Les modèles de souris pour l'artériosclérose Graft

Résumé

Nous décrivons les protocoles de nos arteriosclerois de greffe de souris (GA) des modèles qui impliquent interposition d'un segment de vaisseau de la souris sur un receveur de la même souche consanguine. Par rétrocroisant changements génétiques dans le donneur de navire, le modèle permet d'évaluer l'effet de gènes spécifiques sur GA.

Résumé

Arteriosclerois greffés (GA), également appelés vasculopathie d'allogreffe, est une lésion pathologique qui se développe au fil des mois ou des années dans les organes transplantés caractérisées par diffus, une sténose circonférentielle de l'ensemble de l'arborescence vasculaire du greffon. L'élément le plus critique de GA pathogénie est la prolifération des cellules musculaires lisses, comme au sein de l'intima. Quand un segment d'artère coronaire humaine est intercalé dans la aorte sous-rénale de souris immunodéficientes, les intimas pourraient être développer en réponse à lymphocytes T humains par transfert adoptif allogénique pour le donateur de l'artère ou exogène humain IFN-γ en l'absence de cellules T humaines. Interposition d'une aorte de souris d'une souche dans un autre destinataire de la souche de souris est limitée comme un modèle pour le rejet chronique chez l'homme, car la réponse de rejet à médiation cellulaire aigu dans ce modèle de souris élimine complètement toutes les cellules vasculaires dérivées du donneur de la greffe dans les deux-trois semaines. Nous avons récemment développé deux nouveaux mOuse modèles de contourner ces problèmes. Le premier modèle comporte l'interposition d'un segment de vaisseau à partir d'une souris mâle dans une femelle receveuse de la même souche pure (C57BL/6J). Le rejet de greffe dans cette affaire est dirigée uniquement contre les antigènes mineurs d'histocompatibilité codées par le chromosome Y (présent chez l'homme, mais pas la femelle) et la réponse de rejet qui s'ensuit est assez indolent de préserver les cellules musculaires lisses dérivées du donneur pendant plusieurs semaines. Le deuxième modèle comprend l'interposition d'un segment d'artère d'un type C57BL/6J donneur de souris sauvage dans une souris hôte de la même souche et le sexe qui n'a pas le récepteur de l'IFN-γ, suivi par l'administration de souris IFN-γ (envoyé par l'infection de la souris foie avec un vecteur adénoviral. Il n'ya pas de rejet dans ce cas comme donneur et souris receveuses sont de la même souche et le sexe, mais les cellules musculaires lisses des donateurs prolifèrent en réponse à la cytokine tandis que les cellules dérivées de l'hôte, manquant de récepteurs pourcette cytokine, sont insensibles. Par rétrocroisant changements génétiques dans le donneur de navire, les deux modèles peuvent être utilisés pour évaluer l'effet de gènes spécifiques sur la progression GA. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour nos modèles GA de souris.

Introduction

Arteriosclerois greffés (GA), également appelés vasculopathie d'allogreffe, est une lésion pathologique qui se développe au fil des mois ou des années dans les organes transplantés caractérisées par diffus, une sténose circonférentielle de l'ensemble de l'arborescence vasculaire du greffon ^7. Les stades précoces peuvent provoquer des sténoses excentriques et focal qui sont plus évidentes dans les artères, ce qui ressemble davantage sténoses observées dans l'athérosclérose conventionnel. La perte de la lumière des vaisseaux greffés résulte de l'expansion intimale due à l'infiltration de cellules et les macrophages T hôte et en particulier à l'accumulation de matrice extracellulaire et le muscle lisse en forme de cellules provient de greffon, l'hôte ou les deux ^{5, 13, 19,} qui est insuffisamment compensée par le remodelage vasculaire vers l'extérieur. En allogreffes cardiaques, les lésions les plus cliniquement significatifs sont ceux dans les artères coronaires épicardiques et intramyocardique. En fin de compte, GA des artères coronaires provoquer une insuffisance cardiaque ischémique. GA est la principale cause de gr cardiaque tardperte arrière. Les sténoses de GA s'arrêtent pas aux lignes de suture, impliquant fortement la réponse de l'hôte à alloantigènes greffés dans sa pathogénie et qui nous conduit à classer GA comme une forme de rejet chronique ^3. Cependant, d'autres formes de lésions artérielles peuvent augmenter le risque de GA, soit par l'augmentation de la charge nette de blessure ou en intensifiant et / ou la modulation de la réponse allo-immune. La cellule (CE) paroi endothéliale des artères greffe est conservé dans GA humaine et les régions les plus superficielles de l'intima à côté de la doublure CE est le site le plus fortement infiltré par dérivée de l'hôte IFN-γ-production des cellules T et les macrophages ^11; dans certains patients GA est associé avec le développement de allo-anticorps donneur-spécifiques qui se lient au greffe CE ^16, mais les vaisseaux montrent peu de signes de la nécrose fibrinoid qui est caractéristique de rejet humoral aigu ^11.

