השיטה למדידה למבוגרים זיכרון אסוציאטיבי דרוזופילה מתוארת. Assay מבוסס על היכולת של הזבוב לשייך ריח מוצג עם (שוק חשמלי) חיזוק שלילי ולאחר מכן לאחזר את המידע הזה במועד מאוחר יותר, ומאפשר זיכרון כדי להימדד.
תסיסנית כבר בשימוש בניסויי התניה קלסיים במשך 40 שנה, ובכך להקל באופן משמעותי את ההבנה של זיכרון שלנו, ובכלל זה הבהרת המנגנונים המולקולריים המעורבים במחלות קוגניטיביות 1-7. למידה וזיכרון יכולים להיות מאושר בזחלים כדי לחקור את ההשפעה של גני התפתחותיות 8-10 ובזבובים כדי למדוד את התרומה של גני פלסטיות בוגרים 1-7. יתר על כן, תוחלת החיים הקצרה של דרוזופילה מאפשרת הניתוח של גני תיווך פגיעה בזיכרון הקשורה לגיל 5,11-13. הזמינות של הרבה יזמים מושרה המחלקים את מערכת העצבים דרוזופילה מאפשרת לקבוע מתי והיכן גן של העניין נדרש לזיכרון רגיל, כמו גם ממסר של היבטים שונים של אות חיזוק 3,4,14,16.
זיכרון לומד בדרוזופילה מבוגרת מאפשר ניתוח מפורט שלהתנהגות ומעגלים המעורבים ומדידה של זיכרון לטווח ארוך 15 -17. אורכו של שלב הבוגר להכיל מניפולציות גנטיות, התנהגותי, תזונתיות ותרופתיות ארוך טווח של זיכרון, בנוסף לקביעת ההשפעה של הזדקנות ומחלות ניווניות של מערכת עצבים על זיכרון 3-6,11-13,15-21.
התניה קלסית היא מושרה על ידי ההצגה בו זמנית של אות ניטראלית ריח (גירוי מותנה, CS +) וגירוי חיזוק, למשל., הלם או סוכרוז חשמלי, (גירוי הבלתי מותנה, ארה"ב), שהפכו קשורה אחד עם השני על ידי בעלי החיים 1,16. גירוי שני מותנה (CS -) מוצג לאחר מכן ללא ארה"ב. במהלך שלב הבדיקות, דרוזופילה מוצגות בו זמנית עם CS + וריחות CS-. לאחר דרוזופילה מסופקות זמן לבחור בין הריחות, ההפצה של בעלי החיים נרשמת. אל הליך זהשפל אסוציאטיבי אוויר מרתיע או תיאבון למדידה באופן מהימן ללא הטיה הוצגה על ידי ההעדפה המולדת לכל אחד מהגירויים מותנים. ניסויי בקרה שונים מבוצעים גם כדי לבדוק אם כל גנוטיפים להגיב באופן רגיל לריח וחיזוק לבד.
השיטה המוצגת כאן היא שתוארה על ידי טולי וקווין עם כמה שינויים קטנים 1. הניסוי מתבצע בשני שלבים: הזבובים מאומנים בשלב הראשון, והזבובים המאומנים נבדקים בשלב השני. במהלך אימון, קבוצה של זבובים במקביל נחשפו לריח 1 (CS +) והלם חשמלי (ארה"ב) בצינור אימונים. הזבובים אז יקבלו ריח 2 (CS -) ללא הלם חשמלי. זיווג יחיד זה של ריח מסוים עם הלם נקרא אימון 1 מחזור, והריחות ההנפוצים ביותר בשימוש הם 4-methylcyclohexanol (MCH) ו3-octanol (אוקטובר).
אימון אחד במחזור מוביל להיווצרותו של שלב יציב של זיכרון שניתן לאתרם לתקופה של עד 7 שעות; עם זאת, הזיכרון נבדק בדרך כלל באופן מיידי על מנת לקבוע מה הוא כינה למידה, רכישה או 2 זיכרון דקות. הזיכרון נמדד ב30 דקות או שעה 1 נקרא זיכרון לטווח קצר, ואילו3 זיכרון hr נקרא זיכרון לטווח בינוני. החשיפה של זבובים למחזורי אימונים חוזרים ונשנים עם פערים בין מחזורי אימון (אימון במרווחים) מובילה לצורה מאוחדת של זיכרון לטווח הארוך שהיא שעתוק CREB תלוי ונמשך עד שבוע. הדרכה ללא פערים (אימון התגודד) מובילה להיווצרות של זיכרון הרדמה עמידה (ARM), אשר בדומה לזיכרון לטווח ארוך, נמדד 24 שעות בדרך כלל לאחר 5 מחזורים של אימונים 7,13,15-17,20,21.
עם גישה זו, ההשפעה של מוטציות גנטיות שונות בשלבים שונים אלה של זיכרון ניתן לקבוע. הביטוי מונע האמרגן של transgenes הבהיר או רגישה לטמפרטורה כדי להפעיל או לחסום את הפעילות העצבית של תאי עצב מסוימים מאפשר לחקור שנוירונים הנדרשים לרכישת זיכרון, איחוד ואחזור 3,4,11,15,16,20, 22-24. זיכרון בשעה 1 נמדד בדרך כלל כאשר לומדים פגיעה בזיכרון הקשורה לגיל, כי f זוORM של זיכרון מופיע פגיע במיוחד להשפעות של הזדקנות 11-13. מגוון רחב של בקרות התנהגותיים וגנטיות מבוצעים עם ניסויי זיכרון, למשל, כדי לקבוע אם פגם ביצועים הוא בגלל פגם זיכרון מרכזי או פגם חושי היקפי המונע את הזבוב מחישת ההלם או קיו חוש הריח 5 -7, 1 7, 25,26.
