שיטות ניסיוניות לבדיקת ההשפעות של הפפטיד neurotrophic, ADNF-9, נגד אפופטוזיס מושרה אלכוהול במהלך הריון בעכברי C57BL / 6

Summary

את העיצובים הניסיוניים מוצעים כאן מתמקד בחקר ההשפעות של חשיפה לאלכוהול באפופטוזיס והיישום של פפטיד neurotrophic במהלך ההריון במוח של העובר. תיאור מפורט מהרבייה לאוסף של מוח העובר מתואר. טכניקות לקביעת אפופטוזיס גם מתוארות בפירוט.

Abstract

עיצובים ניסיוניים לחוקרים את ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי בשלבים עובריים מוקדמים בצמיחת המוח העוברית מאתגרים. זה בעיקר בשל הקושי של microdissection של מוח העובר וחתכם להגדרה של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי חשיפה טרום לידתי לאלכוהול. הניסויים שתוארו כאן לספק טכניקות דמיינו מעכברי רבייה לזיהוי של מוות של תאים ברקמת המוח עוברי. מחקר זה משמש C57BL / 6 עכברים כמודל חיה ללימוד חשיפת אלכוהול עוברית ותפקידיו של פפטיד trophic נגד אפופטוזיס המושרה באלכוהול. הרבייה מורכבת מחלון מחצלת 2-HR כדי לקבוע את השלב של גיל עוברי המדויק. מודל חשיפת אלכוהול עוברי שהוקם כבר בשימוש במחקר זה כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי במוח העובר. זה כולל גישה החופשית לדיאטות נוזליות אלכוהול או זוג שייזון כמקור הבלעדי של חומרים מזינים לעכברים בהריון.

S = "jove_content"> הטכניקות מעורבות נתיחה של עוברים וMicrodissection של מוח העובר מתוארות בזהירות, שכן זו האחרונה יכולה להיות מאתגרת. Microdissection דורש stereomicroscope ומלקחי Ultra-בסדר. הליכי שלב אחר שלב ללנתח את המוח העובר מסופקים מבחינה ויזואלית. המוח העוברי הם גזורים מהבסיס של הנורה חוש הריח primordium לבסיס metencephalon.

על חקירת אפופטוזיס, מוח עוברי מוטבע ראשון בג'לטין באמצעות קליפת עובש משם כדי להקל על חתך שלהם עם מנגנון vibratome. המוח עוברי המשובצים והקבועים paraformaldehyde בקלות מחולק, ויכולים להיות מותקנים בסעיפים הצפים חינם בשקופיות בתוספת SuperFrost לנחישות של אפופטוזיס או מוות של תאים.

Tunel (תיוג TdT בתיווך dUTP ניק הסוף; TdT: מסוף deoxynucleotidyl transferase) assay כבר משמש לזיהוי מות תא או תאים אפופטוטיים. ראוי לציין כי apoptosis וcytotoxicity בתיווך התא מאופיין בפיצול ה-DNA. לכן, התאים Tunel החיוביים דמיינו מעידים על מות תא או תאים אפופטוטיים.

את העיצובים הניסיוניים כאן לספק מידע על השימוש בדיאטת נוזלים שהוקמו לחקר ההשפעות של אלכוהול ואת התפקיד של פפטידים neurotrophic במהלך ההריון במוח העובר. זה כרוך בגידול והאכלת עכברים בהריון, microdissecting מוח העובר, וקביעת אפופטוזיס. יחד, טכניקות חזותיות והטקסטואלי אלה עשויות להיות מקור לחקירת חשיפה טרום לידתי של גורמים מזיקים במוח העובר.

