היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Summary

כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.

Abstract

התקדמות במחקר סרטן הערמונית היא מוגבלת מאוד על ידי הזמינות של מערכות מודל אדם נגזרות והורמונים נאיביים, המגבילות את היכולת שלנו להבין את האירועים גנטיים ומולקולריים העומדים בבסיס מחלה ייזום ערמונית. לקראת פיתוח מערכות מודל טוב יותר ללימוד ערמונית אנושית סרטן, אנחנו ואחרים ניצלו את פוטנציאל אינדוקטיבי פרו ערמונית הייחודי של המכרסם העוברי ערמונית stroma, כינה ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM). כאשר recombined עם אוכלוסיות תאי pluripotent מסוימות, כגון תאי גזע עובריים, UGSM גורם להיווצרותו של אדם נורמלי ערמונית epithelia באופן תלוי בטסטוסטרון. מערכת כזו מודל אנושית יכולה לשמש כדי לחקור באופן ניסיוני ולבחון את היכולת של גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד בקצב מואץ בהשוואה למחקרים מהונדסים מכרסמים טיפוסיים. מאחר ותאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יכולים להיות מהונדסים גנטי בתרבות usinביטוי גנים מושרה G או siRNA עקום למטה וקטורים שקדמו לרקומבינציה רקמות, מודל כזה מאפשר בדיקת ההשלכות התפקודיות של גנים, או שילובים של גנים, אשר נחשבים כדי לקדם או למנוע היווצרות סרטן.

הטכניקה של בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי UGSM, לעומת זאת, הוא מאתגר ולמידה לעתים קרובות דורשת מישהו עם מומחיות קודמת ללמד באופן אישי. יתר על כן, חיסון של תערובות תאים תחת הקפסולה הכליות של מארח immunocompromised יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מתארים וממחישים בידוד נכון של UGSM מעוברי מכרסמים והשתלת הכליה כמוסה של תערובות רקמות כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי. גישה כזו, בשלב הנוכחי שלה, דורשת in vivo xenografting של תאי גזע עובריים, שעלולים להיות יישומים עתידיים יכולים לכלול בהיווצרות בלוטת מבחנה או את השימוש של אוכלוסיות תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs).

Introduction

יש צורך עצום במערכות מודל אנושיות טובות יותר של סרטן הערמונית. בפרט, מערכות מודל אדם רלוונטיות של רקמות ערמונית נורמליות, שאינם ממאירות אשר ניתן מניפולציות גנטית כדי להבחין את התפקיד של גנים ספציפיים באופן ישיר בייזום של סרטן הערמונית היינו להיות אינפורמטיבי מאוד. כניסתו של העידן הגנומי זיהתה מספר רב של גנים שעשויים להיות תפקיד בהיווצרות הסרטן. חוסר מערכות מודל ניסיוני אדם, לעומת זאת, קשה פוגע ביכולת שלנו כדי לבחון בחינה התפקודית ולאפיין גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד. מערכת מודל אידיאלית תהיה להקל על הניתוח הפונקציונלי המהיר ומהיר יותר של גני רגישות לסרטן בשילוב עם מערכות מודל מכרסמים מהונדסים מתאימות. יתר על כן, מערכת מודל אנושית כזה תאפשר אפיון מולקולרי של מנגנוני האיתות של ערמונית היווצרות הסרטן לעבר הגילוי והאימות של טיפולים חדשניים ללמנוע היווצרות סרטן הערמונית.

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) מסוגלים להרכיב רקמות ערמונית אדם כxenografts. בשנת 2006 טיילור, et al. דיווח כי יכול להיגרם hESCs כדי ליצור epithelia ערמונית in vivo כשמחדש בשילוב עם מכרסמים ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) בתוך פרק זמן של 8-12 שבועות. ¹ מחקרים אלה התבססו על עבודה קודמת של המעבדה Cunha מראה כי UGSM עוברי המכרסמים יכולה לקדם את הבידול של הערמונית של תאי גזע ואוכלוסיות תאי אפיתל עובריים in vivo. ^2,3 הערמונית מתפתחת מanlagen עוברי נקרא סינוס ואברי המין (UGS), ולפני 17 יום העוברי (עכבר E17 ; יום E18 בחולדה) ניתן להסיר את UGS ומחולק פיזי לתוך האפיתל (UGSE) וmesenchyme (UGSM) ⁴ גישת רקומבינציה רקמה זו שיפרה את ההבנה של התפתחות סרטן הערמונית ו, בפרט שלנו באופן משמעותי.גורם ly צמיחה ומסלולי איתות הורמונליים ואת מערכות יחסים בין מולקולריים ערמונית סטרומה והאפיתל. ^5-8 שיטה זו כרוכה בשילוב vivo לשעבר של UGSM עם גזע או תאי האפיתל מאותם מינים או מובחנים וrecombinants הסלולרי / רקמה אלה מושתלים וגדל וxenografts בתוך מארח עכבר. ^4,9 לאחר תקופה של צמיחה בvivo, השתל מכיל מבני בלוטות אפיתל ערמונית משובצים ברקמת סטרומה. ניתן לבצע צביעה נוספת כדי לקבוע אם מבנים כאלה הם באמת של הערמונית והוא המעשה ידי האדם. ^10,11