1 טוס הכנה
.2 הכנה לפני הניסוי
3 דילולי ריח
.4 ההדרכה Protocol (איורים 1 ו -2)
.5 חישוב מדד ביצועים: מדידה של הזיכרון "הזבובים
.6 בקרה הסנסורית
מדד הביצועים (PI) משמש כמדד של זיכרון. טבלה 1 מציגה חישוב נציג של PI.
MCH יחד עם הלם | 3 באוקטובר יחד עם הלם |
זבובי הימנעות MCH (בצינור OCT) = 80 זבובים מעדיפים MCH (בצינור MCH) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0.6 | זבובי הימנעות אוקטובר (בצינור MCH) = 75 זבובים מעדיפים אוקטובר (בצינור OCT) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0.5 |
PI של הניסוי = (0,6 + 0,5) /2=0.55 |
טבלת 1 חישוב נציג של מדד ביצועים תוך שימוש בנתונים להמחשה. מדדי ביצועים עבור ניסויים שונים ניתן להשוות להבהיר תופעות זיכרון. ברגע כזההשוואה מוצגת באיור 3, המכיל את התוצאות מסדרת הניסויים שבוצעה עם זבובי קנטון S מבוגרים wildtype (WT) וטמבל לומדים מבוגרים זבובים מוטנטיים 1. הממוצע של 10 חוקרים פרטיים מסופק, עם ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של ממוצע (SEM). תוצאות אלו מראות כי זבובים טמבלים להראות ירידה בלמידה בהשוואה לwildtype.
איור 1 ניסיוני הגדרה למבוגרים. הזבובים מאומנים ונבדקו במבוך T. האימון כרוך בהצגת ריח עם הלם חשמלי ואחריו ריח B שני ללא הלם חשמלי. לאחר תקופת מנוחה בתא האמצעי הזבובים מוצגים עם שני הריחות בו זמנית. הזבובים לכודיםבשני צינורות ונאספו ונספר להשיג ציוני למידה / זיכרון.
איור 2 פרוטוקול הכשרת המבוגרים. הזבובים מתאמנים בשני שלבים. הצעד הראשון שבו זבובים יקבלו ריח (CS +) יחד עם ההתחשמלות (ארה"ב) ל60 שניות. בשלב הבא זבובים יקבלו ריח שני (CS-) ללא הלם חשמלי. אז זבובים מותר לנוח 90 שניות לאחר שהם נבדקים על הבחירה שלהם בין CS + וCS-.
איור 3 גרף נציג מראה טמבל ולמידת wildtype בדרוזופילה מבוגרת. WT וזבובים טמבלים נבדקו הבאים פגישה אחת של אימון. זבובים טמבלים להראות ירידה בלמידה בהשוואה לWT (n = 10).
Assay למידת המבוגרים תסיסנית הלם חוש הריח המוצג כאן מאפשר ניתוח של המנגנונים המולקולריים שבבסיס שלבים שונים של זיכרון, כוללים זיכרון לטווח ארוך 15-17. כמו גם קביעת ההשפעה של מקצבי היממה 18, שינה 19, דיאטה 20,21, הזדקנות 11-13, מחלה ניוונית של מערכת עצבים 5 וטיפולים תרופתיים 5,6,19 על זיכרון.
גישות רבות עוצמה פותחו לאחרונה להדמיה התפקודית של המעגלים העצביים שמתווכים זיכרון חוש הריח בזבובי 3,4,7,11,16,27. טכניקות optogenetic אלה משתמשים ברפרטואר העצום של היזמים השונים הזמינים בדרוזופילה 14,16. יזמים אלה משמשים כדי להביע את כתבי סידן וcAMP מקודד גנטי בתאי עצב זיכרון 16,27 כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות גנטיות ספציפיות על עקבות זיכרון.
השימוש בדואר של יזמים ומוטציות מותנים במבוגרים מאפשר הלימוד של התפקיד לאחר ההתפתחותי של מוצר גן בזיכרון 3,4,6,7,13,14. הדמיה וגישות התנהגותיות יכולים להיות משולבות עם ערוצי אור ומופעל חום כדי לעורר או לדכא תאי עצב שונים במעגל הזיכרון 11,14,16,22-24 להבהיר את תפקידם נוסף. יתר על כן, תאי עצב זיכרון גוף פטרייה נגישים לכל תא הקלטות מהדק תיקון 28, וטכניקות מתמטיות וחישובית נמצא בשימוש למודל זיכרון חוש הריח דרוזופילה 29.
התקדמות ניסוי אלה, בשילוב עם הצורות השונות של פרוטוקולי זיכרון אסוציאטיביים הציגו כאן, לאפשר דרוזופילה ללשמש מודל המולקולרי ורמת מעגל השינויים בזיכרון אסוציאטיבי המתרחשים בתגובה ללתגמל, עונש, מוטיבציה, התמכרות, הזדקנות ומחלות 5,6,11-13,16,30-31.
יש המחברים אין לחשוף.
אנו מכירים במרכזי מניית Bloomington עבור זן הזבוב. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מBBSRC (BB / G008973 / 1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | Source | Cat. No. | |
3-Octanol | Sigma | 218405 | |
4-Methyl cyclohexanol | Sigma | 15,309-5 | |
Benzaldehyde | Sigma | 418099 | |
Mineral Oil | Fluka | BP2629-1 | |
Hexyl acetate | Sigma | 108154 | |
Fructose | Sigma | F0127 | |
Agarose | Bioline | BIO-41025 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved