מודלים עכבר לטרשת עורקים שתל

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים לarteriosclerois שוחדנו העכבר (GA) דגמים אשר כרוך חציצה של מגזר כלי עכבר לנמען של אותו הזן המולד. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, המודל יכול להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על GA.

Abstract

arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של כלי דם שתל העץ כולו. המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הוא ההתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה. כאשר קטע עורק הכלילי אנושי התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient, את intimas אפשר היה להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T האנושיים אלוגנאית לתורם העורק או אקסוגני אנושי IFN-γ בהיעדר תאי T אנושיים. התערבותם של אב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר היא מוגבלת כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת הדחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטלת לחלוטין את כל תורמים שמקורם בתאי הדם מהשתל בתוך שניים השלוש שבועות. לאחרונה פיתחנו שניים מ 'חדשouse דגמים לעקוף את הבעיות הללו. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). דחיית שתל במקרה זה מופנה רק נגד אנטיגנים histocompatibility קלים המקודדים על ידי כרומוזום Y (בהווה בזכר אך לא נקבה) ותגובת הדחייה שמתפתחת הוא עצל במידה מספקת כדי לשמר הנגזרות תורמות תאי שריר חלק למשך מספר שבועות. המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את הקולטן לIFN-γ ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של העכבר כבד עם וקטור adenoviral. אין דחייה במקרה זה כמו גם תורם ועכברי נמען הם מאותו הזן והמין, אך תאי שריר חלק תורם להתרבות בתגובה לציטוקינים ואילו מארח שמקורם בתאים, חסרי קולטן לציטוקין זה, לא מגיב. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, ניתן להשתמש בשני המודלים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על התקדמות GA. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לדגמי GA העכבר שלנו.

Introduction

arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של עץ כלי דם השתל כל ^7. בשלבים מוקדמים עלולים לגרום להיצרויות אקסצנטרית ומוקדים כי הם ברורים יותר בעורקים, ובכך דומה יותר מקרוב היצרויות ראתה בטרשת עורקת קונבנציונלית. אובדן לומן של התוצאות מהתרחבות כלי שתל intimal עקב חדירה של תאי T ומקרופגים מארחים ובמיוחד להצטברות של מטריקס ודמוי תאי שריר חלק שמקורו משתל, מארח או שניהם ^{5, 13, 19,} כי הוא יפוצה כראוי על ידי שיפוץ כלי החוצה. בallografts לב, הנגעים המשמעותיים ביותר מהבחינה קלינית הם אלה בעורקים הכליליים וepicardial intramyocardial. סופו של דבר, GA של העורקים הכליליים יגרום אי ספיקת לב איסכמית. GA הוא הגורם העיקרי לגר לב מאוחרהפסד מאחור. ביצרויות של GA לעצור בקווי התפר, חזק להפליל את תגובת המארח לalloantigens שתל בפתוגנזה שלה ומוביל אותנו לסווג GA כסוג של דחייה כרונית ^3. עם זאת, צורות אחרות של פגיעה בעורקים עלולות להגביר את הסיכון של GA, בין אם באמצעות הגדלת נטל הנקי של פציעה או על ידי העמקת ו / או ויסות תגובת alloimmune. התא רירית (EC) האנדותל של עורקי שתל נשמר בGA האנושי והאזורים השטחיים ביותר של אינטימה בסמוך לרירית EC הוא האתר הסתנן ביותר בכבדות על ידי מארח נגזר IFN-γ-ייצור תאי T ומקרופגים ^11; ב חלק מהחולים GA קשור עם ההתפתחות של alloantibodies תורם ספציפי אשר נקלטות על ידי EC שתל ¹⁶ אך הכלים להראות מעט עדויות של נמק fibrinoid שאופייני לדחיית נוגדן בתיווך ¹¹ חריפה.

המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הואהתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה, אם ניתן לעצור את התהליך הזה, GA סביר להתקדם. עבודות קודמת מהקבוצה שלנו הראו כי intimas של מגזרי עורקים הכליליים אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T אנושי אלוגניות לתורם העורק ושתהליך זה יכול להיות מעוכב על ידי נטרול האנושי IFN- γ ^18. IFN-γ האנושי יתר אקסוגני עלול לגרום intimal (והמדיאלי) תא שריר חלק (VSMC) ריבוי כלי דם בשתלים עורקיים אלה בהיעדר תאי T האנושי ^{15, 17.} (חשוב לציין כי אדם ועכבר IFN-γ לא חוצה מינים, פוסלי השפעות עקיפות על מארח העכבר במערכת הניסיונית הזה.) יש מודלים עכבריים אלו טובת משחזר תא T / אינטראקציות תא כלי דם אנושיים וintimal נגעים מורכבים במידה רבה של תאי אדם (כלומר שתל המופק),כפי שכבר ציין בדגימות קליניות, אבל הם לא לסכם את המצב הקליני באופן מלא משום שהם מתעלמים מתפקידו של מקרופאגים המארחים ואולי גם סוגי תאים אחרים מעורבים בנגעי השתלות קליניים. מודל עכבר רגיל של תהליך זה באופן תיאורטי יכול לטפל בבעיה זו, המשלימה את המגבלות של המודל האנושי על ידי מעורב מערכת חיסונית מארח שלמה ומתן יתרון נוסף המאפשר את כוחו של עכבר גנטי גישות שיחולו על GA. שני המודלים העכבר הנפוץ ביותר כרוכים בהשתלת לב ועורקי heterotopic orthotopic ¹ השתלה. הנגעים המתפתחים בעורקים של לב heterotopic שתלים עשויים במידה רבה של תאים מארחים, העשויים ממוצא מח עצם, ואילו תאי intimal של העורקים בלב אדם שתלי הם בעיקר ממוצא שתל ^{5, 13, 19.} זוהי הבחנה משמעותית שהובילה אותנו לפתח מודלים עכבר חלופיים. התערבותם שלאב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר הוא עוד יותר מוגבל כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת דחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטל לחלוטין את כל תאי כלי הדם תורם הנגזרים מאת השתל בתוך שניים השלוש שבועות ^19. כתוצאה מכך, השינויים שלאחר מכן ראו במגזר הכלי התערב הם אך ורק תגובה של תאי מארח שאכלסו מחדש את decellularized כלי הפיגום, יוצרת מצב artifactual ביותר של שייכות מוגבלת כמודל לשינויים בכלי שתל המתרחשים במרפאת. לאחרונה פיתחנו שני מודלים עכבר חדשים כדי לעקוף את הבעיות האלה ^21. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את receptor לIFN-γ (IFN-γR-KO) ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של כבד העכבר עם וקטור adenoviral. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים ואת היתרונות של דגמי GA העכבר שלנו.

Protocol

שתל עכבר ומודל השתלת שתל syngeneic

כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים וועדות שימוש באוניברסיטת ייל. עבור דגם שתל, קטעים של אב העורקים החזי מזכר, 4-5 הישן WT שבוע (C57BL/6J) או עכברי IFN-γR ק.ו. היו התערב לאב העורקים בבטן של נמען נשי, WT 8-12 השבוע הישן באמצעות קצה ל סוף טכניקת microsurgical anastomotic (ראה הבא לפרטים נוספים). עבור דגם שתל syngeneic, קטעים של aortae בית החזה מעכברי זכרים, 4-5 בשבוע ישן WT היו התערב לaortae הבטן של זכר, 8-12 בשבוע ישן IFN-γR1-KO באמצעות טכניקת anastomotic microsurgical מקצה לקצה. בשבוע שלאחר ניתוח 1, החיות היו מחוסנת IV עם Ad5.CMV עכבר IFN-γ או Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) בשעה 10 ⁹ PFU x 1. סרום עכבר IFN-γ הרמות נמדדו על ידי ELISA (eBioscience) בשעה 1 ו5 שבועות לאחר מתן אדנווירוס. חיות מסוימות קיבל BrdU(סיגמא אולדריץ ') ב 100 מ"ג / ק"ג SC עבור 2 שבועות לפני הקרבה.