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש שיקגו (IACUC, מספרים והפרוטוקול 72,066 72,231). כל הניתוח בוצע תחת הרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. תאי הגזע העוברי האנושי הקו WA01 (H1; NIH-רישום # 0043) נרכש מWiCell (מדיסון, ויסקונסין) ותרבותי באמצעות פרוטוקול מזין עצמאי באמצעות mTeSR1 תקשורת (תאי גזע טכנולוגיות; ונקובר, BC). תאי גזע עובריים שמשו בתוך עשרה קטעים של הפשרה.

1. בידוד של סינוס ואברי המין מעוברי עכברים או עכברוש

1. להרדים את העכבר מתוזמן בהריון (17.5 יום) או עכברוש (יום 18.5) על ידי שאיפה של CO ₂ למשך 5 דקות. מוות הוא אושר על ידי הפסקה של סימנים חיוניים בחולדה. ואז לשבור את צווארו אנושי. Rבהוא מורדמים בשלב זה. לרסס 70% אתנול לחיטוי העור ואגפי הבטן. חותכים את עור הבטן ושכבות שרירים ולאחר מכן לחתוך את הרחם, להפריד את עוברי עכברים מהשק מי השפיר, ולחתוך את חבל הטבור. מעבירים את העוברים לתוך צינור פלקון 50 מ"ל המכיל תמיסת מלח מאוזנת של האנק הקר כקרח (HBSS) ולשמור על קרח. עוברים מומתים על ידי עריפת ראש עם מספריים כירורגיות.
2. הנח את העובר בצלחת פטרי 100 מ"מ. לחצות את העובר עם מספריים ברמה של הטבור (איור 1 א). הסר את הקיבה ומעי הדק. לחשוף את השחלות בנקבת העובר והאשך בעובר הזכר (איור 1 ו1C). (השחלות נמצאות בקטבים הזנב של הכליות. האשכים הם בערך ברמה של שלפוחית ​​השתן). בשלב התפתחותי זה, UGSM מבודד משני העוברים ממין זכר ונקבה הם מסוגלים גרימת שושלת האפיתל של הערמונית בנוכחותו של מארחטסטוסטרון. ⁴ אחרי נקודת הזמן ההתפתחותי הזה, לעומת זאת, בלוטות ערמונית מתחילות לגבש לUGSM, והבידוד של UGSM הטהור הוא מאוד מאתגר. ⁴
3. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את דופן הבטן בקו האמצע עם מספריים Vannas כדי לחשוף את שלפוחית ​​השתן והדופן אחורי של הבטן. דרכי המין העליונות החופשית מקבצים מצורפים (בעוברים ממין זכר, לחתוך את השופכן, Wolffian הצינור וצינור Müllerian; בעוברים ממין נקבה, לחתוך את השופכן וMüllerian הצינור). לשחרר את שלפוחית ​​השתן מחבל הטבור. לחתוך עצם ערווה ונפרד בבוטות מהקיר הקדמי של סינוס ואברי המין עם מלקחיים קצה קנס דומונט. לבסוף, להפריד את הקיר האחורי של סינוס ואברי המין מפי הטבעת. חותכים את סינוס ואברי המין עם השלפוחית ​​בקצה התחתון (מהשופכה) ולאחסן את סינוס כמקשה אחת ואברי המין (עם שלפוחית ​​השתן) בHBSS הקר כקרח.

