Экспериментальные методы изучения влияния Нейротрофических пептида ADNF-9, против пьянства-индуцированного апоптоза в период беременности у мышей C57BL / 6

Резюме

Экспериментальные конструкции предлагаемого здесь сосредоточиться на изучении последствий воздействия алкоголя в апоптоз и применение нейротрофических пептида во время беременности в мозгу плода. Подробное описание из разведения в коллекцию плода мозг описывается. Методы определения апоптоза, также описаны в деталях.

Аннотация

Эксперимента для изучения влияния пренатального воздействия алкоголя на ранних эмбриональных стадиях развития плода в мозге являются сложными. В основном это связано с трудностью микродиссекции мозг плода и их срезов для определения апоптоза клеток вызвано пренатального воздействия алкоголя. Эксперименты, описанные здесь методы обеспечивают визуализированных от мышей селекции для идентификации гибель клеток в эмбриональной ткани мозга. В настоящем исследовании использованы C57BL / 6 мышей, как животная модель для изучения воздействия на плод алкоголя и роль трофических пептида против алкоголь-индуцированного апоптоза. Разведения состоит из 2-часового окна маты для определения точной стадии эмбрионального возраста. Модель создана плода воздействия алкоголя была использована в данном исследовании для определения влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода. Это предполагает свободный доступ к алкоголю или пару кормили жидкой диеты в качестве единственного источника питательных веществ для беременных мышей.

Для исследования апоптоза, фетальный мозг первая встроенная в желатиновых использованием кожуры от формы, чтобы облегчить их секционирования с Vibratome аппарата. Плод мозг вставлена ​​и зафиксирована в параформальдегид легко срезы и свободно плавающим секции могут быть установлены в SuperFrost слайдов, а также для определения апоптоза или гибель клеток.

TUNEL (TdT-опосредованного дУТФ Ник конец маркировки; TdT: терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) анализ используют для определения гибели клеток или апоптоза клеток. Стоит отметить, что APoptosis и клеточно-опосредованной цитотоксичности характеризуются фрагментации ДНК. Таким образом, визуализированных TUNEL-положительных клеток свидетельствует о гибели клеток или апоптоза клеток.

Экспериментальный дизайн здесь предоставляют информацию об использовании установленной жидкую диету для изучения влияния алкоголя и роль нейротрофических пептидов во время беременности в фетальных мозгов. Это включает в выращивании и откорме беременных мышей, microdissecting плода мозг и определения апоптоза. Вместе, эти визуальные и текстовые методы могут быть источником для исследования пренатального воздействия вредных веществ в мозге плода.

Введение

Целью экспериментальных методов, описанных здесь является оценка нейропротекторное действие пептидов в трофических плода модель воздействия алкоголя с помощью нескольких методов с участием разведение, кормление, microdissecting и обнаружения гибели клеток. Работа из нашей лаборатории участвуют жидкую диету в сочетании с алкоголем в качестве модели умеренного употребления алкоголя, который может быть похож на человека в парадигме питьевой срока количество выпитого ^1-5. Мы и другие определены три пептидные производные, которые являются нейропротекторное против вредных эффектов внутриутробного развития плода алкоголя. Исследования, изучающие воздействие алкоголя во время эмбрионального стадий с использованием животных моделей может привести к выявлению потенциальных механизмов нейропротекции и создать условия для развития процедуры вмешательства. Это может обеспечить достаточно информации о нейропротекторное действие и ослабления вредного воздействия выдержки спирта во время беременности.

Возможные предотвращения воздействия в пренатальной спирт может включать в лечении беременных мышей с пептидами, которые, как было показано, участвуют в нейропротекции в пробирке ^6,7 и в естественных ^1,2,4,8,9. Среди этих пептидов, SALLRSIPA, известные как ADNF-9 или SAL, выводится из зависимым от активности нейротрофический фактор (ADNF) ^7,10. Другой пептид с последовательностью NAPVSIPQ пептид, названный NAP, полученных от активно-зависимый нейропротекторные белка (ADNP) ^6,11, продемонстрировал мощный защитный эффект против окислительного стресса, связанного с воздействием алкоголя ^12,13. Кроме того, в последнее время мы определили новый синтезированный пептид, colivelin который, кажется, играют ключевую роль в нейропротекторные плода модель воздействия алкоголя ^2. Colivelin состоит из ADNF-9 и AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Важность использования этих пептидов в том, что они имеют возможностьпересечь гематоэнцефалический барьер, чтобы предотвратить воздействие алкоголя-индуцированного апоптоза и дефицита роста мозга.

