Drosophile adulte olfactive apprentissage choc

Résumé

La méthode de mesure de la drosophile adulte mémoire associative est décrite. L'essai est basé sur la capacité de la mouche à associer une odeur présenté avec un renforcement négatif (choc électrique) et ensuite rappeler cette information à un moment ultérieur, ce qui permet à la mémoire mesurée.

Résumé

Drosophile ont été utilisés dans des expériences de conditionnement classiques pour plus de 40 ans, ce qui facilite grandement notre compréhension de la mémoire, y compris l'élucidation des mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies cognitives ^1-7. L'apprentissage et la mémoire peuvent être analysés dans les larves d'étudier l'effet des gènes du développement neurologique ^8-10 et en vol de mesurer la contribution des gènes de plasticité adultes ^1-7. En outre, la courte durée de vie de la drosophile facilite l'analyse de gènes médiant la mémoire liée à l'âge déficience ^5,11-13. La disponibilité de nombreux promoteurs inductibles qui subdivisent le système nerveux Drosophila permet de déterminer quand et où un gène d'intérêt est nécessaire pour la mémoire normale ainsi que relais de différents aspects du signal de renforcement ^3,4,14,16.

Mémoire Étudier au drosophile adulte permet une analyse détaillée de lale comportement et les circuits impliqués et une mesure de la mémoire à long terme ^{15 -17.} La longueur du stade adulte reçoit les manipulations génétiques, comportementaux, alimentaires et pharmacologiques à long terme de la mémoire, en plus de la détermination de l'effet du vieillissement et des maladies neurodégénératives de mémoire ^{3-6,11-13,15-21.}

Le conditionnement classique est induite par la présentation simultanée d'une information neutre d'odeur (stimulus conditionné, CS ⁺⁾ et un stimulus de renforcement, par exemple., Un choc électrique ou saccharose, (stimulus inconditionnel, États-Unis), que d'être associées les unes aux autres par l'animal ^1,16. Un stimulus deuxième conditionné (CS ^-) est ensuite présenté sans les Etats-Unis. Pendant la phase de test, la drosophile sont simultanément présenté avec CS + et CS-odeurs. Après le temps de Drosophila sont prévus pour choisir entre les odeurs, la distribution des animaux est enregistrée. Cette procédure albas associatives déconditionnement ou d'appétence pour être évaluée de façon fiable sans un biais introduit par la préférence innée pour l'une des stimuli conditionnés. Plusieurs expériences témoins sont également réalisées pour tester si les génotypes répondent normalement à l'odeur et au renforcement seul.

Introduction

La méthode présentée ici est celle décrite par Tully et Quinn avec quelques petites modifications ^1. L'expérience est réalisée en deux phases: les mouches sont formés dans la première phase, et les mouches formés sont testés dans la deuxième phase. Pendant la formation, un groupe de mouches sont simultanément exposés à l'odeur 1 (CS ⁺⁾ et un choc électrique (États-Unis) dans un tube de formation. Les mouches reçoivent alors l'odeur 2 (CS ^-) sans un choc électrique. Cette association unique d'une odeur particulière avec un choc est appelé formation 1 cycle, et les odeurs qui sont les plus fréquemment utilisés sont 4 méthylcyclohexanol (SMI) et 3-octanol (OCT).

Une formation de cycle conduit à la formation d'une phase labile de mémoire qui peut être détecté jusqu'à 7 h; Toutefois, la mémoire est généralement testé immédiatement pour déterminer ce que l'on appelle l'apprentissage, l'acquisition ou la mémoire de 2 min. Mémoire mesurée à 30 min ou 1 h est appelée mémoire à court terme, alors que3 h mémoire est appelée mémoire à mi-parcours. L'exposition des mouches à des cycles de formation répétitives avec des écarts entre les cycles de formation (formation à distance) conduit à une forme consolidée de la mémoire à long terme qui est la transcription CREB dépendante et dure jusqu'à une semaine. Entraînement sans lacunes (formation massée) conduit à la formation de la mémoire d'anesthésie-résistant (ARM), qui semblable à la mémoire à long terme, est généralement mesurée 24 h après 5 cycles de formation ^{7,13,15-17,20,21.}

Avec cette approche, l'effet de différentes mutations du gène de ces différentes phases de la mémoire peut être déterminée. L'expression de promoteur mécanique de transgènes légers ou sensibles à la température d'activer ou de bloquer l'activité neuronale de neurones spécifiques permet d'enquêter sur les neurones sont nécessaires pour l'acquisition de la mémoire, la consolidation et la récupération ^{3,4,11,15,16,20, 22-24.} Mémoire à 1 h est généralement mesurée en étudiant la perte de mémoire liée à l'âge, car ce form de mémoire apparaît particulièrement vulnérables aux effets du vieillissement ^11-13. Une gamme complète de contrôles comportementaux et génétiques sont réalisées avec des expériences de mémoire, par exemple, pour déterminer si un défaut de performance est en raison d'un défaut de mémoire centrale ou un déficit sensoriel périphérique qui empêche la mouche de sentir le choc ou repère olfactif ^{5 -7, 1 7, 25,26.}

Protocole

1. Fly Préparation

1. Se croiser tous les mutants, Gal4 / UAS et d'autres lignes avec une souche de type sauvage, comme CSw-, pendant au moins six générations avant les expériences de comportement pour contrôler les antécédents génétiques ^26.
2. Cultiver des mouches sur un régime standard de semoule de maïs, la levure et mélasse alimentaire sous un cycle lumière-obscurité de 12h12 h à 25 ° C, sauf manipulations spécifiques nécessitent une température différente.
   1. Pour déterminer les effets de l'expression du transgène: utilisation de 18 ° C pour empêcher l'expression de transgènes dans (le système Target) ^de Gal4 GAL80 par le développement et ensuite passer les mouches à un incubateur à 30 ° 1-2 jours avant l'expérience comportementale. Conduite de l'expérience à 30 ° C pour déterminer les effets de l'expression du transgène ^3,4,6,7,14.
   2. Pour les expériences utilisant des canaux de TRPA1 activés par la chaleur pour stimuler les neurones: Augmenter les mouches à 23 ° C, ce qui est une température connuede maintenir un canal inactif, puis passer à une salle de comportement à 30 ° C pour activer le TRPA1 neurones exprimant.
   3. Pour les expériences à l'aide de ^{la température} Shibire ^sensible à bloquer la sortie synaptique ^{11, 14,24:} arrière vol à 18 ° C et effectuer des tests à 30 ° C.
3. Recueillir les mouches 1-2 jours avant l'expérience et les compter par groupes d'environ 25 sous CO lumière ₂ anesthésie. Conserver les mouches au moins O / N dans des flacons de produits alimentaires (sans levure) à 25 ° C (à moins que des manipulations spécifiques nécessaires à une température différente) et l'humidité 70% par rapport à une chambre à environnement contrôlé de lumière 12:12 h: l'obscurité jusqu'à ce que le temps de l'expérience.
   Remarque: Ce stockage permet aux mouches de s'acclimater à l'épreuve de l'apprentissage ultérieur effectué dans la chambre à environnement contrôlé, qui avait les conditions d'apprentissage optimales drosophile et, surtout, supprime toute envi quotidienvariations environ- qui auraient pu influer sur le phénotype comportemental.

2 Préparation avant l'expérience

1. Réaliser les expériences dans un labyrinthe en T plexiglas sur mesure (Figure 1).
2. Vérifiez régulièrement le montage et assure que l'étanchéité à l'air est obtenu lors de l'expérience tube. Si nécessaire, changer les joints toriques qui scellent les compartiments à l'intérieur du labyrinthe en T.
3. Placer des grilles de cuivre sur mesure à l'intérieur des tubes d'entraînement. Vérifiez et nettoyez régulièrement ces grilles, et les remplacer si oxydé. Fixez les grilles de cuivre à fils par des pinces crocodiles qui fonctionnent à une boîte de commutateur connecté à un stimulateur électrique. Utilisez un voltmètre pour faire en sorte que l'appareil délivre le choc nécessaire.
4. Utilisation de G-pinces pour tenir le labyrinthe étroitement pour éviter toute fuite d'air.
5. Attacher le labyrinthe en T à un tube qui s'étend à une pompe à air, pour permettre aux odeurs à tirer pour les mouches et ensuite retirés du labyrinthe en T. Maintenir l'air doux~ s'écouler à 2 L / min

3. Odeur dilutions

1. Utilisez deux odeurs différentes à des concentrations telles que les mouches montrent une préférence égale pour les deux odeurs. Utilisez 4 méthylcyclohexanol (1:67) et 3-octanol (1: 100) diluée dans une huile minérale ^7,13.
   Remarque: déterminer soigneusement ces concentrations qui varient par le laboratoire. Par exemple, d'autres utilisent 1h10 pour les odeurs ^24. D'autres odeurs couramment utilisés comprennent l'acétate d'éthyle et l'acétate d'iso-amyle.
2. Introduire à la pipette 30 ul de l'odeur dilué dans une odeur tasse-mesure placé dans un bloc d'odeur couvert par un tube en matière plastique avec un dessus perforé qui permet à l'air d'être aspiré au-dessus de l'odeur dans la coupe, exposant ainsi les mouches à un panache d'odeur.

