Métodos experimentais para testar os efeitos de Peptide Neurotrophic, ADNF-9, contra a apoptose induzida pelo álcool durante a gravidez em camundongos C57BL / 6

Resumo

O delineamento experimental proposto aqui se concentrar em estudar os efeitos da exposição ao álcool na apoptose e da aplicação de peptídeo neurotrófico durante a gravidez no cérebro fetal. Uma descrição detalhada da criação para a coleção de cérebros fetais é descrito. As técnicas para a determinação da apoptose são também descritos em detalhe.

Resumo

Projetos experimentais para investigar os efeitos da exposição pré-natal álcool durante a fase embrionária precoce em crescimento do cérebro fetal são desafiadoras. Isto é principalmente devido à dificuldade de microdissecção de cérebros fetais e de seccionamento para a determinação de células apoptóticas causadas por exposição pré-natal ao álcool. As experiências aqui descritas fornecem técnicas visualizadas a partir de ratinhos de melhoramento para a identificação de morte celular em tecido de cérebro fetal. Este estudo utilizou ratinhos C57BL / 6 como um modelo animal para o estudo da exposição do álcool fetal e o papel do péptido trófico contra a apoptose induzida por álcool. A criação consiste em uma janela de esteiras de 2 horas para determinar a fase exata da idade embrionária. Um modelo de exposição do álcool fetal estabelecida foi usado neste estudo para determinar os efeitos da exposição pré-natal de álcool nos cérebros fetais. Trata-se de livre acesso ao álcool ou par-alimentados com dietas líquidas como a única fonte de nutrientes para as ratas grávidas.

Para a análise da apoptose, os cérebros fetais são incorporados em primeiro lugar gelatina usando um molde da casca-de distância para facilitar o seu seccionamento com um aparelho de vibratome. Cérebros fetais embutidos e fixados em paraformaldeído são facilmente seccionado, e as secções de flutuação livre pode ser montado em Superfrost mais lâminas para a determinação da apoptose ou morte celular.

TUNEL (TdT Nick-End dUTP mediado Rotulagem; TdT: desoxinucleotidil-transferase terminal) ensaio tem sido utilizado para identificar a morte celular ou apoptose. Vale ressaltar que apoptosis e citotoxicidade mediada por células, são caracterizadas por fragmentação do DNA. Assim, as células positivas TUNEL visualizadas são indicativas de morte celular ou apoptose.

Os modelos experimentais aqui fornecem informações sobre a utilização de uma dieta líquida estabelecido para o estudo dos efeitos do álcool e o papel dos péptidos neurotróficos durante a gravidez em cérebros fetais. Trata-se de reprodução e alimentação ratas grávidas, microdissecting cérebro do feto e determinar apoptose. Juntas, estas técnicas visuais e textuais podem ser uma fonte para investigar a exposição pré-natal de agentes nocivos nos cérebros fetais.

Introdução

O objetivo dos métodos experimentais descritas aqui é avaliar os efeitos neuroprotetores de peptídeos tróficos em um modelo de exposição fetal ao álcool através de várias técnicas que envolvem a criação, alimentação, microdissecting, e detectar a morte celular. Trabalhar em nosso laboratório tem envolvido uma dieta líquida misturada com o álcool como um modelo de beber álcool moderada, o que pode ser semelhante a um paradigma de beber humano em termos de a quantidade de álcool consumido ^1-5. Nós e outros autores identificaram três derivados peptídicos que são neuroprotectores contra os efeitos deletérios da exposição alcoólica fetal. Estudos que investigaram a exposição ao álcool durante os estágios embrionários utilizando modelos animais podem levar à identificação de potenciais mecanismos de neuroprotecção e permitir o desenvolvimento de procedimentos de intervenção. Isto pode fornecer uma ampla informação sobre os efeitos neuroprotectores e de atenuação dos efeitos deletérios da exposição do álcool durante a gravidez.