L'élément le plus critique de GA pathogénie est l'la prolifération des cellules musculaires lisses, comme au sein de l'intima, si ce processus peut être arrêté, GA est peu probable pour progresser. Les travaux antérieurs de notre groupe avait montré que intimas des segments des artères coronaires humaines interposés dans la aorte sous-rénale de souris immunodéficientes développer en réponse à lymphocytes T humains par transfert adoptif allogéniques pour le donateur de l'artère et que ce processus pouvait être inhibée par la neutralisation humain IFN- γ ^18. En outre IFN-γ exogène humaine pourrait causer intimale (et médiane) des cellules musculaires lisses (CMLV) prolifération vasculaire dans ces greffons artériels en l'absence de lymphocytes T humains ^{15, 17.} (Il est important de noter que l'homme et la souris IFN-γ ne traversent pas les espèces, en excluant les effets indirects sur l'hôte de la souris dans ce système expérimental.) Ces modèles humanisés de souris ont l'avantage de récapituler les cellules T humaines / interactions cellulaires vasculaires et l'intima lésions sont largement composées de cellules humaines (c.-à-greffe dérivé),comme cela a été observé dans des échantillons cliniques, mais ils ne récapituler pas entièrement la situation clinique parce qu'ils ignorent le rôle des macrophages de l'hôte et éventuellement d'autres types cellulaires impliqués dans les lésions de transplantation clinique. Un modèle classique de la souris de ce processus pourrait théoriquement remédier à ce problème, en complément des limites du modèle humanisé en impliquant le système immunitaire de l'hôte complet et offrant l'avantage supplémentaire de permettre l'alimentation des approches génétiques de souris à appliquer à l'AG. Les deux modèles de souris plus largement utilisés impliquent la transplantation cardiaque hétérotopique et l'artère orthotopique transplantation ^1. Les lésions qui se développent dans les artères de greffes cardiaques hétérotopiques sont en grande partie constitués de cellules de l'hôte, probablement d'origine de la moelle osseuse, tandis que les cellules intima des artères dans les greffes cardiaques humaines sont en majorité d'origine du greffon ^{5, 13, 19.} Il s'agit d'une distinction importante qui a conduit à développer des modèles alternatifs de souris. Interposition d'une aorte de souris d'une souche à un autre destinataire de la souche de souris est encore plus limitée de modèle pour le rejet chronique chez l'homme parce que la réponse à médiation cellulaire de rejet aigu dans ce modèle de souris élimine complètement toutes les cellules vasculaires dérivées du donneur de la greffe à l'intérieur de deux, trois, ¹⁹ semaines. Par conséquent, les modifications ultérieures vu dans le segment de vaisseau interposé sont uniquement une réponse des cellules hôtes qui ont repeuplées le décellularisé navire échafaudage, créant une situation très artefact d'une pertinence limitée comme un modèle pour les changements dans les vaisseaux greffés qui se produisent dans la clinique. Nous avons récemment développé deux nouveaux modèles de souris pour contourner ces problèmes ^21. Le premier modèle comporte l'interposition d'un segment de vaisseau à partir d'une souris mâle dans une femelle receveuse de la même souche pure (C57BL/6J). Le deuxième modèle consiste à interposer un segment d'artère d'un type C57BL/6J donneur de souris sauvage dans une souris hôte de la même souche et le sexe qui n'a pas la receptor IFN-γ pour (IFN-yR-KO), suivie par l'administration d'IFN-γ souris (envoyé par infection du foie de souris avec un vecteur adénoviral. Ici, nous décrivons les protocoles détaillés et les avantages de nos modèles GA de souris.