4 Protocole de formation (figures 1 et 2)

1. Pour adultes olfactif choc conditionné, effectuer toutes les expériences sous une faible lumière rouge (c'est à dire, LED rouge.), Ce qui permet au chercheur de voir mais empêche la fly de voir, ce qui permet aux mouches de se concentrer sur l'olfaction, par opposition à des éléments visuels.
2. Présentez-vol dans le tube de la formation, puis fixez le labyrinthe en T et leur permettre de s'adapter au tube et le débit d'air pendant 90 secondes.
3. Présenter la première odeur (4 méthylcyclohexanol, MCH) avec un choc de 60 V (composé de douze impulsions 1,25 sec avec des intervalles inter-impulsions de 3,75 s) pour une durée totale de 60 secondes.
4. Suivez le choc avec une période de repos de 30 secondes sans une odeur ou un choc.
5. Présenter le deuxième odeur (3-octanol, OCT) pendant 60 secondes sans un choc.
6. Suivez le choc avec une période de repos de 30 secondes sans une odeur ou un choc.
7. Déplacez les mouches de la chambre de formation dans la chambre centrale du labyrinthe en T en tournant le labyrinthe en T sur le côté et doucement frapper le fond du labyrinthe en T sur une surface molle, comme un tapis de souris vieux. Maintenir les mouches dans la chambre centrale pendant 90 secondes.
8. Monter les tubes de choix dans la boTTOM de l'appareil pour former le labyrinthe en T.
9. Pour mesurer l'apprentissage, déplacer vol à la pointe de la T-labyrinthe, où ils ont été exposés simultanément à deux odeurs choix et d'aller vers un. Procéder à une période d'essai pendant 120 secondes.
10. Piège les mouches dans les tubes de choix en faisant glisser la chambre centrale jusqu'à bloquant ainsi les extrémités des tubes de choix. Recueillir les mouches dans chaque bras du labyrinthe en T et dans le compartiment central dans des fioles de comptage et alimentaires.
11. Pour mesurer la mémoire, de recueillir les mouches après la formation (4.6) et les transférer dans le labyrinthe en T dans des flacons de produits alimentaires sans levure. Magasin vole dans l'obscurité à 25 ° C et 70% d'humidité pendant le temps nécessaire restant à déterminer la phase de la mémoire de l'intérêt (voir introduction). Réintroduire les mouches au labyrinthe en T comme à l'étape 4.7.
12. Pour la mémoire à long terme, utiliser un labyrinthe construit sur mesure qui permet à plusieurs lots de mouches à être formés simultanément. Administrer 5 cycles de formation de 15 minutes entre le cycle intervalle (spaced) ou sans intervalle entre les cycles (massé). Maintenir les mouches à 18 ° C et 70% d'humidité dans l'obscurité jusqu'à ce que les tests. Avant les essais, déplacer les mouches à 25 ° C et leur permettre de s'acclimater pendant au moins 1 h. Évaluer la mémoire à long terme de 24 heures après la formation.
13. Après les expériences comportementales, nettoyer les tasses odeur avec de l'eau chaude et du détergent inodore. Après séchage, enduire les tasses avec 10 ul Sigmacote. Sécher le Sigmacote par chauffage dans un four à micro-ondes. Nettoyez de temps à la T-labyrinthe tubes de plexiglas et des blocs d'odeur avec de l'eau chaude et du détergent inodore.

5 Calcul de l'indice de performance: une mesure de la mémoire de mouches

1. Calculer l'indice de performance (PI) pour chaque condition que le nombre de mouches éviter l'odeur de choc appariées (CS ^-) moins le nombre de mouches qui choisissent l'odeur de choc appariées (CS ⁺⁾ divisé par le nombre total de mouches (CS ^- + CS ^{+) 1.}
   Peindice de rfo rm a n (PI) = (# CS ^- vole - # CS ⁺ vole) / (# mouches totales)
2. Calculer la PI final de l'expérience en faisant la moyenne de la PI de l'expérience dans laquelle MCH était l'odeur de choc appariées et dans lequel une octobre était l'odeur de choc appariées. Cela supprime toute partialité de vol ayant une plus grande préférence pour une odeur.

6.Contrôle sensorimotrices

1. Effectuer odeur acuité en introduisant ~ 40-50 mouches dans le labyrinthe en T ^6,7,17.
2. Après 90 secondes, déplacer vol au point de choix, et leur permettre de 2 min à choisir entre les odeurs pures et de l'air.
3. Recueillir et compter les mouches. Calculer le pourcentage d'évitement en divisant le nombre total de mouches qui ont choisi l'odeur par ceux qui ont participé au test.
4. Pour le choc réactivité ^6,7,17, introduire les mouches dans la chambre de choc.
5. Après 90 secondes de repos, administrer un choc électrique de 60 V DC, à partir de laquelle les mouches peuvent échapper à une semblabletube sans un choc.
6. Laisser 2 min pour les mouches de choisir; recueillir et compter les mouches. Calculer le pourcentage choc d'évitement en divisant le nombre de mouches qui ont évité le choc en s'échappant du tube de choc par le nombre total de mouches dans l'expérience. Inclure les mouches qui restent dans la chambre centrale dans le total de ceux qui ont échappé à la décharge électrique.

