas eksplantlar terminali SC'ler için ağartma sıralı ve sonraki konfokal time-lapse mikroskopi aşağıdaki protokol, biz detaylı uygulama. Bu, ince yüzeysel ve kolayca diseke sinir-kas hazırlık ^7,8 NMJ gelişimi, fizyolojisi ve patolojisi ⁹ çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nihayet, biz fiksasyon yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme, immünohistokimya veya ultrastrüktürel incelemeler korelasyon gerçekleştirmek için sonra triangularis sternumun kası nasıl hazırlanır açıklamak.

Protokol

1. Triangularis sternumun Eksplantasyon (Şekil 1)

Zamanlama: 15 dk.

1. Forseps 2 çift, 1 adet makas, makas 1 adet makas, 1 doku kültür kaplarına (10-cm): cerrahi aletler hazırlayın. (15 dakika için asgari) önceden soğutulmuş kabarcıklandırılmış (4 ° C),% 5 _CO2 /% 95 O ile ₂ arasında Ringer çözeltisi. Buz ile 15-cm doku kültürü çanak doldurun ve metal plaka ile örtün. Diseksiyon mikroskobu hazırlayın ve diseksiyon sırasında eksplant soğutmak için diseksiyon kapsamında buz ile 15 cm çanak yerleştirin.
2. Öldürücü izofluran aşırı dozu (ya da kurban herhangi bir başka uygun yöntem) ile fare anestetize. Eksplant kürk kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile fare püskürtün. SC beyazlatma için, akson eş zamanlı görselleştirme için Thy1-OFP3 veya Thy1-Membow13 için geçilebilen Plp-GFP fareler kullanılmıştır.
3. Büyük makas çifti kullanarak, bir orta hat kesi yapmaksternum ve kaburga kafesinin alt kenarına paralel iki kesinin üzerinde cilt.
4. Büyük makas çifti kullanarak, cilt kaldırmak karın duvarı açın ve Vertebral kolon tüm yolu geri göğüs kafesine kesiler paralel hale. Sonra sternum de kas ekleme yakın kesiler yaparak göğüs kasları kapalı teşrih.
5. Sadece ksifoid kıkırdak altındaki açık diyafram Kes ve kostal eklemeleri birlikte diyafram kapalı teşrih.
6. Forseps bir set ile kılıç şeklinde sürecinin kaburga kafesinin Holding, yakın kendi eklemeleri mümkün olduğunca, omurga kapalı kaburga kesim başlar. Sağ ve sol kesim ağız sapı sternumun doğru kalp Yukarıdaki yakınsama gerekir. Büyük kan damarlarının (özellikle subklavian damarlar) kesme önlemek için deneyin. Daha iyi görünürlük forseps ile ksifoid süreci üzerine tutarak yavaşça hazırlık kaldırarak elde edilir.
7. Sadece ağız sapı sternumun altında bir enine kesim yapmakve soğutulmuş% 5 CO ₂ /% 95 O _2-kabarmış Ringer solüsyonu ile 10 cm'lik çanak içine eksplant aktarın. Buz dolu 15 cm doku kültürü çanak kapsayan metal plaka üzerinde 10 cm'lik çanak yerleştirin. Tüm diğer adımları diseksiyon mikroskop altında yapılmalıdır.
8. Küçük bahar makas kullanarak timus, plevra, diyafram (iç) ve pektoral kasların kalıntıları çıkarmak (dışında; Şekil 1B-D).
9. 3,5 cm'lik çanak eksplant sığdırmak için, sternum takmayın tüm kaburga kapalı teşrih. Bu en küçük bahar makas kullanarak ve kaburga (Şekil 1E) arasında doku kesme yapılır.
10. Minutien işaretçilerine (; Şekil 1G <4 mm olarak kısaltılmıştır) kullanarak Sylgard kaplı 3,5 cm doku kültürü çanak içine triangularis sternumun sinir-kas eksplant Pin. İki işaretçilerine sternumun kıkırdak (beyaz) parça geçmesi gerekir. Hem th sağ ve sol tarafında kaburga ile en az iki pimleriniE eksplant yumuşak kıkırdak parçaları amaçlayan ve altında kaburga kaçınarak veya triangularis kas yakındır. Daha işaretçilerine kullanılan, daha iyi (biz genellikle 8-10 kullanabilirsiniz). Eğer hazırlık aşağı pin gibi, biraz gergin pozisyona kas sabitleme, kaburga biraz yayılmış olduğundan emin olun.
11. İsteğe: Alexa renklendiriciler _(% 5 CO2 /% 95 hava kabarcığı O _2-Ringer çözeltisi içinde 0.8 ug / ml 'lik konsantrasyonda) akuple bungarotoxin eklenmesi ile asetilkolin reseptörleri içeren sinaptik görselleştirme. Oda sıcaklığında 15-20 dakika için Sylgard kaplanmış çanak içinde tutturulmuş eksplant inkübe _sonra% 5 CO2 /% 95 hava kabarcığı O _2-Ringer solüsyonu ile birkaç kez yıkayın.

2. Bleaching SC'ler ve İsteğe Time-lapse Mikroskopi (Şekil 2)

Zamanlama: 30 - 45 dk + isteğe bağlı 1 - time lapse için 5 saat.

1. Bir konfokal mikroskop donanımlı zekâ Transfer 3,5 cm Sylgard kaplı çanakh bir argon lazer (488 nm dalgaboyu) ve suya batırma amaçları (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA ve 100x, 1.0 NA veya 60x, 0.9 NA).
2. Zaman atlamalı mikroskopi için İsteğe Bağlı: Insert ısıtma halka içine çanak 3,5 cm Sylgard kaplı, superfusion sistemi ve sıcaklık probu (Şekil 2A) yükleyin. Bunların hiçbiri eksplant, çanak veya Sylgard kaplama jant temas ettiğinden emin olun. 33-35 için örnek ısıtılır ° C. Hücreler beyazlatma adımlar arasındaki az dinamikleri göstermek gibi SC time-lapse olmadan beyazlatma için, oda sıcaklığında, daha iyidir.
3. 4x hava hedefi triangularis sternumun kas innervasyonu desen gözlemlemek ve triangularis sternumun plak grup bulmak ile. 20x daldırma koni objektif geçin ve plak bant (alanlar örten kaburga iyi adaylardır) içindeki yüzeysel bölgeler için aramaya başlamak. Bireysel NMJs kontrol etmek 100x veya 60x daldırma koni objektif objektif değiştirin. İdeal birkaç SC'ler ile kaplıdır ve çok superfic bulunan bir NMJ olduğunuially (Şekil 2B). Eğer beyazlatma sonrası time-lapse görüntüleme yapıyorsanız, nispeten verimi artırmak için birbirine yakın 3 NMJs kadar seçin.
4. Foto-ağartma bireysel SC'ler (Şekil 2B) önce NMJ bir konfokal görüntü edinin. (Olympus FV1000 mikroskop örneğin tam çözünürlüklü görüntüleme için, piksel başına ~ 0.1 mikron Nyquist-sınırlı örnekleme neden bir 100x, 1.0 NA objektif ve 2.5 zoom kullanın.)
5. "Park" merkezi (5 saniye alternatif böyle bir Olympus mikroskop "kasırga tarama" işlevi olarak kullanılabilir ilgi küçük bir bölgede etkin bir tarama deseni, maksimal güç kullanarak SC çekirdeğinde 488 nm lazer ışını; biz bir konfokal mikroskop kullanımı gibi, lazer 1.0 NA objektif bir 488 nm, dolayısıyla görüntü eşlenik uçakları içine odaklanmış ve bu nedenle, çapı <0.5 mikron). Sonuç beyazlatma hücre ve yargıç üzerinde yeniden odaklanır. GFP seviyelerine kadar tekrar adım ağartma gerekli tekrarlama azaltmak isenizyakın plan seviyeleri d. (Şekil 2C) beyazlatma sonrası bir görüntü elde edin. Bu ağartılmış bölgede iki hücre arasında herhangi bir çakışma dışında olduğundan emin olmak için önemlidir - örtüşme varsa, ikinci bir hücreye beyazlatma belirgin olacaktır.
6. Biri hariç tüm SC (Şekil 2D-E) ağartılmış kadar yukarıdaki adımı tekrarlayın. Son "ağartılmamış" SC konfokal time-lapse mikroskopi için uygundur. Görüntülerin çıkarılması ile tek hücre yeniden, örneğin tek SC morfolojisi ve bölge (Şekil 2F) belirginleştiren, Photoshop yazılımı kullanarak. İki mages çıkarılarak gürültü (Photoshop ardışık "katmanlar" bunları ithal ve ardından kanalları sekmesinin üst kısmındaki açılır menüden de "fark" için üst kanala ayarlayarak gibi) ekler unutmayın. Bu çıkarmadan önce kanallarında "Benek" fonksiyonunu kullanarak ve tabii kaynaklı değil herhangi bir arka plan uzak kırpma tarafından atlatılabilirağartılmış hücre. Kontrastı optimize etmek için, bu "düzeyleri" penceresinde iki kanalın parlaklığını ayarlamak için gerekli olabilir. Ağartılmış hücre çıkan görüntü ise benzersiz bir renk tonu sözde renkli bir sinaps orijinal görüntü üzerine bindirilmiş ve (tüm ağartılmış için bunu yapmalarını orijinal görüntüdeki ağartılmış hücrenin topraklarında renklendirmek için şeffaf yapılmış ve son , ağartılmamış hücreler Şekil 2F neticelerinde gösterildiği resim).
7. İsteğe bağlı: Biri hariç tüm SC'ler beyazlatma sonrası Başlangıç ​​konfokal time-lapse mikroskopi. Sabit aralıklarla (örneğin, her 5-10 dk), bir görüntü al. Mümkün olduğunca az lazer güç olarak kullanın. Kadar 3 NMJs aynı seansta görüntülenebilir.
8. Sonra, yakınlaştırma olmadan 100x az 20x ve ​​4x hedefleri (Şekil 2G-I) kullanılarak bölgenin görüntüleri bir görüntü alarak zaman lapsed NMJs bir harita olun. Bu "harita", sabit bir kas immünohistokimya ardından NMJs bulmak için gereklidir.
9. Görüntü içinişleme, maksimum yoğunluğu projeksiyonları içine bireysel görüntüleri dönüştürmek ve tiff formatında kaydedin. Bir yığın içine tüm z yansıtılan zaman noktaları birleştirin ve xy hizalamak, örneğin (açık kaynak yazılım ImageJ dayanan bir paket; Ulusal Sağlık Enstitüleri) Fiji "stackreg" eklentisi kullanarak ^10.

3. Fiksasyon ve İmmünohistokimya (Şekil 3)

Zamanlama: geceleme.

1. Dikkatli bir şekilde pimleri kaldırarak, en az 15 ml% 4 PFA içeren 50 ml reaksiyon tüpü içine eksplant aktarın. Buz üzerinde 1 saat triangularis sternumun kas içeren anterior göğüs duvarı post-fix. En az 10 dakika boyunca PBS içerisinde 0.1 M glisin (kalıntı sabitleştirici gidermek ve böylece arka planı azaltmak için) ile sabit doku durulayın. Numuneler bu noktada saklanabilir ve daha sonra işlenebilir.
2. 0.01 M PBS ile dolu bir 10 cm Sylgard astarlı doku kültürü çanak sabit eksplant aktarın. Biri si olan bir yamuk şekli kesipgöğüs kemiği ve kemik-kıkırdak geçişler yoluyla diğer de paralel - bu yüzeyinde triangularis kas içerir. Yatay (yani trans-sternal) triangularis kas kaudal sonunda serbestçe erişilebilir, böylece kesilmiş olan alt kaburga çıkarın (Şekil 3A-D).
3. Yamuk üst kısmı (Şekil 3E) içine bir pim gibi, bir derialtı iğne yerleştirin. Nazikçe bir kas kaudal köşe tutunma ve bir mikro-neşter olarak iğne kullanarak yüzey üzerinde triangularis kas kaldırmak için 1 ml'lik şırınga ve forseps ile bağlı bir hipodermik iğne kullanarak. Keser Torasik duvar düzlemine paralel yapıldığından emin olun. Kas kaudal kısmı serbest bırakıldıktan sonra, göğüs duvarı aracılığıyla kas altına bir iğne gibi başka bir derialtı iğne takın - Bu hazırlık immobilizes ve forseps (Şekil 3F) kullanarak kas üzerinde hafif bir çekme uygulayarak sağlar. Eğer bağ tiss kesim gibiue eklemeleri, "soyma" away göğüsten kas. Yaylı makas ile son kaudal eki kesin. Forseps kullanarak yağ ve kan damarı kalıntıları çıkarın. . Canlı ve sabit doku ile çalışmak için araçlar ve yemekleri ayrı ayrı kümeler kullanın: sinirler uzakta rip değil unutmayın dikkatli olun.
4. Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca bloke etme çözeltisi içine doku örnekleri aktarılması ile immünohistokimyasal (bir standart protokolü kullanarak) başlatın. Boyanması için mümkün olan en küçük hacim 96-kuyucuklu bir plaka ile 200 ul bir.
5. 4 gecede engelleme çözümü, kuyu başına 200 ul, ° çalkalayıcı üzerinde C seyreltilmiş primer antikor uygulayın.
6. 10 dakika için 0.01 M PBS içinde üç kez yıkanır.
7. Bloke etme çözeltisi ile seyreltilir, oda sıcaklığında, 1-2 saat için uygun bir ikincil antikor uygulanır.
8. 10 dakika için 0.01 M PBS içinde üç kez yıkanır.
9. Anti-fading orta (örn. Vectashield) ve lamel olarak monte edin.
10. Manyetik metal plaka üzerine yerleştirin slayt, üstüne koyun mıknatıs4 ° C'de birkaç saat veya gece boyunca düzleştirmek için örnek Oje ile mühürleyin.