Экспериментальные методы мышей C57BL / 6 для тестирования нейропротекторное действие против алкоголь-индуцированного апоптоза. Мы приняли с 2 часами окно, а не на ночь разведение того, чтобы точно оценить эмбриональный день 0 (E0), так как она может быть раскрыта путем выявления вилку сперме и влагалищных мазков ^1-5. Мы использовали жидкую диету с питательные трубки, так как это будет рассматриваться как свободный доступ вместо поставки алкоголя через желудочный зонд маршруте, которые могут вызвать стресс для беременных мышей. С другой стороны, микродиссекции может быть сложной задачей в связи с мягкостью ткани плода мозга, которое может возникнуть при рассечения плода мозг на ранних эмбриональных стадиях. Здесь мы покажем, визуализировали методы для решения всех проблем связанных микродиссекции. Кроме того, поскольку срезов мозга плода также может быть сложным, мы принялиметод, который предполагает вложение мозг плода в желатиновых использованием кожуры от вложения форм. Мы добились успеха в сокращении плода мозги в свободное плавание в разделах толщиной 50 мкм. Это позволяет исследовать любые изменения содержания белка в мозге плода разделов, в том числе выявление гибели клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Племенных животных и лечение трофических Пептид

1. Порода C57BL/mice путем размещения самок мышей (~ в возрасте 6 недель, средний вес 20 г) в мужской клетке дома в течение 2 часов.
2. Проверьте разъем спермы и / или вагинального мазка сразу после этого.
3. Если положительно, назначить этот момент времени, как эмбриональный день 0 (E0).
4. На E7, вес соответствии беременных самок контроля и лечения группы (3 группы) назначаются как описано недавно ^4: 1) спирт (этанол) жидкость группа диета (ALC), 2) пара кормили контрольной группе (PF), 3) пептидной группы лечения, которое должно получают внутрибрюшинно (IP) инъекции ADNF-9 пептидов наряду воздействия алкоголя жидкую диету (ALC/ADNF-9). Подробная информация о подготовке ALC и PF диет и порядок IP инъекции можно найти в нашей недавней работе ^4.
5. Измерьте ежедневного рациона алкоголь жидкости, которые могут быть представлены в виде бесплатного доступа в качестве единственного источника питательных веществ. PF жидкую диету индивидуально запряженных тО плотины ALC может быть измерена ежедневно, а также.
6. Объем жидкой диете потребляются в течение предыдущих 24 часов может быть записано от 30 мл градуированные завинчивающейся крышкой трубы и свежеприготовленный диета должна быть предоставлена ​​ежедневно с Е7 E13.

2. Вскрытие плодов и микродиссекции плода Мозги

1. Жертвоприношение беременных мышей на E13 по эвтаназии глубоко мышей с CO ₂ методом с последующей смещения шейных позвонков.
2. Очистите брюшной месте разреза с 70% этанола.
3. Сделайте разрез брюшной стенки с использованием стерильных ножниц и щипцов.
4. Как только живот открыт, Рассеките из матки, держа ее одной пинцетом и, используя другую щипцами рвать mesometrium от матки. Убедитесь в том, чтобы сделать эту процедуру медленно, чтобы избежать проколов эмбрионов.
5. Снимите эмбрионов из матки и передавать их в блюдо культуры клеток (60 мм х 15 мм), содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) в ледяной воде.
6. Проанализируйте плода мозг от всего эмбрионов под стереомикроскопом микродиссекции.
7. Использование ультра-тонкий пинцет для микродиссекции, снять кожу эмбрионов в верхней части головы, чтобы разоблачить черепа.
8. Как только череп подвержен, и ясно представляли под микродиссекции стереомикроскоп, то снимите черепа, начиная с задней части мозга, в спинном мозге и стволе мозга областях.
9. Обязательно снимите черепа кусок за куском от задней к передней части головы.
10. Как только мозг плода подвергается визуально, продолжить их извлечением.
11. Рассеките фетального мозга от основания зачатка обонятельной луковицы к основанию задний мозг.
12. Postfix все расчлененные плода мозг в 4% параформальдегиде течение 2-3 дней. Вы можете также заморозить другие плода мозги друг от плотины, если вы тестируете их для вестерн-блоттинга или ферментативного анализа.