Introduction

המטרה של השיטות הניסיוניות שתוארו כאן היא להעריך את ההשפעות של פפטידים neuroprotective trophic במודל חשיפת אלכוהול עוברי באמצעות מספר טכניקות מעורבות רבייה, האכלה, microdissecting, וגילוי מוות של תאים. לעבוד מהמעבדה שלנו הייתה כרוך בדיאטה נוזלית מעורבבת עם אלכוהול כמודל של שתיית אלכוהול מתונה, אשר עשוי להיות דומה לפרדיגמה שתיית אדם בטווח של כמות האלכוהול נצרך ^1-5. אנו ואחרים זיהו שלושה נגזרי פפטיד שneuroprotective מפני ההשפעות המזיקות של חשיפה לאלכוהול עוברי. מחקרים חוקרים חשיפה לאלכוהול במהלך שלבים עובריים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים עלולים להוביל לזיהוי של מנגנונים אפשריים של neuroprotection ולאפשר פיתוח של הליכי התערבות. זה עשוי לספק מידע נרחב על השפעות neuroprotective וההנחתה של ההשפעות המזיקות של חשיפה לאלכוהול במהלך הריון.

מניעה אפשרית של ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי עשויה להיות כרוכה בטיפול בעכברים בהריון עם פפטידים אשר הוכחו להיות מעורבות בneuroprotection במבחנה ^6,7 ו in vivo ^1,2,4,8,9. בין פפטידים אלה, SALLRSIPA, המכונה ADNF-9 או סל, נגזר מהפעילות תלוי גורם נוירוטרופי (ADNF) ^7,10. פפטיד נוסף עם רצף NAPVSIPQ פפטיד, NAP כינה, הנגזר מחלבון neuroprotective פעילות תלויה (ADNP) ^6,11, הפגין אפקט מגן מפני סטרס חמצונים חזק הקשורים לחשיפת אלכוהול ^12,13. בנוסף, לאחרונה זיהו פפטיד, colivelin חדש מסונתז שמופיע לשחק תפקיד מפתח בneuroprotective מודל חשיפת האלכוהול העוברי ^2. Colivelin מורכב מADNF-9 ו-AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). את החשיבות של השימוש בפפטידים אלה היא שיש להם את היכולתלחצות את מחסום דם המוח כדי למנוע את ההשפעות של אפופטוזיס אלכוהול וגירעונות גדילת מוח.

השיטות הניסיוניות השתמשו בעכברי C57BL / 6 לבדיקת השפעות neuroprotective נגד אפופטוזיס המושרה באלכוהול. אנחנו אימצו חלון 2-HR במקום רבייה הלילה על מנת להעריך במדויק את היום העוברי 0 (E0), כפי שיכול להתגלות על ידי זיהוי של התוספת זרע ולמרוח בנרתיק ^1-5 זה. אנחנו השתמשנו בדיאטת נוזלים עם צינורות האכלה, כמו זה נחשב גישה החופשית במקום משלוח של אלכוהול דרך מסלול gavage, אשר עשוי לגרום ללחץ לעכברים בהריון. מצד השני, יכול להיות מאתגר microdissection בשל הרכות של רקמת המוח העוברית, אשר עשוי להיות נתקלו כאשר לנתח מוח עוברי בשלבים עובריים מוקדמים. כאן, אנו מציגים טכניקות דמיינו כדי להתמודד עם כל האתגרים הכרוכים בmicrodissection. יתר על כן, מאחר שחתך המוח העוברי גם יכול להיות מאתגר, אימצנוטכניקה שכרוכה בהטבעת המוח העוברי בתבניות באמצעות קליפה משם הטבעת ג'לטין. יש לנו כבר בהצלחה בחיתוך המוח העוברי בסעיפים חופשיים שצפו בעובי 50 מיקרומטר. זה מאפשר לנו לחקור את כל שינויים של חלבון תוכן בחלקים במוח עוברי, כולל זיהוי של מוות של תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. גידול בעלי חיים וטיפול פפטיד trophic

