ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

要約

ショウジョウバエ成虫連想メモリを測定する方法について説明する。アッセイは、負の強化（電気ショック）を提示した後、メモリを測定することができるように、後でこの情報を呼び出し臭気を関連付けるハエの能力に基づいている。

要約

ショウジョウバエは、このように大幅に認知疾患^1-7に関与する分子メカニズムの解明を含め、メモリの理解を容易にする、40年以上にわたり、古典的条件付け実験に使用されている。学習と記憶は、大人可塑性遺伝子^1-7の寄与を測定するために、神経発達遺伝子^8-10とハエにおけるの効果を研究するために幼虫でアッセイすることができる。さらに、 ショウジョウバエの短い寿命は加齢に伴う記憶障害^5,11-13を仲介する遺伝子の解析が容易になる。 ショウジョウバエ神経系を細分多くの誘導性プロモーターの利用可能性は、いつ、どこで、目的の遺伝子は、通常のメモリと同様に強化信号^3,4,14,16の異なる側面の中継に必要とされるかを決定することを可能にする。

大人のショウジョウバエでメモリを学ぶことの詳細な分析が可能に行動と関連する回路および長期記憶^{15 -17}の測定。成虫段階の長さは、メモリ^{3-6,11-13,15-21}上の加齢および神経変性疾患の効果を決定することに加えて、メモリの長期的、遺伝的、行動、食事および薬理学的操作に対応しています。

古典的条件付けは、動物によって相互に関連付けられているようになるの中性臭気キュー（条件刺激、CS ^+）の同時提示と強化刺激、 例えば 、感電、ショ糖、（無条件刺激、US）によって誘導される^1,16。第二条件刺激（CSが^{- ）、}その後、米国なしで提示されている。テストフェーズでは、 ショウジョウバエを同時にCS +とCS-臭いされています。 ショウジョウバエ臭気の間で選択するための時間を提供した後、動物の分布が記録される。この手順はアル安値は確実に条件刺激のいずれかのための生得的な好みによって導入された偏りなく測定することが、嫌悪や食欲調節を連想。各種制御実験はまた、全ての遺伝子型は、臭いや単独の強化に正常に応答するかどうかを試験するために行われる。

概要

ここで紹介する方法は、いくつかの小さな変更を¹とタリーとクインによって記載されているものである。ハエが第一段階で訓練されており、訓練を受けたハエは、第2段階でテストされています。実験は2段階で行われます。トレーニング中、ハエのグループが同時に臭気にさらされている1（CS ^+）とトレーニングチューブ内の電気ショック（US）。電気ショックなしで^-ハエはその後臭い2（CS）を受け取る。ショック特定の臭いのこの単一のペアリングが1サイクルトレーニングと呼ばれ、最も頻繁に使用される臭気は、4 - メチルシクロヘキサノール（MCH）および3 - オクタノール（OCT）である。

1サイクル訓練は、最大7時間を検出することができるメモリの不安定相の形成をもたらす;ただし、メモリは通常、学習、取得又は2分のメモリと呼ばれるものを決定するために、すぐにテストされています。 30分または1時間で測定されたメモリが、一方、短期記憶と呼ばれ3時間のメモリは、中期メモリと呼ばれる。トレーニングサイクル（間隔の訓練）との間のギャップを反復的な訓練サイクルハエの露出はCREB転写依存しており、週まで持続長期記憶の連結形につながる。ギャップのないトレーニング（密集訓練）は、典型的には、訓練^{7,13,15-17,20,21} 5サイクルの24時間後に測定される長期記憶と同様に、麻酔耐性記憶（ARM）の形成をもたらす。

このアプローチでは、メモリのこれらの異なる位相におけるさまざまな遺伝子の変異の効果を決定することができる。特定のニューロンの神経活動の活性化やブロックする軽または温度感受性遺伝子のプロモーター駆動発現は^、人は記憶獲得、統合と検索^{3,4,11,15,16,20}のために必要とされる神経細胞を調べることができます^22-24。このFので加齢に伴う記憶障害を研究する際に、1時間でのメモリーは、一般的に測定され、メモリのORMは^11-13高齢化の影響を特に受けが表示されます。行動的および遺伝的コントロールの完全な範囲は^、性能不良が原因で中央メモリ欠陥やショックや嗅覚キュー^5-7を感知するハエを防ぎ、末梢感覚欠陥であるかどうかを決定するために、例えば、メモリの実験を用いて行われる^{1〜7、25,26。}