מקצה לקצה טכניקת anastomotic microsurgical (וידאו יילקח לחלק זה):

1. נוהל תורם

1. הרדימי את העכברים התורמים עם זריקות intraperitoneal של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) וxylazine (10 מ"ג / ק"ג).
2. לאחר שווידאת הרדמה נאותה, הנח את העכברים התורמים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של X8-30 על מגש במצב שכיבה, ולהשתמש בפד Prep יוד והאלכוהול Prep פד להכנת קיר חזה.
3. לחתוך את קיר החזה הקדמי דרך הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את הלב.
4. לפתוח את העלייה הימנית, להזריק 10 מ"ל של heparinized (100 U / מ"ל) תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי כדי לשטוף את העכברים באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 25 מד.
5. לכרות את הלב וריאות על מנת לחשוף את כל אורכו של אב העורקים החזי.
6. לנתח את אב העורקים החזי בזהירות כדי למזער את הטראומה הישירה, whilהדואר לזהות, לקשור ולחלק את ענפי העץ באמצעות 11-0 תפר בסמוך לאב העורקים.
7. ברגע שהאב העורקים החזי הוא חופשי מרקמות, אב העורקים החזי כל הבלו להשתלה.
8. לשטוף את הקצוות של אב העורקים התורם עם תמיסת מלח heparinized (100 U / מ"ל), ולאחסן אותו באותו פתרון על קרח (HR עד 6) עד להשתלה.

2. נוהל נמען

1. הזרק את עכברי הנמען עם ketoprofen IP (5 מ"ג / ק"ג) לשיכוך כאבים, וthenanesthetize העכברים עם קטמין IP (50 מ"ג / ק"ג) וxylazine (10 מ"ג / ק"ג). את עכברי הנמען הם הרדמה עמוקה בתוך 10 דקות למשך תקופה של 60-90 דקות. במהלך ניתוח, ברמה של הרדמה נבחנת בכל 15 דקות על ידי צובט את קיר הבטן הקדמי או רגל באמצעות מלקחיים. אם בעל החיים מגיבים לגירויים המזיקים בכל עת במהלך ניתוח, מנה נוספת של קטמין ו xylazine (1/4 או מינון מקורי 1/3) תנוהל על ידי SC או im
2. לאחר שווידאת הרדמה נאותה, לגלח את הפרווה בדופן הבטן הקדמי באמצעות מכונת גילוח חשמלי, לנקות את העור באמצעות יוד Prep פד ופד Prep אלכוהול, לכסות את העיניים בשימוש במשחת עיניים. במהלך ניתוח, בטכניקות אספטיים הבאות תשמש לפעילות, כולל ניקוי שולחן ניתוחים עם 10% אקונומיקה, לובש כפפות סטריליות ושימוש במכשירי microsurgery מעוקרים (מכשירי קיטור מעוקרים לתחילת המבצע, זכוכית חמה אז חרוז מעוקר מכשירים בין פעולות מרובות, וכו ').
3. מניחים את עכברי הנמען תחת מיקרוסקופ בהגדלה של X8-30 על מגש במצב שכיבה.
4. לחתוך את דופן הבטן בקו האמצע מxyphoid לחיק, ולהפיץ את דופן הבטן בנפרד באמצעות מיקרו-מפשק כדי לחשוף את חלל הבטן.
5. לחזור בו את המעיים superiorly ולעטוף עם גזה טבולה בתמיסת מלח. את עכברי הנמען להיות מקוררים על ידי אובדן של חימוםלא דרך מעיים המוחצנים. זה חשוב כדי לשמור על חום של בעלי חיים. עם זאת, לוח החימום לא נעשה שימוש במהלך הניתוח כהיפותרמיה צנועה היא תועלת במניעת פגיעה בעמוד השדרה בעת החסימה של זרימת דם אב העורקים וכן יש העברת חום יעילה עם זרימת דם נעדר למחצית התחתונה של גוף העכברים.
6. להזיז את איברי הרבייה inferiorly, לעטוף את אזורי הבטן של עכברי נמען עם מי מלח-פתרון טבולה גזה, ולהשתמש בו כדי לחזור לפי הטבעת בצד ימין של הבטן. הרקמות החשופות מושקות מעת לעת עם תמיסת מלח במהלך ההשתלה.
7. לנתח בוטות קטע של אב העורקים infrarenal בין כלי כליות proximally והסתעפות אב העורקים distally ולהיפרד מנחות וריד נבובה (IVC) בזהירות.
8. לזהות ולקשור את כל הענפים הקטנים שמקורם בקטע זה של אב העורקים בבטן באמצעות 11-0 התפר monofilament פוליאמיד.
9. לחצות מהדק הקטע הבודד שלאב העורקים bdominal באמצעות שני חבקי כלי דם סמיכות 5 מ"מ זה מזה, אחד בכל קצה.
10. Transect אב העורקים בבטן בין מלחציים באמצעות מיקרו מספריים חדים כדי ליצור את אתרי anastomotic.
11. לכרות קטע קטן של אב העורקים בבטן (עד 0.4 מ"מ באורך) מקצה אחד של חתך אב העורקים נמען transected כדי להכיל את השתל של אב העורקים התורם.
12. לשטוף מגזרי אבי העורקים בין מלחציים באמצעות תמיסת מלח heparinized כדי להסיר את הדם שיורית. מגזרי אבי העורקים בין מלחציים ושתלו אב העורקים התורם מושקים מעת לעת עם פתרון heparinized (100 U / ml) מלוח (מ"ל / ק"ג עד 40) בזמן ההשקה.
13. Transect שני הצדדים של אב העורקים תורם עם מיקרו מספריים חדים כדי ליצור שתל קטע של 2.5 מ"מ באורך להשתלה.
14. מניחים את השתל של אב העורקים התורם בעמדת orthotopic, anastomose הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של שתל מתורם לסוף חתך פרוקסימלי ודיסטלי של הנמען של אב העורקים בבטן, בהתאמה, עם תום-Tדפוס O-end באמצעות 11-0 התפר monofilament פוליאמיד.
15. לתפרים הרציפים, למקם את התפרים להישאר ב3 ו09:00 עמדות ראשית. בין שני תפרים להישאר בכל צד של שתל, anastomose שני קצוות לחתוך בתפרים 3-4 תוך שימוש בתפרים בריצה, ולקשור את התפרים פועלים כדי להישאר עם תפרי קשר כפול. מאחר ששתי השכבות של סגירה הן רציפה, את הסיכון של בקיעה הוא גדל. השתל של אב העורקים התורם צריך להיות באורך המתאים כדי להתחבר סוף חתך פרוקסימלי ודיסטלי של הנמען של אב העורקים בבטן.
16. לתפרים, לבנות ארבע השקה ב 3 ו09:00 עמדות בשני הצדדים של שתל ראשית, וanastomose שני הקצוות לחתוך בתפרי 3-4 בין שני תפרים להישאר בכל צד של שתל.
17. שחרר את מהדק דיסטלי כדי לאפשר את הזרימה מדרדר לתוך שתל, לזהות את האתרים המדממים ולעשות תפרים נוספים תוך 3 דקות.
18. לאחר בירור hemostasis משביע רצון, לשחרר את המהדק הפרוקסימלי.
19. לאשר את patency השתל על ידי נוכחות של פעימה נמרצת בשתל ובמגזר הצמוד הפרוקסימלי של אב העורקים בבטן האם, בפרט במגזר הצמוד הדיסטלי של אב העורקים בבטן ועורק mesenteric נחות. שקול פקקת באתרי anastomotic אם הפעימה לצמצם תוך כמה לאחר השיקום של זרימת דם דקות.
20. להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
21. תפר לסגור את דופן הבטן באמצעות תפר ניילון 5-0 בשכבת שריר ושכבת עור, בהתאמה.
22. מניחים את עכברי הנמען לכלוב נקי בחלק העליון של כרית חימום, ולהמתין 1-2 שעות לעכברים להחזיר לעצמו את ההכרה ולהתאושש מהרדמה. זה חשוב כדי לשמור על חום מתאים בעלי החיים במהלך התאוששות. שמור על העכברים בכלוב החם ויבש לפני שבעקבות בעלי החיים מן ההרדמה.
23. להעריך את התפקוד המוטורי של גפיים אחוריות אחרי עכברי התאוששות, ושוב ביום השני. ניתוח השתלה מוצלחת יאושרF לא חוסר תפקוד של גפיים אחוריות נצפה בעכברי נמען ביום השני.
24. לנהל את עכברי נמען עם Ketoprofen במי שתייה (5 מ"ג / ק"ג / ד = 27 UG / מ"ל ​​במי שתייה) עבור 48 שעות. אם כל עכברי נמען סובלים מכאבים בלתי פוסקים במשככי כאבים לאחר הניתוח על ידי כפי שמעידים על ידי אובדן של ניידות, אי חתן, נורמלי התכווץ יציבה, וכו ', הם יהיו מורדמים. בעלי החיים יהיו בסופו של דבר מורדמים נקודות מוגדרות מראש לאחר 1-60 ימים.