1. C57BL/mice גזע על ידי הצבת את נקבות העכברים (~ ישן, ממוצע במשקל 20 גרם בשבוע 6) לתוך כלובים בבית גברים במשך שעה 2.
2. בדקו אם תקע ו / או למרוח בנרתיק זרע מייד לאחר מכן.
3. אם חיובי, לייעד נקודת זמן זו כיום עוברי 0 (E0).
4. על E7, משקל להתאים נשים בהריון ולשליטת קבוצות טיפול (3 קבוצות) מוקצים כפי שתואר לאחרונה ^4: 1) קבוצת אלכוהול (אתנול) נוזל דיאטה (ALC), 2) זוג האכיל את קבוצת ביקורת (PF); 3) קבוצת טיפול פפטיד, שאמור לקבל את הזריקה (IP) intraperitoneal של פפטיד ADNF-9 לצד תזונה נוזלי חשיפה לאלכוהול (ALC/ADNF-9). הפרטים של הכנת ALC ודיאטות PF ואת ההליך של זריקות ip ניתן למצוא ^ב4 העבודה האחרונה שלנו.
5. מדוד דיאטת נוזלי אלכוהול יומית שיכול להיות מסופקת כגישה חופשית כמקור הבלעדי של חומרים מזינים. דיאטת נוזלים לא PF yoked בנפרדo סכר ALC ניתן למדוד מדי יום גם כן.
6. הנפח של דיאטה הנוזלית נצרכת במהלך 24 שעות קודמות ניתן להקליט מ30 מ"ל סיים צינורות בורג מכסה ודיאטה טריה צריכה להינתן מדי יום בין E7 לE13.

2. נתיחה של עוברים וMicrodissection של מוח העובר

1. להקריב את העכברים בהריון על ידי E13 עמוק הרדמת חסד העכברים עם ₂ CO הליך ואחריו נקע בצוואר רחם.
2. לנקות את האתר של בטן חתך עם 70% אתנול.
3. עושה חתך בבטן באמצעות מספריים ומלקחיים סטרילית.
4. ברגע שהבטן פתוחה, לנתח את הרחם על ידי מחזיק אותו עם מלקחיים ובאמצעות המלקחיים האחרים לקרוע mesometrium מהרחם. הקפד לעשות הליך זה באיטיות כדי למנוע ניקוב את העוברים.
5. הסר את העוברים מהרחם ולהעביר אותם לתוך צלחת תרבית תאים (מ"מ 60 מ"מ x 15) המכיל תמיסת מלח מאוזנת "הנקס (HBSS) במים קרים כקרח.
6. לנתח מוח העובר מהעוברים השלמים תחת stereomicroscope לmicrodissection.
7. בעזרת מלקחיים Ultra-בסדר לmicrodissection, למשוך את העור של העוברים בחלקו העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
8. ברגע שהגולגולת חשופה ומדמיין בבירור תחת stereomicroscope microdissection, אז לקלף את הגולגולת החל מחלקו האחורי של המוח בחוט השדרה ובאזורי גזע מוח.
9. הקפד לקלף פיסה אחרת פיסה מהגולגולת אחורית לחלקים קדמיים של הראש.
10. ברגע שהמוח של העובר חשוף מבחינה ויזואלית, להמשיך בחילוצם.
11. לנתח את המוח של העובר מהבסיס של הנורה חוש הריח primordium לבסיס metencephalon.
12. Postfix כל גזור מוח העובר paraformaldehyde 4% במשך 2-3 ימים. גם אתה יכול להקפיא את המוח העובר אחר מסכר אם אתה בודק אותם עבור כתם מערבי או מבחני אנזימטיות.

NT "> הערה: ההליכים לשימושים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים הוועדה השתמשו באוניברסיטת טולדו אשר הנן בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים מוסדיים הוועדה השתמשו במכון הלאומי לבריאות ומדריך ל טיפול ושימוש בחי מעבדה.