プロトコル

1。フライの準備

1. 遺伝的背景²⁶をコントロールするために行動実験の前に少なくとも6つの世代のために、全ての変異体、GAL4 / UASなどCSw-などの野生株と他の行を、異系交配。
2. 具体的な操作が異なる温度を必要としない限り、25℃で12時12分時間の明暗サイクル下で標準的なコーンミール、酵母および糖蜜食品食のハエを育てる。
   1. 開発を通じたGal4 GAL80 ^TS（ターゲットシステム）に導入遺伝子の発現を防止した後、1〜2日間の行動実験の前に30℃のインキュベーターにハエを移動するために使用し、18℃：導入遺伝子発現の効果を判定すること。導入遺伝子発現^3,4,6,7,14の効果を決定するために、30℃で実験を行う。
   2. 神経細胞を刺激するために、熱活性化TRPA1チャネルを用いた実験の場合：既知の温度である23℃、でハエを上げる非アクティブなチャネルを維持し、その後発現ニューロン、TRPA1を活性化するために、30℃で行動室に移行する。
   3. 18℃でリアハエし、30℃でテストを実施：シナプス出力^{11、14,24を}ブロックする^敏感 Shibire ^温度を用いて実験のため。
3. 1〜2日後、実験前にハエを集め、光、CO ₂麻酔下で、約25のグループでそれらを数える。 （具体的な操作が異なる温度を必要とした場合を除く）、25℃で（酵母なしで）食品用バイアル中にハエ少なくともO / Nを格納し、午前12時12時間の明を持つ環境的に制御された部屋の中で70％の相対湿度：暗い時まで実験の。
   注：このストレージは、ハエがショウジョウバエの学習のための最適な条件を持っていた環境制御されたクリーンルームで行うその後の学習テストに順応することを可能にし、重要なのは、どんな毎日ENVIを削除します行動的表現型に影響した可能性があり境バリエーション。

実験前2。準備

1. カスタムメイドのパースペックスT-迷路における実験（ 図1）を実行します。
2. 定期的に気密シールが実験中に得られることを保証するために、管継手をご確認ください。必要であれば、T-迷路の内側コンパートメントをシール、Oリングを変更してください。
3. トレーニングチューブの内側にカスタムメイドの銅グリッドを配置します。確認し、定期的にこれらのグリッドをきれいにし、酸化された場合には交換してください。電気刺激装置に接続されたスイッチボックスに実行するワニ口クリップを介して、配線に銅グリッドを取り付けます。装置が必要なショックを配信していることを保証するために電圧計を使用してください。
4. どんな空気漏れを避けるために、しっかりと迷路を保持するために、G-クランプを使用してください。
5. 匂いがハエを越え引かれ、その後、T-迷路から削除されるように、空気ポンプを結ぶ配管に、T-迷路を取り付けます。穏やかな空気を維持〜2リットル/分で流し

3臭気希釈液

1. ハエは両方の臭いに対して等しい優先性を示すことがこのような濃度で二つの異なる匂いを使用してください。鉱物油^7,13で希釈した：（100 1）4 -メチルシクロヘキサノール（1:67）、および3-オクタノールを使用してください。
   注：慎重に研究室によって異なりますこれらの濃度を決定する。例えば他の人は、両方の匂い²⁴ 1:10を使用しています。他の一般的に使用される悪臭を酢酸エチルおよびイソ - アミルアセテートが挙げられる。
2. ピペットこうして臭気プルームにハエを暴露、空気がカップに臭い上に描画することを可能にする有孔上部とプラスチックチューブで覆われた臭気ブロックに入り、カスタムメイドの匂いカップに希釈された臭気を30μl。