Sonuçlar

Görüntüleme yemek için hazır bir triangularis sternumun eksplant bir örneği Şekil 1G 'de gösterilmiştir. Triangularis kas kas liflerinin birkaç katmandan oluşur ancak bu gibi eksplant NMJs ex vivo görüntüleme için özellikle uygundur. Bu, transgenik fare hatları elde edilen eksplantlarından yüksek çözünürlükte görüntü elde sağlayan vurgulamak SCs (PLP-GFP ²⁾ ve / veya akson (Thy1 ^XFP-1) ya da. Yüksek kaliteli görüntülem...

Tartışmalar

Burada sunulan SC beyazlatma yöntemi, basit, hızlı ve çok yönlüdür: (i) tek bir transgen esas konfokal mikroskopi ile tek SC morfolojisi ve dinamikleri açığa sağlar - Ek allelleri gerektiren hastalık modelleri ile yaklaşım örneğin birleştirerek zaman önemli bir avantaj . Diseksiyon dan tespit için yarım gün içinde gerçekleştirilebilir (ii) 'deki metod olup, hızlıdır. Bu tür hücre ablasyon, görüntüleme organeller, elektrofizyoloji veya immünohistokimya gibi başka yöntemler ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirketi (örnek)	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
% 70 (hacim / hacim) etanol	Roth	T913.1	sprey şişesinde
izofluran	Forene, Abbott		Başka onaylı anestetik öldürücü anestezi için kullanılabilir
transgenik fareler (Plp-GFP)			anılan kaynaklardan elde edilecek
soğuk ışık aydınlatması ile diseksiyon mikroskobu	Olympus SZ51		Schott KL 1500 LCD ile donatılmıştır
forseps #2	Güzel Bilim Araçları	11233-20
forseps # 5	Güzel Bilim Araçları	11295-00
makas, büyük bir tıp	Güzel Bilim Araçları	14108-09
makas, küçük açılı bahar	Güzel Bilim Araçları	15033-09
in-line ısıtıcı	Warner Instruments	SF-28
3,5 cm yemekleri için halka ısıtma	Warner Instruments	64-0110 DH-35
İki kanallı sıcaklık kontrol sistemi	Warner Instruments	TC-344B
superfusion pompa sistemi			sipariş üzerine yapılmış
15-cm doku kültürü çanak	Sarstedt	83.1803.003	buz ile dolar ve metal plaka ile kaplı
10-cm doku kültürü çanak	Sarstedt	83.1802.003	Oksijenli Ringer solüsyonu ile
3,5 cm doku kültürü çanak	Sarstedt	83.1800.003	Sylgard polimer ile dolu
Sylgard polimer	Dow Corning	Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı
konfokal mikroskop	Olimpos	FV1000	argon laser
50 ml reaksiyon tüpü	Sarstedt	62.547.254 PP
PBS içinde% 4 PFA	Sigma	P6148
Kanül 0.5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
1 ml şırınga	Neolab	E-1496
sinaptofizin antikor	Invitrogen	18-0130	tavşan
sekonder antikor	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24-kuyulu plakalı	Sarstedt	83.1836
0.01 M PBS	Sigma	P4417
PBS içinde 0.1 M glisin	Roth	3790.1
lamelleri	Neolab	E-4132
slaytlar	Neolab	E-4121
Vectashield	Vektör laboratuvarları	H-1000
minutien işaretçilerine × 10	Güzel Bilim Araçları	26002-20	<4 mm kısaltılmış
α-Bungarotoxin Alexa 594 akuple	Invitrogen (Moleküler Sondalar)	B-13423
			Çözüm Engelleme
0.01 M PBS
% 0.2 Triton-X100	Roth	3051.3
10% Normal Keçi Serum	Abcam	ab7481
% 1 sığır serum albümini	Sigma	A7030
			Ringer % 95 O2 /% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2.5 mM KCI	Sigma	P9333
1.25 mM NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO 3	Sigma	S6297
2 mM CaCl2	Sigma	21114
1 mM MgCl2	Sigma	63020
20 mM glikoz	Sigma	G7528
			Tablo 1. Özgül reaktifleri ve ekipmanları.