3. הטבעה של מוח עובר בטין עבור חתך

1. הכן 10% מכיתת א 'ג'לטין
2. מלא עובש לקלף משם הטבעה באמצע הדרך ולהמתין עד שמבצר ג'לטין.
3. שליטת מקום וטופל לפני לידת מוחות Side-by-צד עוברי על גבי ג'לטין הגדילו. זאת על מנת לשמור על תנאים של immunodetection של מוות של תאים עקביים בין שניהם השליטה וקבוצות ניסוי.
4. הוסף נוזל הג'לטין על גבי המוח העוברי כדי להכין תבנית שלמה (לוודא ג'לטין לא חם מדי).
5. מכניס למקרר את תבנית ג'לטין המוכנה שמחזיקה מוח העובר במשך 15 דקות.
6. לקלףפלסטיק עובש ההטבעה ולאחר מכן להעביר את המוחה המכיל ג'לטין שהוכן מראש, לעובר paraformaldehyde 4% במשך יומיים.
7. מקום וסעיף קבוע במוח העובר ג'לטין באמצעות חתך vibratome מכונה (לייקה VT 1000S) בעובי 50 מיקרומטר לחתך העטרה. עובי זה נבדק במחקרים שלנו משום שהוא מספק תכונות אנטומיות טובות יותר. בנוסף, עובי של 25 מיקרומטר וגם גבוהה יותר, ניתן לבדוק עם טכניקה זו כרוכה הגלומה של המוח של העובר ב10% ג'לטין. שים לב שסעיפי עטרה נחתכו באמצעות vibratome ברמת רוממות גרעיני הבסיס במוח הקדמי
8. לאסוף את החלקים במוח העובריים בפוספט שנאגרו תמיסת מלח (PBS).
9. הר את החלקים במוח העובריים בשקופיות Superfrost PLUS במים.
10. ייבש את החלקים רכובים במשך 15 דקות.
11. מניחים את השקופיות (רכוב עם את החלקים במוח העובריים) ב-PBS לבדיקה הבאה של יום תגובת Tunel.

4. תגובת Tunel לדהtection של מוות של תאים או אפופטוזיס

(Tunel: תיוג TdT בתיווך dUTP ניק הסוף; TdT: המסוף deoxynucleotidyl transferase). assay זה נועד כדי לקבוע מוות של תאים.

1. פנק את החלקים במוח העובר רכובים בSuperfrost פלוס שקופיות עם proteinase K (20 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס (300 μl של proteinase K המעורב ב20 מ"ל PBS). הם התאספו בשקופיות של 5 Plend הפתוח Maile).
2. יש לשטוף את חלקים במוח עובריים (רכוב בשקופיות) עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות תחת אורביטל שייקר.
3. דגירה הסעיפים עם 3% H ₂ O ₂ במתנול למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר (3% 100 מיליליטר מתנול 30% H ₂ O ₂ ב27 מ"ל) (שקופיות לא צריכה להיות בייקר).
4. יש לשטוף חלקים עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות בהקפה שייקר.
5. דגירה סעיפים בפתרון permeabilization (0.1% TritonX-100 ב 0.1% נתרן ציטרט) למשך 2 דקות על קרח (4 מעלות צלזיוס) (TritonX μl 100 + 0.1 גרם נתרן ציטראט + 99.9 מ"ל distilleמים ד).
6. יש לשטוף את החלקים בשתי פעמים PBS במשך 5 דקות בהקפה שייקר.
7. אזור יבש סביב סעיפים בשקופיות.
8. צייר מכשול בשקופיות Superfrost Plus באמצעות עט PAP. זה נועד כדי למנוע כל דליפה של תמיסה המשמשת לטיפול בסעיפים לזיהוי של תאי Tunel-חיוביים.
9. דגירה חלקים עם תערובת Tunel תגובה (50 μl מבקבוק 1 ו450 μl מבקבוק 2) עבור שעה 1 ב 37 ° C, השליטה תהיה בשימוש על ידי דגירה בתמיסה מבקבוק 2.
10. לשטוף עם דקות PBS שלוש פעמים 5 תחת אורביט ייקר.
11. אזור יבש סביב רקמה.
12. דגירה סעיפים עם ממיר-POD למשך 30 דקות ב 37 ° C.
13. יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם טריס HCl (pH 7.5, 0.05 מ ').
14. דגירה המקטעים עבור 7 דקות ב0.05% tetrahydrochloride 3'-3'-diaminobenzidine (DAB) ו0.003% H ₂ O ₂ (25 מ"ל טריס HCl, pH7.5, 0.05 מ '+ 25 3% μl H ₂ 0 ₂ + 500 DAB μl) תחת Oribtal ייקר על 4 מעלות צלזיוס (בקרח) וכהה (הקפד לעשות את ההליך הזה בניו של 5 Plend הפתוח מיילר).
15. יש לשטוף את החלקים עם PBS דקות שלוש פעמים 5 תחת אורביטל שייקר.
16. שמור את סעיפי מגלשות PBS במשך לא יותר מ 24 שעות ב-PBS, ולאחר מכן לעבד אותם לצביעת Nissl כמפורט בפרוטוקול הסעיף הבא.