4訓練プロトコル（図1および2）

1. 大人の嗅覚衝撃コンディショニングのために、暗赤色灯の下ですべての実験（ すなわち 、赤色LED）、研究者は見ることができます実行しますが、FLを防ぐこのように視覚的な入力とは対照的に、ハエは嗅覚に集中することができ、見てからのy。
2. トレーニングチューブにハエを導入してから、T-迷路にアタッチし、それらを90秒間チューブと空気の流れに適応することができます。
3. 60秒の合計持続時間（3.75秒パルス間間隔で12 1.25秒のパルスからなる）60-Vのショックで最初の匂い（4 - メチルシクロヘキ、MCH）を提示。
4. 匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。
5. ショックのない60秒間二臭（3 - オクタノール、OCT）を提示。
6. 匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。
7. その側にT-迷路を回し、ゆっくりとそのような古いマウスマットなどの柔らかい物の上のT-迷路の底部を強打することにより、T-迷路の中央チャンバー内にトレーニング室からハエを移動します。 90秒間中央室にハエを維持します。
8. BOへの選択肢チューブを取り付け装置のttomは、T-迷路を形成する。
9. 学習を測定するために、それらは同時に匂いに暴露し、1に向かって移動し、T-迷路、選択ポイントにハエを移動します。 120秒間の試験期間を実施する。
10. それによって選択肢管の端部を遮断する中央チャンバを上にスライドさせてトラップの選択管内でハエ。食品バイアルに、T-迷路の各アームと中央コンパートメント内のハエを収集し、カウントされます。
11. 、メモリを測定する訓練（4.6）の後にハエを収集し、酵母なしで食料バイアルに、T-迷路からそれらを転送するには。ストア（導入を参照）、25℃で暗く、興味のあるメモリ位相を決定するのに必要な残りの時間、70％の湿度に飛ぶ。ステージ4.7のように、T-迷路にハエを再導入。
12. 長期記憶のために、ハエのいくつかのバッチを同時に訓練することができるカスタム構築された迷路を使用しています。 15分間のサイクル間隔（スパと訓練の5サイクルの管理CED）またはインターサイクル間隔なしで（密集）。試験まで、暗所で18℃、ハエおよび70％の湿度を維持します。試験の前に、25℃にハエを移動し、それらが少なくとも1時間順応することができます。訓練の後、長期記憶の24時間を評価する。
13. 行動実験の後、お湯と洗剤で無臭臭いカップを清掃してください。乾燥後、10μlのシグマコートでコートカップを。電子レンジで加熱することにより、シグマコートを乾燥させる。時折お湯と洗剤で無臭のT-迷路パースペックス管や臭気ブロックを清掃してください。

性能指数の5。計算：ハエ '記憶の測定

1. マイナスハエ（CSの総数で割った衝撃対に匂い（CS ^+）を選択するハエの数^-ショックペア匂い（CS）を回避ハエの数などの条件ごとに性能指数（PI）を計算する^- + CS ^+）1。
   ペーrformance指数（PI）=（＃CS ^-ハエ- ＃CS ^+が飛ぶ）/（＃合計ハエ）
2. MCHはショックペア臭いと10月には衝撃ペア臭いだったものであった実験のPIを平均化することによって、実験の最終PIを計算します。これは、1つの臭いのために、より高い優先順位を持つハエのいずれかのバイアスを除去。

6。感覚コントロール

1. T-迷路^6,7,17 ​​へ〜40-50ハエを導入することにより、臭気視力を実行します。
2. 90秒後に、選択点にハエを移動し、純粋な匂いと空気のどちらかを選択する彼らに2分を可能にします。
3. ハエを収集し、カウントされます。試験に参加したものによって臭気を選んだハエの合計数を割ることによって回避率を計算します。
4. ショック反応性^6,7,17 ​​の場合、ショックチャンバーにハエを導入。
5. 残りの90秒後に、ハエが同様に逃げることができる、そこから60-V D​​C電気ショックを、管理するショックのないチューブ。
6. ハエが選択するための2分を許可する。ハエを収集し、カウントされます。実験でのハエの総数で衝撃波管をエスケープすることで衝撃を避けハエの数を割ることによって衝撃回避率を計算します。電気ショックを免れたものを合計で中央室に残ってハエを含めます。