NT "> Примечание: процедуры животное использует были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университет Толедо, которые в соответствии с руководящими принципами Институциональные уходу и использованию животных комитета в Национальном институте здравоохранения и руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

3. Вложение плода мозги в желатин для секционирования

1. Подготовка 10% желатина класса А.
2. Заполните отрывной от формы вложения наполовину и ждать, пока желатин затвердевает.
3. Управление Место и пренатальной рассматриваться фетального мозга бок-о-бок в верхней части затвердевшего желатина. Это позволит нам избежать постоянные условия иммунодетекции гибели клеток между двумя контрольной и экспериментальной групп.
4. Добавить жидкого желатина в верхней части плода мозг, чтобы сделать полную форму (убедитесь, что желатин не слишком жарко).
5. Охладите подготовленную форму желатин, который держит мозг плода в течение 15 мин.
6. Шелушитьсяпластиковые формы вложения, а затем передать готовые содержащие желатин мозг плода на 4% параформальдегидом в течение двух дней.
7. Место и профиль Фиксированная мозг плода в желатиновых использованием Vibratome секционирования машины (Leica VT 1000S) при 50 мкм толщины корональных срезов. Эта толщина испытан в наших исследованиях, поскольку он обеспечивает лучшую анатомических особенностей. Кроме того, толщина 25 мкм и более могут также быть проверены с помощью этого метода с участием встроенный фетального мозга в 10% желатина. Обратите внимание, что корональные срезы использованием Vibratome в базальных ганглиях уровне Высокопреосвященство на переднем мозге
8. Собирают срезы головного мозга плода в фосфатно-солевом буфере (PBS) в растворе.
9. Установите срезы головного мозга плода в Superfrost слайды Плюс в воде.
10. Высушите установлен разделов в течение 15 мин.
11. Поместите препараты (монтируется вместе с срезы головного мозга плода) в PBS в течение следующего дня тестирования реакции TUNEL.

4. TUNEL реакции Deзащиты гибели клеток или апоптоз

(TUNEL: ТДТ-опосредованной дУТФ Ник Конец маркировки; TdT: терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы). Этот тест предназначен для определения гибели клеток.

1. Лечение плода срезы головного мозга установлен в Superfrost Plus слайдов с протеиназы К (20 мкг / мл) в течение 5 мин при 37 ° С (300 мкл протеиназы К смешанным в 20 мл PBS). Слайды собраны в 5-Plend открытым Maile).
2. Промыть срезы головного мозга плода (монтируется на слайды) с PBS три раза в течение 5 минут под Орбитальный шейкер.
3. Инкубируют в секциях с 3% H ₂ O ₂ в метаноле в течение 10 мин при комнатной температуре (3 мл 30% H ₂ O ₂ в 27 мл 100% метанола) (слайдов не должно быть в шейкер).
4. Промыть участки с PBS три раза в течение 5 мин в орбитальном шейкере.
5. Инкубируйте разделы проницаемости раствора (0,1% Тритон Х-100 в 0,1% цитрата натрия) в течение 2 минут на льду (4oC) (100 мкл Тритон + 0,1 г цитрата натрия + 99,9 мл дистиллированнойг воды).
6. Промыть в разделах PBS в два раза в течение 5 мин в орбитальном шейкере.
7. Сухая зона вокруг разделов в слайдах.
8. Ничья барьер на Superfrost слайды плюс с помощью PAP Pen. Это делается с целью предотвратить любую утечку решение, которое используется для лечения секциях для обнаружения TUNEL-положительных клеток.
9. Инкубируют в секциях с TUNEL реакционной смеси (50 мкл из бутылки 1 и 450 мкл из бутылки 2) в течение 1 ч при 37 ° С, управление будет использоваться при инкубации в растворе из бутылки 2.
10. Промыть PBS три раза 5 мин в шейкере Orbit.
11. Сухая зона вокруг ткани.
12. Инкубируют в разделах с преобразователем-POD в течение 30 мин при 37 ° С.
13. Промыть секциях три раза в течение 5 мин с Трис-HCl (рН 7,5, 0,05 М).
14. Инкубируют в секциях в течение 7 минут в 0,05% 3'-3'-диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB) и 0,003% H ₂ O ₂ (25 мл Трис-HCl, рН 7,5, 0,05 М + 25 мкл 3% H ₂ 0 ₂ + +500 мкл DAB) Под Oribtal шейкере при 4 ° С (в лед) и темные (не забудьте сделать эту процедуру в новом 5-Plend открытые почтовые).
15. Промыть участки с PBS три раза по 5 мин Орбитальный шейкер.
16. Держите слайды разделов PBS в течение не более 24 часов в ФБР, затем обработать их для окрашивания Ниссля, как описано в следующем разделе протокола.