הערה: DAB הוא חומר מסרטן. השתמש בכפפות ולנקות את כל הכלים המשמשים עם אקונומיקה פעם אחת סיימה עם כל הניסויים.

5. מכתים Nissl להכנת חלקים במוח העוברי להסתכלות מיקרוסקופית

1. הליך מכתים Nissl צריך להיעשות במכסת מנוע בטיחות ביולוגית.
2. יש לשטוף את חלקי השקופית עם מים deionized למשך 2 דקות.
3. דגירה הסעיפים באתנול 70% למשך 2 דקות.
4. דגירה הסעיפים באתנול 95% במשך 6 דקות.
5. דגירה הסעיפים באתנול 70% למשך 2 דקות.
6. יש לשטוף את החלקים בואט deionizedאה למשך 2 דקות.
7. דגירה הסעיפים בסגול cresyl כתם במשך 3 דקות.
8. יש לשטוף את החלקים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
9. דגירה הסעיפים באתנול 70% למשך 2 דקות.
10. דגירה הסעיפים באתנול 95% + חומצה אצטית קרחונית מ"ל 3 דקות 3.
11. דגירה הסעיפים באתנול 95% עבור 2 דקות.
12. דגירה הסעיפים ב100% אתנול למשך 2 דקות שלוש פעמים.
13. דגירה הסעיפים בקסילן לשלוש פעמים 10 דקות.
14. יכולות להיות מותקנים שקופיות המחזיקות את החלקים במוח העובריים באמצעות Permount ושקופיות זכוכית להחליק את המכסה.
15. השאר את רכוב שקופיות הלילה לפני התבוננות וניתוח מיקרוסקופי.
16. התבוננות וPhotomicrographs מיקרוסקופי יכולים להתבצע תחת מיקרוסקופ הזקוף לייקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטות הניסיוניות מתוארות כאן מראים כי חלון רבייה 2-HR הוא חיוני כדי להעריך בשלב הריון מדויק. אנחנו הוכחנו נתיחה של העוברים בגיל E13. אנחנו גם הוכיחו microdissection של מוח העובר בE13. ההליך כרוך בכמה שלבים (AC), כפי שמתוארים באיור 1. מוח עוברי הם גזורים מהבסיס של הנורה חוש ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המתודולוגיה והטכנולוגיה שהוצגה במחקר זה מדגימים את ההשפעות של חשיפה טרום לידתי לאלכוהול במוח העובר ואת התפקיד של פפטידים trophic במניעת תופעות אלה. אלה עשויים לספק מידע על איך ללמוד תרופות אחרות של התעללות או כימיקלים רעילים אחרים במוח העובר בשלבי הריון שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Slides	VWR	48311-703
PAP PEN	Research Products Int. Corp.	195506
5-Plend Open Mailer	Heathrow Scientific, LLC	HS 15983G
Peel away embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70182
In situ cell death detection kit, POD	Roche Diagnostics, Inc	11684817910
Hanks' Balanced Salt Solution	Invitrogen	14170-120
Gelatin Type A	FisherScientific	G8-500
Stereomicroscope	W. NUHSBAUM, Inc	Leica M60, KL 200 LED
Micro-Vibratome	Leica, Inc	Leica VT 1000S
Moria Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40	2 pairs
Graduate 30 ml feeding tubes	Dyets, Inc	900012
Vitamin Mix	Bio-Serv. Inc.	F8031
Mineral Mix	Bio-Serv. Inc.	F8598
Maltose Dextrin	Bio-Serv. Inc.	3650
Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons	111000190-SS05	Pharmco-AAPER
Upright microscope	W. NUHSBAUM, Inc	LEICA DM 4000