ניתוח שתל

שתלי עורק בשתל שהשיגו ב 4 שבועות ושתלים במודל שתל syngeneic היו 6 שבועות לאחר הניתוח (5 שבועות לאחר זיהום ויראלי) ונותחו על ידי טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות עבור מכתים Elastica ואן Gieson (EVG), hematoxylin ו eosin (HE) מכתים ומכתים immunofluorescence. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ מערכת immunofluorescence (Zeiss). ספירת תאים של גרעינים מוקפות immunostaining החיובי הייתה לבצעאד בהגדלה גבוהה ועמדו בממוצע בין 5 חתכים לכל שתל. את המדידות באזור השתל של לומן (בתוך האנדותל), אינטימה (בין lamina אלסטי האנדותל והפנימי, IEL), התקשורת (בין IEL וlamina אלסטי החיצוני, צלופח), עובי קיר (בין lamina אלסטי האנדותל והחיצוני) וכל כלי (בתוך את הצלופח) חושבו מתוך 5 חתכים סדרתיים, 150 מיקרומטר בנפרד עבור כל שתל, תוך שימוש בניתוח תמונה ממוחשב וNIH תמונה 1.60 (http://rsbweb.nih.gov/nih-image).

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. שני זנב-, בדיקות t מזווגות וניתוח ANOVA דו כיוונית בוצעו באמצעות תוכנת פריזמה (תוכנת GraphPad). חילוקי דעות עם P <0.05 נחשבו למצביעות על מובהקות סטטיסטיות.

תוצאות

מודל טרשת עורקים שתל עכבר (GA): במודל זה, אב העורקים תורם גברי הושתלו נשי נמען, כך שהמארח גורם לתגובות alloimmune מתווכות תאי T alloreactive נגד האנטיגן Y קטין (HY אנטיגן histocompatibility קטין זכר הספציפי) הביע על ¹² שתל, והוא בתור תא T-IFN-γ מיוצר כונני VSMC התפשטות ²⁰ כפי שנצפ...

Discussion

הפרוטוקולים שתוארו מתמקדים בדגמי GA עכבר. ניתן ליישם את הנהלים לדגמי השתלת שתל אחרים. מודלים אלה כוללים xenograft האנושי (מקטעי עורקים הכליליים כלומר אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient), ודגם GA עכבר דחייה חריף (כלומר אב העורקים עכבר מזן גנטי אחד לנמען א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.