Примечание: DAB является канцерогеном. Используйте перчатки и очистить все блюда используется с отбеливателем закончив обработку всех экспериментах.

5. Ниссля окрашивания Подготовка срезы головного мозга плода для микроскопического наблюдения

1. Ниссля процедура окрашивания должно быть сделано в биологической капот безопасности.
2. Промыть слайдов секции с деионизированной водой в течение 2 мин.
3. Инкубируйте секций в 70% этаноле в течение 2 мин.
4. Инкубируйте секций в 95% этаноле в течение 6 мин.
5. Инкубируйте секций в 70% этаноле в течение 2 мин.
6. Промыть секциях в деионизированной ВатER в течение 2 мин.
7. Инкубируйте разделы Cresyl Фиолетовый Пятно в течение 3 мин.
8. Промыть секций в деионизированной воде в течение 2 мин.
9. Инкубируйте секций в 70% этаноле в течение 2 мин.
10. Инкубируют в секциях в 95% этаноле + 3 мл ледяной уксусной кислоты в течение 3 мин.
11. Инкубируйте секций в 95% этаноле в течение 2 мин.
12. Инкубируют в секциях в 100% этаноле в течение 2 мин три раза.
13. Инкубируйте секций в ксилоле в течение 10 мин три раза.
14. Слайды проведения срезы головного мозга плода могут быть смонтированы командами Permount и крышка слайды скольжения стекла.
15. Оставьте слайды в течение ночи перед микроскопических наблюдений и анализов.
16. Микроскопическое исследование и микрофотографии может быть выполнена в соответствии вертикального микроскопа Leica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Экспериментальные методы, описанные здесь, показывают, что 2-час разведение окна необходимо оценить точный гестационный стадии. Мы продемонстрировали рассечение эмбриона в возрасте E13. Мы также продемонстрировали микродиссекции плода мозги E13. Процедура включает несколько стадий (пер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методологии и технологии, представленные в этом исследовании продемонстрировать влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода и роль трофических пептидов в предотвращение этих последствий. Они могут предоставить информацию о том, как изучать другие наркотики или других ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Slides	VWR	48311-703
PAP PEN	Research Products Int. Corp.	195506
5-Plend Open Mailer	Heathrow Scientific, LLC	HS 15983G
Peel away embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70182
In situ cell death detection kit, POD	Roche Diagnostics, Inc	11684817910
Hanks' Balanced Salt Solution	Invitrogen	14170-120
Gelatin Type A	FisherScientific	G8-500
Stereomicroscope	W. NUHSBAUM, Inc	Leica M60, KL 200 LED
Micro-Vibratome	Leica, Inc	Leica VT 1000S
Moria Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40	2 pairs
Graduate 30 ml feeding tubes	Dyets, Inc	900012
Vitamin Mix	Bio-Serv. Inc.	F8031
Mineral Mix	Bio-Serv. Inc.	F8598
Maltose Dextrin	Bio-Serv. Inc.	3650
Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons	111000190-SS05	Pharmco-AAPER
Upright microscope	W. NUHSBAUM, Inc	LEICA DM 4000