Protocole

allogreffe de la souris et syngénéique modèle de transplantation de greffe

Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et comités de l'utilisation de l'Université de Yale. Pour le modèle d'allogreffe, les segments de l'aorte thoracique du mâle, semaine 4-5 ancien WT (C57BL/6J) ou souris IFN-yR-KO sont interposés dans l'aorte abdominale du récipiendaire féminine, 8-12 semaine WT aide d'un bout à la fin de microchirurgie technique d'anastomose (voir prochaine pour plus de détails). Pour le modèle de greffe syngénique, des segments de aorte thoracique de Male, 4-5 semaines vieilles souris WT ont été intercalés dans la aorte abdominale du mâle, 8-12 semaine IFN-γR1-KO en utilisant une technique de microchirurgie anastomose de bout en bout. Après 1 semaine après l'opération, les animaux ont été inoculés avec iv Ad5.CMV-souris IFN-γ ou Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) à 1 x 10 ⁹ PFU. Sérum de souris IFN-γ ont été mesurés par ELISA (eBioscience) à 1 et 5 semaines après l'administration de l'adénovirus. Certains animaux ont reçu BrdU(Sigma-Aldrich) à 100 mg / kg sc pendant 2 semaines avant le sacrifice.

End-to-end microchirurgie technique d'anastomose (vidéo sera prise pour cette partie):

1. Procédure de donateurs

1. Anesthésier les souris donneuses avec injection intrapéritonéale de kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
2. Après s'être assuré une anesthésie adéquate, placer les souris donneuses sous le microscope opératoire à X8-30 grossissement sur un plateau dans une position couchée, et utiliser un tampon à l'iode et un tampon à l'alcool pour la préparation de la paroi thoracique.
3. Inciser la paroi antérieure du thorax par les nervures et le diaphragme afin d'exposer le coeur.
4. Ouvrez l'oreillette droite, injecter 10 ml d'héparine (100 U / ml) solution saline dans le ventricule gauche pour chasser les souris en utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 25.
5. Réséquer le cœur et les poumons pour exposer toute la longueur de l'aorte thoracique.
6. Disséquer l'aorte thoracique soigneusement afin de minimiser le traumatisme direct, tout en recueillante identifier, ligaturer et diviser les branches de bois à l'aide de 11-0 suture près de l'aorte.
7. Une fois l'aorte thoracique est libre de tissu environnant, l'accise l'ensemble aorte thoracique pour une transplantation.
8. Rincer l'extrémité coupée de l'aorte du donneur avec une solution saline héparine (100 U / ml), et le ranger dans la même solution sur la glace (jusqu'à 6 heures) jusqu'à la transplantation.

2. Procédure de destinataire

1. Injecter les souris receveuses avec le kétoprofène ip (5 mg / kg) pour l'analgésie, et thenanesthetize les souris avec de la kétamine ip (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Les souris receveuses sont profondément anesthésiés dans les 10 minutes pour une durée de 60-90 minutes. Pendant l'opération, le niveau de l'anesthésie est évaluée toutes les 15 min en pinçant la paroi abdominale antérieure ou pied à l'aide de pinces. Si l'animal réagit aux stimuli nocifs à tout moment pendant l'intervention chirurgicale, une dose supplémentaire de kétamine et de xylazine (1/4 ou 1/3 de la dose initiale) sera administré par SC ou IM
2. Après s'être assuré une anesthésie adéquate, raser la fourrure dans la paroi abdominale antérieure avec un rasoir électrique, nettoyer la peau en utilisant Prep Pad d'iode et Pad Prep alcool, couvrir les yeux à l'aide pommade ophtalmique. Pendant la chirurgie, les techniques d'asepsie suivants seront utilisés pour les opérations, y compris le nettoyage de la table d'opération avec 10% de javel, le port de gants stériles et en utilisant des instruments de microchirurgie stérilisés (instruments stérilisés à la vapeur pour le début de l'opération, puis verre chaud perle stérilisé instruments entre plusieurs opérations, etc.)
3. Placez les souris receveuses sous le microscope opératoire à un grossissement de X8-30 sur un plateau dans une position couchée.
4. Inciser la paroi abdominale à partir de la ligne médiane à xiphoïde pubis, et la propagation de la paroi abdominale en dehors à l'aide d'un micro-enrouleur pour exposer la cavité abdominale.
5. Rentrez les intestins haut et envelopper avec de la gaze humidifiée avec une solution saline. Les souris receveuses se refroidir par la perte de HEAt par les intestins extériorisés. Il est important de maintenir la chaleur animale. Toutefois, le conseil de chauffage n'est pas utilisé pendant la chirurgie que l'hypothermie modérée est bénéfique dans la prévention des lésions de la moelle pendant l'occlusion du flux sanguin aortique ainsi que, il ya transfert de chaleur inefficace avec le flux sanguin absent dans la moitié inférieure du corps de la souris.
6. Déplacez les organes reproducteurs inferiorly, envelopper les domaines de l'abdomen de souris receveuses avec de la gaze de solution saline solution humidifié, et l'utiliser pour rentrer le rectum à droite de l'abdomen. Les tissus exposés sont irrigués régulièrement avec une solution saline lors de la transplantation.
7. Disséquer carrément un segment d'aorte entre le navire rénale proximale et distale bifurcation aortique et se séparer de la veine cave inférieure (VCI) soigneusement.
8. Identifier et ligaturer toutes les petites branches provenant de ce segment de l'aorte abdominale à l'aide 11-0 Polyamide monofilament suture.
9. Clampage du segment isolé d'unaorte bdominal l'aide de deux pinces vasculaires approximativement 5 mm d'intervalle, un à chaque extrémité.
10. Transect l'aorte abdominale entre les pinces à l'aide de micro-ciseaux pointus pour créer des sites anastomotiques.
11. Réséquer un petit segment de l'aorte abdominale (jusqu'à 0,4 mm de longueur) d'une extrémité de coupe de l'aorte sectionnée destinataire pour s'adapter à la prothèse aortique de donneur.
12. Rincer les segments aortiques entre les pinces en utilisant une solution saline héparinée pour enlever le sang résiduel. Les segments de l'aorte entre les pinces et le greffon aortique de donneur sont irrigués périodiquement (100 U / ml) solution saline héparine (jusqu'à 40 ml / kg) au cours de l'anastomose.
13. Sectionner les deux côtés de l'aorte du donneur avec des micro-ciseaux pointus afin de créer un greffon de segment de 2,5 mm de longueur pour la transplantation.
14. Placer la prothèse aortique de donneur en position orthotopique, anastomose extrémité proximale et distale du donneur de greffe à proximale et distale extrémité coupée du destinataire de l'aorte abdominale, respectivement, avec une fin-tmotif o-end en utilisant 11-0 Polyamide monofilament suture.
15. Pour les sutures continues, placer les sutures de séjour à 3 et 9 heures premièrement. Entre deux sutures de séjour de chaque côté de la greffe, s'anastomosent les deux bords coupés à 3-4 points de suture à l'aide des sutures de course, et nouer les sutures de course pour rester sutures avec un double nœud. Comme les deux couches de fermeture sont continues, le risque de déhiscence est augmentée. Le greffon aortique donneur doit être d'une longueur appropriée pour relier proximale et distale extrémité coupée du destinataire de l'aorte abdominale.
16. Pour les sutures interrompues, de construire quatre anastomose à 3 et 9 heures dans les deux côtés de la greffe d'une part, et anastomoser deux bords coupés à 3-4 points entre deux sutures de séjour de chaque côté de la greffe.
17. Relâcher la pince distale pour permettre l'écoulement rétrograde en greffe, identifier les sites de saignement et de faire des points supplémentaires dans les 3 minutes.
18. Après avoir vérifié l'hémostase satisfaisante, relâchez la pince proximale.
19. Confirmer la perméabilité du greffon selon la présence d'une pulsation vigoureuse dans la greffe et le segment adjacent proximale de l'aorte abdominale natif, en particulier dans le segment adjacent distale de l'aorte abdominale et l'artère mésentérique inférieure. Considérez thrombose dans des sites anastomotiques si la pulsation diminue au bout de quelques minutes après le rétablissement de la circulation sanguine.
20. Retourner les intestins dans la cavité abdominale.
21. Suturer fermer la paroi abdominale en utilisant 5-0 Nylon suture dans la couche musculaire et la couche de peau, respectivement.
22. Placez les souris receveuses dans une cage propre sur le dessus d'un coussin chauffant, et d'attendre 1-2 heures pour les souris à reprendre conscience et se remettre de l'anesthésie. Il est important de maintenir la chaleur animale adéquate lors de la récupération. Gardez les souris dans la cage chaud et au sec avant sillage des animaux de l'anesthésie.
23. Évaluer la fonction motrice des membres inférieurs après récupération de la souris, et encore le deuxième jour. Une chirurgie de transplantation réussie sera confirmée if aucun dysfonctionnement des membres postérieurs est observée chez les souris receveuses de la deuxième journée.
24. Administrer les souris receveuses au kétoprofène dans l'eau potable (5 mg / kg / j = 27 ug / ml dans l'eau potable) pendant 48 heures. Si des souris receveuses souffrent de douleur non soulagée par les analgésiques postopératoires comme en témoigne la perte de mobilité, absence de toilettage, anormale bottes posture, etc, ils seront euthanasiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin des points prédéfinis après 1-60 jours.

Analyse Graft

greffons artériels dans allogreffe ont été achetés à 4 semaines et greffes dans le modèle de greffe syngénique ont 6 semaines après l'opération (5 semaines après l'infection virale) et analysés par les techniques histologiques standard pour Elastica-van Gieson (EVG) coloration, hématoxyline et l'éosine (HE) coloration et immunofluorescence. Les photos ont été prises à l'aide d'un système de microscope immunofluorescence (Zeiss). Le comptage des cellules des noyaux entouré par immunomarquage positif a effectuered à fort grossissement et une moyenne de 5 sections pour chaque greffon. Les mesures de surface greffés de la lumière (à l'intérieur de l'endothélium), intima (entre la limitante élastique endothélium et interne, IEL), les médias (entre l'IEL et limitante élastique externe, anguille), épaisseur de paroi (entre la limitante élastique endothélium et externe) et tout navire (à l'intérieur de l'anguille) ont été calculés à partir de 5 sections de série, 150 um d'intervalle pour chaque greffon, en utilisant l'analyse d'image assistée par ordinateur et NIH image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

L'analyse statistique

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. À deux queues, des tests t appariés et une analyse ANOVA à deux voies ont été effectuées en utilisant le logiciel Prism (GraphPad Software). Différences avec P <0,05 ont été considérées pour indiquer la signification statistique.

Résultats

Modèle souris allogreffe artériosclérose (GA): Dans ce modèle, une aorte du donneur masculin est transplanté dans récipiendaire féminine afin que l'hôte induit réponses T allo-immunes à médiation cellulaire alloréactives contre un antigène mineur de Y (l'antigène d'histocompatibilité mineure HY spécifiques au mâle) exprimé sur le greffon ^12, et à son tour des cellules T IFN-γ produite lecteurs VSMC prolifération ²⁰ comme on l'observe dans d'...

Discussion

Les protocoles décrits sont axés sur les modèles GA souris. Les procédures peuvent être appliquées à d'autres modèles de transplantation de greffons. Ces modèles comprennent xénogreffe humanisée (c. segments d'artère coronaire de l'homme interposés dans le aortes infra-rénale de souris immunodéficientes), et le rejet aigu souris modèle GA (soit une aorte de souris d'une souche génétique dans un autre destinataire de souche génétique). Nos modèles de souris décrites...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.