Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Zusammenfassung

Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. "Sequential Fotobleichen" ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und Post-hoc Immunfärbungen.

Zusammenfassung

Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP ¹ und Plp-GFP Mäusen ^2.

Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs - dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran ³ befinden.

Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen ^3. Multispektrales "Brainbow" Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen ⁴ erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck "photoschaltbare" Proteine ​​in SCs noch eine andere alternative ⁵ sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz - aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit - eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten ^6.

In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat ^7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie ⁹ nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.

Protokoll

Ein. Triangularis Sterni Explantation (Abbildung 1)

Timing: 15 min.

1. Bereiten chirurgische Instrumente: 2 Paar Zangen, 1 Schere, 1 Paar Frühjahr Schere, 1 Gewebekulturschale (10-cm). Pre-Blasen (mindestens 15 min) gekühlt (4 ° C) Ringer-Lösung mit 5% CO _2/95% O _2. Füllen Sie 15-cm Gewebekulturschale mit Eis und bedecken Sie es mit Metallplatte. Planen Dissektionsmikroskop und legen die 15-cm-Schale mit Eis unter der Dissektion Umfang um das Explantat beim Präparieren kühlen.
2. Lethally betäuben der Maus durch Isofluran Überdosierung (oder einem anderen anerkannten Methode des Opfers). Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol zu Pelz Kontamination der Explantation zu verhindern. Für SC Bleichen, verwendeten wir Plp-GFP-Mäuse, die Thy1-OFP3 oder Thy1-Membow13 zur gleichzeitigen Visualisierung der Axon überquert werden können.
3. Mit dem Paar große Schere, einen Medianschnitt desdie Haut über dem Brustbein und zwei Einschnitte parallel zur unteren Kante des Brustkorbs.
4. Mit dem Paar große Schere, die Haut entfernen, öffnen Sie die Bauchdecke, und machen Einschnitte parallel zum Rippenbogen den ganzen Weg zurück auf die Wirbelsäule. Dann sezieren off die Brustmuskeln durch Einschnitte in der Nähe des Muskels Einsetzen an dem Brustbein.
5. Schneiden Sie die Blende geöffnet knapp unterhalb der xiphoid Knorpel und sezieren off der Membran entlang ihrer Küsten-Insertionen.
6. Halten des Brustkorbs des Xiphoid mit einem Satz von Zangen, startet das Schneiden der Rippen von der Wirbelsäule, so nah wie möglich an ihrer Insertionen. Die linke und rechte Schnitte sollten oberhalb des Herzens in Richtung Man. sterni konvergieren. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden großen Blutgefäße (vor allem die subclavia). Bessere Sichtbarkeit wird durch leichtes Anheben der Vorbereitung, während auf den Xiphoid mit einer Pinzette erreicht.
7. Machen Sie einen Schnitt quer unterhalb des Man. sterniund übertragen das Explantat in den 10-cm-Spiegel mit gekühlter 5% CO _2/95% O _2-Blasen Ringer-Lösung. Legen Sie die 10-cm-Spiegel auf der Metallplatte für den 15-cm Gewebekulturschale mit Eis gefüllt. Alle weiteren Schritte sollten unter der Dissektionsmikroskop durchgeführt werden.
8. Mit kleinen Feder Schere entfernen Sie die Reste des Thymus, Pleura, Zwerchfell (innen) und Brustmuskeln (außerhalb; 1B-D).
9. Um das Explantat in dem 3,5-cm-Schale passen, sezieren off alle Rippen, die nicht mit dem Brustbein haben einzufügen. Dies geschieht am besten mit kleinen Feder Schere und Schneiden des Gewebes in zwischen den Rippen (1E).
10. Pin der triangularis sterni Nerv-Muskel-Explantat in die Sylgard beschichtet 3,5-cm Gewebekulturschale mit minutien Stifte (verkürzt auf <4 mm; Figur 1G). Zwei Stifte sollten durch knorpeligen (weiß) Teilen des Brustbeins zu gehen. Legen mindestens zwei Stifte durch die Rippen sowohl auf der linken und rechten Seite des the Explantat Ziel für die weicheren Teile und knorpeligen Vermeidung der Rippen unter oder nahe der triangularis Muskel. Je mehr Nadeln verwendet werden, desto besser (wir verwenden typischerweise 8-10). Wie Sie unten Stift die Vorbereitung, stellen Sie sicher, dass die Rippen etwas verteilt sind, zur Festsetzung der Muskel in einer leicht gestreckten Position.
11. Optional: Visualisieren synaptischen Seiten mit Acetylcholin-Rezeptoren, indem Bungarotoxin gekoppelt Alexa-Farbstoffe (Konzentration von 0,8 pg / ml in 5% CO _2/95% O _2-Blasen Ringer-Lösung). Inkubieren merken Explantat in Sylgard beschichtete Schale für 15-20 min bei Raumtemperatur dann waschen mehrmals mit 5% CO _2/95% O _2-Blasen Ringer-Lösung.