結果

性能指数（PI）は、メモリの尺度として役立つ。表1は、PIの代表計算を示す。

MCHは、ショックと対になって	3-OCTは、ショックと対になって
（OCTチューブ中）MCHを避けたハエ= 80 MCH（MCH管内で）= 20を好むハエ PI 1 - （80-20）/ 80 + 20） = 0.6	（MCH管内の）10月= 75を避けハエ （10月管内の）10月= 25を好むハエ PI 2 =（75-25）/（75 + 25） = 0.5
実験=（0.6 + 0.5）のPI /2=0.55

表1の例示的なデータを使用して、性能指数の代表的な計算。異なる実験のための性能指数は、メモリ効果を解明するために比較することができる。そのような一度比較はカントンS野生型成虫ハエ（WT）および劣等生 ^1ハエ変異体、大人の学習で行った一連の実験からの結果が含まれています。図3に示されている。 10 PIの平均値を平均値の標準誤差（SEM）を表すエラーバーを、備えている。これらの結果は、 劣等生のハエは、野生型と比較して、学習の減少を示すことを実証している。

図1：大人の実験設定。ハエが訓練とT迷路で試験する。訓練は、電気ショックのない第二臭気Bに続いて電気ショックで臭気Aを提示することを含む。中間室での休息期間の後ハエは同時に臭いの両方が表示されます。ハエは捕獲される2管に採取し、学習/記憶のスコアを取得するためにカウントされ、。

大人のトレーニングプロトコル。図。ハエは、二段階で訓練されています。ハエは臭い（CS +）を​​受け取る最初のステップは、60秒間の電気ショック（US）と対をなす。次のステップでは、ハエが感電することなく第二の匂い（CS-）を受け取る。ハエは、その後彼らは、CS +とCS-の間に彼らの選択のためにテストされた後、90秒間休ませている。

図3 ショウジョウバエ成虫に劣等生および野生型学習を示す代表的なグラフ。 WT及び劣等生ハエは、トレーニングの一つのセッション、次 ​​の試験を行った。 劣等生のハエは、WT（N = 10）と比較して学習の減少を示す。

ディスカッション

ここに提示ショウジョウバエ成体嗅覚ショック学習アッセイは、長期メモリ^15〜17を含むメモリの異なる位相を、根底にある分子メカニズムの分析を可能にする。同様に概日リズム¹⁸の効果の決定など、メモリ上に^19、ダイエット^20,21、老化^11-13、神経変性疾患⁵と薬物治療^5,6,19眠る 。

多くの強力なアプローチは、最近、ハエ^{3,4,7,11,16,27}に嗅覚記憶を仲介する神経回路の機能イメージングのために開発されている。これらの光遺伝学的技術は、ショウジョウバエ ^14,16で利用可能な異なるプロモーターの膨大なレパートリーを使用しています。これらのプロモーターは、メモリ·トレース上の特定の遺伝子変異の影響を研究するために、メモリニューロン^16,27に遺伝的にコードされたカルシウムおよびcAMPレポーターを発現するために使用される。

目成人では、条件付きプロモーターおよび変異のEの使用はメモリ^{3,4,6,7,13,14}における遺伝子産物のポスト発達役割の研究を可能にする。イメージングと行動のアプローチは、さらにその機能を解明するために、メモリ回路^{11,14,16,22-24}の異なるニューロンを刺激するかまたは阻害するために光-及び熱活性化チャネルと組み合わせることができます。また、キノコ体メモリニューロンは、 ショウジョウバエ嗅覚メモリ^29をモデル化するために使用されている全細胞パッチクランプ記録^28、および数学的計算技術にアクセス可能である。

ここで紹介する連想メモリ·プロトコルの異なる形と組み合わせるこれらの実験の進歩は、老化や病気、 ショウジョウバエは 、罰、モチベーション、中毒に報いるために応答して発生連想メモリ内molecular-と回路レベルの変化をモデル化するために使用できるようにする^{5,6,11-13,16,30-31。}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials	Source	Cat. No.
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15,309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral Oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025