Résultats

L'indice de performance (CP) sert de mesure de la mémoire. Le tableau 1 illustre un calcul représentant de PI.

MCH jumelé avec choc	3-OCT jumelé avec choc
Les mouches en évitant MCH (dans l'OCT tubes) = 80 Les mouches préférant MCH (MCH tubes) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6	Les mouches en évitant OCT (MCH tubes) = 75 Les mouches préférant OCT (dans l'OCT tubes) = 25 PI = 2 (75-25) / (75 + 25) = 0,5
PI de l'expérience = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tableau 1 A représentant de calcul de l'indice de performance à partir de données d'illustration. Indices de performance pour les différentes expériences peut être comparée à élucider les effets de mémoire. Une fois cettecomparaison est illustré à la figure 3, qui contient les résultats d'une série d'expériences effectuées avec le canton de S de type sauvage mouches adultes (WT) et cancre apprentissage adulte mutant vole ^1. La moyenne de 10 IP est fourni, avec des barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM). Ces résultats démontrent que les mouches âne montrent une réduction de l'apprentissage par rapport au type sauvage.

Figure 1: L'adulte expérimental. Les mouches sont formés et testés dans un labyrinthe en T. La formation consiste à présenter une odeur A avec un choc électrique suivie d'une seconde odeur B sans choc électrique. Après une période de repos dans la chambre du milieu les mouches sont présentés à la fois les odeurs simultanément. Les mouches sont piégésdans les deux tubes et recueilli et compté à obtenir des scores d'apprentissage / mémoire.

Figure 2: Le protocole de formation d'un adulte. Les mouches sont la formation en deux étapes. La première étape où les mouches reçoivent une odeur (CS +) associé à un choc électrique (États-Unis) pendant 60 secondes. Dans l'étape suivante mouches reçoivent une deuxième odeur (CS) sans choc électrique. Les mouches sont ensuite laissées au repos pendant 90 secondes, après quoi ils sont testés pour leur choix entre CS et CS +.

Figure 3 Un graphique représentatif montrant cancre et de l'apprentissage de type sauvage dans la drosophile adulte. WT et âne vol ont été testés suivant une session de formation. Cancre mouches montrent une réduction de l'apprentissage par rapport au WT (n = 10).

Discussion

La drosophile adulte choc olfactif test d'apprentissage présenté ici permet d'analyser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les différentes phases de la mémoire, y compris la mémoire à long terme ^15-17. En plus de la détermination de l'effet du rythme circadien du sommeil ^{18, 19, 20,21,} la sénescence alimentation ^11-13, les maladies neurodégénératives et ⁵ traitements médicamenteux ^5,6,19 sur la mémoire.

De nombreuses approches puissantes ont été récemment mis au point pour l'imagerie fonctionnelle des circuits neuronaux qui interviennent dans la mémoire olfactive chez les mouches ^{3,4,7,11,16,27.} Ces techniques utilisent optogénétiques le vaste répertoire des promoteurs différents disponibles chez la drosophile ^14,16. Ces promoteurs sont utilisés pour exprimer codés génétiquement calcium et l'AMPc journalistes dans les neurones de la mémoire ^16,27 pour étudier l'effet de mutations génétiques spécifiques sur les traces de la mémoire.

Thl'utilisation de l'e des promoteurs et des mutations conditionnelles chez les adultes permet l'étude du rôle post-développement d'un produit de gène dans la mémoire ^{3,4,6,7,13,14.} Imagerie et approches comportementales peuvent être combinés avec les canaux à la lumière et à la chaleur activé pour stimuler ou inhiber des neurones différents dans le circuit de mémoire ^{11,14,16,22-24} à élucider leur fonction. En outre, les neurones de la mémoire du corps de champignon sont accessibles aux cellules entières des enregistrements de patch-clamp ²⁸ et de techniques mathématiques et informatiques sont utilisés pour modéliser la mémoire olfactive chez la drosophile ^29.

Ces avancées expérimentales, combinées avec les différentes formes de protocoles de mémoire associative présentés ici, permettent la drosophile à être utilisé pour modéliser les molecular- et niveau circuit changements dans la mémoire associative qui se produisent en réponse à récompenser, la peine, la motivation, la toxicomanie, le vieillissement et la maladie ^{5,6,11-13,16,30-31.}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials	Source	Cat. No.
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15,309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral Oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025