2. Bleaching SCs und optionale Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 2)

Timing: 30 - 45 min + optional 1 bis 5 Stunden für Zeitraffer.

1. Transfer 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Gericht zu einem konfokalen Mikroskop ausgestattet with ein Argon-Laser (488 nm Wellenlänge) und dem Eintauchen in Wasser Objektive (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 NA und 100x, 1,0 NA oder 60x, 0,9 NA).
2. Optional für Zeitraffer-Mikroskopie: Insert 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Schale in Heizring, installieren Superfusionssystem und den Temperaturfühler (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass keiner von ihnen das Explantat, der Rand des Spiegels oder des Sylgard Beschichtung berühren. Erhitzen der Probe auf 33-35 ° C. Für SC Bleichen ohne Zeitraffer, Raumtemperatur ist besser, als Zellen weniger Dynamik zwischen Bleich-Schritte zeigen.
3. Mit einem 4x Luftobjektiv beobachten Innervationsmuster triangularis sterni Muskeln und finden triangularis sterni Endplatte Band. Wechseln Sie zu 20x Tauchen-cone Ziel und die Suche nach oberflächlichen Regionen innerhalb der Endplatte Band (Bereiche darüberliegenden Rippen sind gute Kandidaten). Ändern Ziel 100x oder 60x Tauchen-cone Ziel auf einzelne NMJs überprüfen. Ideal ist ein NMJ, die von mehreren SCs abgedeckt und befindet sich in unmittelbarer superficially (2B). Wenn Sie Zeitraffer-Aufnahmen nach dem Bleichen durchzuführen, wählen Sie bis zu 3 NMJs, die relativ nahe beieinander liegen, um die Ausbeute zu erhöhen.
4. Erwerben Sie eine konfokale Abbildung des NMJ vor Fotobleichen einzelne SCs (Abbildung 2B). (Für volle Auflösung Bildgebung auf einem Olympus FV1000 Mikroskop zB, verwenden Sie eine 100x, 1,0 NA objektive und 2,5 Zoom, der in Nyquist-limited Probenahme von ~ 0,1 um pro Pixel führt.)
5. "Park" der 488 nm Laserstrahls zentral auf dem Kern einer SC mit voller Leistung für 5 Sekunden (alternativ ein effizientes Abtastmuster in einer kleinen Region von Interesse verwendet werden kann, wie der "Tornado-Scan"-Funktion auf einem Olympus-Mikroskop; da wir ein Konfokalmikroskop zu verwenden, wird der Laser in die Bild-konjugierten Ebenen fokussiert und daher bei 488 nm mit einem Objektiv von 1,0 NA, <0,5 um im Durchmesser). Auf die Zelle und Richter Bleichergebnis neu ausrichten. Wenn nötig wiederholen Bleichschritt erst wieder GFP Ebenen sind zu reduzierend in der Nähe Hintergrund-Ebenen. Erwerben Sie ein Bild nach dem Bleichen (Abbildung 2C). Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die gebleichte Region außerhalb jeder Überlappung zwischen zwei Zellen ist - wenn es eine Überlappung wird Bleichmittel in einer zweiten Zelle offensichtlich sein.
6. Wiederholen Sie Schritt vor, bis alle, aber ein SC gebleicht werden (Abbildung 2D-E). Der letzte "rohen" SC eignet sich für die konfokale Zeitraffer-Mikroskopie. Rekonstruieren Einzelzellen durch Subtraktion der Bilder, zB mit Photoshop Software, um einzelne SC Morphologie und Gebiet (2F) abzugrenzen. Seien Sie sich bewusst, dass die Subtraktion zweier Magier fügt Rauschen (zB durch Import in Folge "Schichten" in Photoshop festlegen und dann die obere Kanal auf "Differenz" in der Drop-Down-Menü am oberen Rand der Kanäle tab). Dies kann durch die "Flecken Entfernen"-Funktion auf den Kanälen vor Abzug und Zuschneiden entfernt einen Hintergrund, die offensichtlich nicht von der nicht stammen umgangen werdengebleichten Zelle. Um den Kontrast zu optimieren, kann es erforderlich sein, um die Helligkeit der zwei Kanäle in dem "Ebenen" Fensters zu verändern. Das resultierende Bild des gebleichten Zelle ist die überlagert auf dem Originalbild einer Synapse, pseudo-farbig in einer einzigartigen Farbton und transparent gemacht, das Gebiet des gebleichten Zelle im Originalbild farblich (ab dabei für alle gebleichten und der letzte , ungebleicht Zellen das Bild in Abbildung 2F Ergebnisse gezeigt).
7. Optional: Start konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie nach dem Bleichen alle, aber ein SCs. Aufnehmen eines Bildes in festen Abständen (beispielsweise alle 5 bis 10 min). Verwenden Sie so wenig Laserleistung wie möglich. Bis zu 3 NMJs können an der gleichen Sitzung abgebildet werden.
8. Machen Sie eine Karte der Zeitraffer NMJs, indem ein Bild mit 100x ohne Zoom, dann Bilder der Region mit 20x und 4x Ziele (Abbildung 2G-I). Diese "Karte" wird benötigt, um NMJs nach Immunhistochemie einer festen Muskeln zu finden.
9. Bei Bild-Verarbeitung, Umwandlung einzelner Bilder in maximaler Intensität Projektionen und speichern im TIFF-Format. Kombinieren Sie alle z-projizierte Zeit-Punkte in einem Stapel und richten in xy, zB mit dem "stackreg" plugin ¹⁰ in Fidschi (ein Paket auf dem Open-Source-Software ImageJ basiert; National Institutes of Health).

3. Fixierung und Immunhistochemie (Abbildung 3)

Timing: Übernachtung.

1. Übertragen des Explantats in einem 50-ml-Reaktionsgefäß mit mindestens 15 ml 4% PFA durch vorsichtiges Entfernen der Stifte. Post-fix die vordere Brustwand mit dem triangularis sterni Muskel für 1 Stunde auf Eis. Spülen fixierten Gewebes mit 0,1 M Glycin in PBS (um restliches Fixiermittelpartikel quenchen und verringern somit Hintergrund) für mindestens 10 min. Proben können an dieser Stelle gespeichert und verarbeitet werden später.
2. Übertragen festen Explantat zu einem 10-cm Sylgard Gewebekulturplatte Gericht mit 0,01 M PBS gefüllt. Schneiden Sie eine Trapezform mit einer side parallel zum Brustbein und die andere durch die Knochen-Knorpel-Übergänge - diese enthält die triangularis Muskeln auf seiner Oberfläche. Entfernen Sie den unteren Rippen mit einer horizontalen (dh trans-sternal) geschnitten, so dass das kaudale Ende des triangularis Muskeln frei zugänglich ist (Abbildung 3A-D).
3. Einfügen einer Injektionsnadel als Stift in den oberen Teil des Trapezes (3E). Verwenden einer subkutanen Nadel, die an einer 1 ml Spritze und der Pinzette triangularis Muskel auf der Oberfläche zu entfernen durch leichtes Festhalten eines kaudalen Ecke des Muskels und mit der Nadel als Mikro-Skalpell. Sicherstellen, dass Schnitte parallel zu der Ebene der Brustwand hergestellt. Sobald die kaudalen Teil des Muskels wird freigesetzt, legen Sie eine andere Injektionsnadel als Stift unterhalb des Muskels durch die Brustwand - das lähmt die Vorbereitung und ermöglicht Ausüben eines leichten Zug auf den Muskel mit einer Pinzette (3F). Wie Sie schneiden Binde tissue Insertionen, "peel" weg der Muskel aus dem Thorax. Cut letzten caudal Befestigung mit Feder Schere. Entfernen Sie Fett und Blutgefäße Überreste mit einer Pinzette. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zerreißen weg die Nerven. Hinweis: Verwenden Sie getrennte Gruppen von Werkzeugen und Geschirr für die Arbeit mit lebenden und fixierten Gewebe.
4. Starten Immunhistochemie (mit einem Standard-Protokoll) durch Übertragen Gewebeproben in Blockierlösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Zimmertemperatur. Kleinstmöglichen Volumen für die Färbung ist 200 ul mit einer 96-Well-Platte.
5. Bewerben Primärantikörper in Blocking-Lösung wurden 200 ul pro Well über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler verdünnt.
6. Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min.
7. Anwenden geeigneter sekundärer Antikörper für 1-2 h bei Raumtemperatur in Blockierungslösung verdünnt.
8. Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min.
9. Montieren Sie in der Anti-Fading-Medium (zB Vectashield) und Deckglas.
10. Objektträger auf magnetischen Metallplatte, Ort Magneten aufder Probe für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 ° C abzuflachen Dichtung mit Nagellack.

Ergebnisse

Ein Beispiel eines triangularis sterni Explantat bereit zum Abbilden Schale wird in Figur 1G gezeigt. Diese Explantat eignet sich besonders für bildgebende NMJs ex vivo als die triangularis Muskel besteht nur aus wenigen Lagen von Muskelfasern. Dies ermöglicht den Erhalt hochauflösende Bilder von Explantaten aus transgenen Maus Linien abgeleitet werden, dass entweder Highlight SCs (Plp-GFP ²⁾ und / oder Axone (Thy1-XFP ^1). Kritische Faktoren für hohe ...

Diskussion

Der SC Bleichen hier vorgestellte Methode ist einfach, schnell und vielseitig: (i) Es ermöglicht enthüllt einzigen SC Morphologie und Dynamik durch konfokale Mikroskopie auf einer einzigen Transgen basiert - und das ist ein wesentlicher Vorteil bei der Kombination der Ansatz z. B. mit der Krankheit Modelle, die zusätzliche Allele erfordern . (Ii) Das Verfahren ist schnell, wie aus Dissektion zur Fixation in einem halben Tag durchgeführt werden kann. (Iii) Die Anzahl der Anwendungen ist breit, wie es mit and...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Company (Beispiel)	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
70% (Vol / Vol) Ethanol-Lösung	Roth	T913.1	in Sprühflasche
Isofluran	Forene, Abbott		jede andere zugelassene Betäubung kann für tödliche Anästhesie verwendet werden
transgenen Mäusen (Plp-GFP)			von zitierten Quellen gewonnen werden
Dissektionsmikroskop mit Kaltlichtbeleuchtung	Olympus SZ51		ausgestattet mit Schott KL 1500 LCD
Pinzette #2	Fine Science Tools	11233-20
Pinzette # 5	Fine Science Tools	11295-00
Schere, große medizinische	Fine Science Tools	14108-09
Schere, kleine abgewinkelte Feder	Fine Science Tools	15033-09
Durchlauferhitzer	Warner Instruments	SF-28
Heizen Ring für 3,5-cm-Schalen	Warner Instruments	64-0110 DH-35
Zwei-Kanal-Temperaturregelung	Warner Instruments	TC-344B
Superfusion Pumpsystem			custom-built
15-cm Gewebekulturschale	Sarstedt	83.1803.003	gefüllt mit Eis und abgedeckt Metallplatte
10-cm Gewebekulturschale	Sarstedt	83.1802.003	mit sauerstoffreichem Ringer-Lösung
3,5-cm Gewebekulturschale	Sarstedt	83.1800.003	gefüllt mit Sylgard Polymers
Sylgard Polymers	Dow Corning	Sylgard 184 Silikon-Elastomer Kit
Konfokalmikroskop	Olymp	FV1000	mit Argonlaser
50-ml Reaktionsgefäß	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA in PBS	Sigma	P6148
Kanüle 0,5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
Spritze 1 ml	Neolab	E-1496
Synaptophysin-Antikörper	Invitrogen	18-0130	Kaninchen
Sekundärantikörpers	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24-Well-Platte	Sarstedt	83,1836
0,01 M PBS	Sigma	P4417
0,1 M Glycin in PBS	Roth	3790,1
Deckgläser	Neolab	E-4132
Dias	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector Labs	H-1000
minutien Stifte × 10	Fine Science Tools	26002-20	verkürzt auf <4 mm
α-Bungarotoxin Alexa 594 gekoppelt	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Blocking Solution
0.01 M PBS
0,2% Triton-X100	Roth	3051,3
10% Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
1% Rinderserumalbumin	Sigma	A7030
			Glöckner sprudelte mit 95% O 2/5% CO 2
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM KCl	Sigma	P9333
1,25 mM NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO 3	Sigma	S6297
2 mM CaCl 2	Sigma	21114
1 mM MgCl 2	Sigma	63020
20 mM Glucose	Sigma	G7528
			Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Ausrüstungen.