Possível prevenção dos efeitos do álcool exposição pré-natal pode envolver o tratamento de ratinhas grávidas com péptidos que foram mostrados para ser envolvido na neuroprotecção in vitro e in vivo ^{6,7 1,2,4,8,9.} Entre estes péptidos, SALLRSIPA, conhecido como ADNF ou SAL-9, é derivado da actividade dependente de factor neurotrófico (ADNF) ^7,10. Outro peptídeo com o NAPVSIPQ peptídeo seqüência, denominado NAP, derivado de proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP) ^6,11, demonstraram um efeito protetor potente contra o estresse oxidativo associado com a exposição ao álcool ^12,13. Além disso, foram recentemente identificados um péptido sintetizado de novo, colivelin que parece desempenhar um papel fundamental neuroprotector no modelo de exposição fetal ao álcool ^2. Colivelin é composto de ADNF-9 e AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). A importância da utilização destes péptidos é que eles têm a capacidade deatravessam a barreira cérebro-sangue para evitar os efeitos de apoptose induzida por álcool e défices cerebrais de crescimento.

Os métodos experimentais usados ​​camundongos C57BL / 6 para testar os efeitos neuroprotetores contra a apoptose induzida pelo álcool. Adoptámos uma janela em vez de reprodutores durante a noite 2 h de modo a determinar com precisão o dia embrionário 0 (E0), como pode ser revelado através da detecção de uma vela de esperma e esfregaço vaginal ^1-5. Nós usamos uma dieta líquida com tubos de alimentação, já que este é considerado o livre acesso, em vez de entrega do álcool por via sonda gástrica, o que pode induzir estresse para ratas grávidas. Por outro lado, microdissection pode ser desafiador devido à suavidade do tecido cerebral fetal, o que pode ser encontrado ao dissecar o cérebro do feto em estágios embrionários iniciais. Aqui, vamos mostrar técnicas visualizadas para lidar com todos os desafios que envolvem microdissection. Além disso, uma vez que a secção do cérebro fetal também pode ser um desafio, adotamosuma técnica que envolve a incorporação do cérebro fetal em gelatina usando peel-away incorporação de moldes. Temos sido bem sucedidos em cortar o cérebro do feto em seções flutuantes livres a 50 m de espessura. Isto permite-nos investigar as alterações de concentração de proteína em secções de cérebro fetal, incluindo a identificação de morte celular.

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Protocolo

1. Animais reprodutores e Trófico Tratamento Peptide

1. Raça C57BL/mice colocando os ratinhos fêmeas (~ 6 semanas de idade, peso médio de 20 g) em gaiolas macho durante 2 horas.
2. Verifique se há uma ficha de espermatozóides e / ou esfregaço vaginal imediatamente depois.
3. Se positivo, designar este ponto de tempo como dia embrionário 0 (E0).
4. Em E7, peso do jogo fêmeas grávidas para grupos controlo e de tratamento (3 grupos) são designados como descrito recentemente ^4: 1) O álcool (etanol) do grupo de dieta líquida (ALC), 2) a par-alimentados grupo de controlo (PF), 3) grupo de tratamento com Peptídeo, que deve receber a injecção intraperitoneal (ip) de ADNF-9 péptido juntamente com álcool de dieta líquida de exposição (ALC/ADNF-9). Os detalhes da preparação da ALC e PF dietas eo procedimento de injeções IP pode ser encontrado em nosso recente trabalho ^4.
5. Medir dieta líquida álcool diariamente, que pode ser fornecido como o acesso livre como a única fonte de nutrientes. Dieta líquida PF jugo individualmente to uma barragem ALC pode ser medido diariamente também.
6. O volume de dieta líquida consumida durante o 24 hr anterior pode ser gravado a partir de 30 ml graduada tubos de tampa de rosca e dieta preparada na hora deve ser prestado diariamente a partir E7 a E13.

2. Dissecção dos fetos e microdissecção dos cérebros fetais

1. Sacrifício ratas grávidas no E13 por profundamente eutanásia os ratos com um processo de CO _2, seguido de um deslocamento cervical.
2. Limpar o local da incisão abdominal com etanol a 70%.
3. Faça uma incisão abdominal usando tesouras e pinças esterilizadas.
4. Quando o abdómen é aberto, dissecar o útero, mantendo-a com uma pinça e usando os outros pinça de rasgar mesometrial longe do útero. Certifique-se de tal procedimento, lentamente, a fim de evitar a perfuração dos embriões.
5. Remover os embriões do útero e transferi-los para um prato de cultura de células (60 mm x 15 mm), contendo solução salina equilibrada de Hanks ' (HBSS) em água gelada.
6. Dissecar cérebros fetais a partir dos embriões inteiros sob microscópio estereoscópico para microdissection.
7. Usando fórceps ultra-finas por microdissecção, retirar a pele dos embriões na parte superior da cabeça para expor o crânio.
8. Uma vez que o crânio está exposto e claramente visualizados sob o microscópio estereoscópico microdissection, em seguida, retire o crânio a partir da parte posterior do cérebro a medula espinhal e as áreas do tronco cerebral.
9. Não se esqueça de retirar a peça do crânio por parte de posterior para partes anteriores da cabeça.
10. Uma vez que o cérebro do feto são visualmente exposto, prossiga com a extraí-los.
11. Dissecar os cérebros fetais a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo.
12. Postfix tudo dissecado cérebros fetais em paraformaldeído a 4% por 2-3 dias. Você também pode congelar outros cérebros fetais de cada barragem, se você estiver testando-os para Western blot ou ensaios enzimáticos.

nt "> Nota: Os procedimentos para uso de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Toledo, que estão de acordo com as diretrizes da Institutional Animal Care e do Comitê Use no National Institutes of Health e do Guia para a Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

3. Incorporação Brains fetal em gelatina para Seccionamento

1. Prepare a 10% de gelatina de grau A.
2. Preencha um molde peel-away incorporação até a metade e esperar até que os solidifica de gelatina.
3. Controle local e pré-natal tratado fetal cérebros side-by-side em cima da gelatina solidificada. Isso é para manter condições consistentes de imunodetecção de morte celular entre ambos os grupos controle e experimental.
4. Adicionar gelatina líquida no topo dos cérebros fetais para fazer um molde completo (certificar-se que a gelatina não é muito quente).
5. Refrigerar o molde de gelatina preparada que mantém o cérebro fetal por 15 min.
6. Peel offo molde plástico de incorporação e, em seguida, transferir os pré-fabricados de gelatina contendo cérebros fetais em paraformaldeído 4% por dois dias.
7. Local e seção fixa cérebros fetais em gelatina usando vibratome máquina de corte (Leica VT 1000S) a 50 m de espessura para seccionamento coronal. Essa espessura é testado em nossos estudos, pois oferece melhores características anatômicas. Além disso, a espessura de 25 um e maiores também podem ser testados com esta técnica envolvendo incorporado de cérebros fetais em 10% de gelatina. Note-se que cortes coronais foram cortadas usando vibratome no nível eminência gânglios basais no cérebro anterior
8. Recolha as seções do cérebro fetal em-tampão fosfato (PBS).
9. Montar as seções do cérebro fetal em Superfrost lâminas Plus em água.
10. Secam-se as secções montadas durante 15 min.
11. Coloque os slides (montada com as seções do cérebro do feto) em PBS para o próximo dia de testes de reação de TUNEL.

4. Reação de TUNEL Deproteção de morte celular ou apoptose

(TUNEL: TdT mediada dUTP Nick End Labeling; TdT: Terminal deoxynucleotidyl transferase). Este ensaio é destinado a determinar a morte celular.

1. Tratar secções de cérebro fetal montados em Superfrost Além disso as lâminas com Proteinase K (20 ug / ml) durante 5 min a 37 ° C (300 ul de proteinase K, misturado em 20 ml de PBS). As lâminas são montadas em 5 Plend aberto maile).
2. Enxágüe seções do cérebro fetal (montado em slides) com PBS três vezes por 5 min em agitador orbital.
3. Incubar as secções com 3% _de H ₂ O ₂ em metanol durante 10 minutos à temperatura ambiente (3 ml de 30% _de H ₂ O ₂ em 27 ml de metanol a 100%) (lâminas não deve ser num agitador).
4. Enxaguar secções com PBS três vezes durante 5 min em agitador orbital.
5. Incubar as secções em solução de permeabilização (0,1% TritonX-100 em citrato de sódio a 0,1%) durante 2 minutos em gelo (4 ° C) (100 ul tritonX + 0,1 g de citrato de sódio + 99,9 ml Distilled água).
6. Enxaguar secções em PBS duas vezes durante 5 min em agitador orbital.
7. Área seca em torno de seções nos slides.
8. Desenhe barreira em lâminas Superfrost Plus com PAP Pen. Este destina-se a evitar qualquer vazamento de solução que é usada para tratar as secções para a detecção de células positivas TUNEL.
9. Incubar as secções com mistura de reacção de TUNEL (50 ul do frasco 1 e 450 ul do frasco 2) durante 1 hora a 37 ° C, o controlo irá ser utilizada por incubação em solução de garrafa 2.
10. Lavar com PBS três vezes 5 min sob Orbit shaker.
11. Área seca ao redor dos tecidos.
12. Incubar as secções com conversor-POD durante 30 min a 37 ° C.
13. Lavar as secções três vezes durante 5 min em Tris-HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Incubar as secções durante 7 minutos em 0,05% tetracloridrato 3'-3'-diaminobenzidina (DAB) e 0,003% _de H ₂ O ₂ (25 mL de Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 ul de 3% _de H ₂ 0 ₂ + 500 DAB mL) Sob Oribtal shaker a 4 ° C (em gelo) e no escuro (certifique-se de fazer este procedimento em novo 5 Plend aberto mailer).
15. Lavar as seções com PBS três vezes 5 min em agitador orbital.
16. Mantenha as seções de slides em PBS por mais de 24 horas em PBS, em seguida, processá-los para a coloração de Nissl, conforme detalhado na próxima seção de protocolo.

Nota: DAB é uma substância cancerígena. Use luvas e limpar todos os pratos usados ​​com a água sanitária, uma vez terminado com todos os experimentos.

5. Nissl para Preparação de Fetais seções do cérebro para observação microscópica

1. Procedimento de coloração de Nissl deve ser feito em uma capa de segurança biológica.
2. Lavar as secções de deslizamento com água desionizada durante 2 minutos.
3. Incubar as seções em etanol 70% por 2 min.
4. Incubar as secções em etanol a 95% durante 6 min.
5. Incubar as seções em etanol 70% por 2 min.
6. Lavar as seções deionizada water por 2 min.
7. Incubar as seções Violet Cresyl Mancha para a 3 min.
8. Lavar as seções em água deionizada por 2 min.
9. Incubar as seções em etanol 70% por 2 min.
10. Incubar as secções em etanol a 95% + 3 ml de ácido acético glacial durante 3 min.
11. Incubar as secções em etanol a 95% durante 2 min.
12. Incubar as secções em etanol a 100% durante 2 minutos, três vezes.
13. Incubar as seções em xileno por 10 minutos três vezes.
14. Slides segurando as seções do cérebro fetal pode ser montado usando Permount e cobertura de lâminas de vidro de deslizamento.
15. Deixe o montado desliza durante a noite antes de observação microscópica e análises.
16. A observação microscópica e fotomicrografias pode ser realizada sob microscópio Leica vertical.

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Resultados

Os métodos experimentais aqui descritos mostram que a janela de criação de 2 horas é essencial para estimar a fase gestacional precisa. Demonstrámos a dissecação de embriões com a idade de E13. Também demonstramos microdissection de cérebros fetais no E13. O procedimento envolve diversas fases (de corrente alternada), como descrito na Figura 1. Cérebros fetais são dissecados a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo (Figura 1). Cérebros fetais s...

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Discussão

A metodologia e tecnologia apresentada neste estudo demonstram os efeitos da exposição pré-natal ao álcool em cérebros fetais e o papel dos péptidos tróficos na prevenção destes efeitos. Estes podem fornecer informações sobre como estudar outras drogas de abuso ou outros produtos químicos tóxicos no cérebro do feto durante as diferentes fases da gravidez.

No que diz respeito ao paradigma de reprodução, em alguns casos, a detecção do bujão de esperma não pode ser observado...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Slides	VWR	48311-703
PAP PEN	Research Products Int. Corp.	195506
5-Plend Open Mailer	Heathrow Scientific, LLC	HS 15983G
Peel away embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70182
In situ cell death detection kit, POD	Roche Diagnostics, Inc	11684817910
Hanks' Balanced Salt Solution	Invitrogen	14170-120
Gelatin Type A	FisherScientific	G8-500
Stereomicroscope	W. NUHSBAUM, Inc	Leica M60, KL 200 LED
Micro-Vibratome	Leica, Inc	Leica VT 1000S
Moria Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40	2 pairs
Graduate 30 ml feeding tubes	Dyets, Inc	900012
Vitamin Mix	Bio-Serv. Inc.	F8031
Mineral Mix	Bio-Serv. Inc.	F8598
Maltose Dextrin	Bio-Serv. Inc.	3650
Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons	111000190-SS05	Pharmco-AAPER
Upright microscope	W. NUHSBAUM, Inc	LEICA DM 4000