2. הפרדת mesenchyme סינוס ואברי המין

1. הסר את שלפוחית ​​השתן ואברי המין מסינוס תחת מיקרוסקופ לנתיחה (1D איור).
2. העבר את סינוס ואברי המין לצינור פלקון המכיל טריפסין 1% בסידן (Ca ^{2 +)} ומגנזיום (Mg ^{2 +)} HBSS חינם. מניחים את הצינור במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות.
3. הסר את טריפסין ולנטרל trypsinization עם 10% עוברי בובין סרום (FBS) בDMEM/F12 בינוני.
4. להקניט בזהירות את שרוול mesenchymal הדביק מצינור אפיתל עם מחט או מלקחיים קצה קנס דומון (שמירה על שלמות צינור אפיתל מפחית את הסיכוי לזיהום תאי אפיתל של mesenchyme, זה יכול לגרום לבלוטות מכרסמים ויצר יחד עם הגזע אנושי שלך תאים שמקורם אפיתל בלוטות) (1D איור). ¹²
5. העבר UGSM לתוך צינור חדש פלקון המכיל DMEM/F12 בינוני + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס; 0.5 מ"ג / מ"ל) + 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) בתוספת 1nm R1881. Plאייס הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך הלילה.
6. צנטריפוגה ב XG 200 רקמות וזורקים supernatant. לשטוף עם פוספט חיץ מלוח (PBS) (נא לא להפריע רקמת גלולה).
7. הוסף collagenase 0.2% (בDMEM/F12) מחדש להשעות את הרקמות. דגירה של 37 ° C עם נדנדה עדינה במשך שעה 1.
8. במרץ מערבולת רקמת העיכול שלוש פעמים עד שהוא הופך תערובת הומוגנית מתא בודד ולהוסיף DMEM/F12 בינוני + 10% FBS 1% + P / S 1% + + NEAA 1nm R1881 לנטרל collagenase.
9. צנטריפוגה ב XG 200 ולאחר מכן לשטוף מחדש על ידי השעיית-תאי UGSM בHBSS, וחזור שלוש פעמים לשטוף את UGSM באופן מלא. לבסוף להשעות תאי mesenchymal בDMEM/F12 ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירת תאים.
10. לנתק את תאי הס פרוטוקול ללא מזין באמצעות תרבותי עם mTeSR1 תקשורת (גזע טכנולוגיות סלולריים, ונקובר, BC) באמצעות עיכול Accutase (Millipore; Billerica, MA). שטוף את תאי הסבשלב היומן של הצמיחה שלהם בDMEM/F12 תקשורת חמה, ואז מוסיף פתרון Accutase 1x חם, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות עד שתאים בודדים הם ניתקו באופן אחיד ממושבות. הוסף כמות שווה של 1x מוגדר טריפסין מונעי (Invitrogen; גרנד איילנד, ניו יורק) כדי לנטרל את Accutase ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב ולשבור את גושי תאים. תאי פיפטה לתוך צינור צנטריפוגות וצנטריפוגות במשך 3 דקות ב 200 XG, מחדש להשעות תא גלולה בDMEM/F12 תקשורת. צנטריפוגה צינור 3 דקות ב 200 XG שוב ולהסיר את supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות בHBSS הקר או DMEM/F12 בנפח רצוי.
11. הוסף תאי הס עם יחס של 1:2.5 הס / תאי mesenchymal. ³ זה יהיה הרכב תאי של ⁵ תאי UGSM 1E עם ⁴ hESCs 4E להזרקת 10 מ"ל (חולדה אחת UGS בדרך כלל תשואות על ⁶ תאי mesenchymal 2E). צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן לבטל את supernatant. Re-להשעות עם 75% Matrigel (BD Biosciences,סן חוזה, קליפורניה, מעורבב עם 25% HBSS הקר לטיפול קל יותר) ולמקם את הצינור בקרח להזרקה תת הקפסולה כליות.

3. השתלה של רקמות רקומביננטי מתחת לקפסולת הכליה

1. הכן את אזור ניתוח סטרילי.
2. הרדימי עכבר עירום athymic גברי עם ה-IP של קטמין / xylazine; להשתמש בתערובת טריות המכילה יחס 1:01:08 של קטמין: xylazine: מלוחה. מינון יהיה קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו2.5 Xylazine מ"ג / ק"ג. בעלי חיים שאינם מגיבים לבוהן קמצוץ צריכים להיות באופן מלא תחת במשך 20-30 דקות.
3. ניתוח להכין את העכבר על ידי גילוח האתר כירורגית (אם לא משתמש בעכבר בעירום), ניקוי עם שלושה מגבונים מתחלפים של אלכוהול 70% ואחריו התמיסה פולידין ויישום וילון כירורגית.
4. לשים משחה לחות העין (משחת עיני Altalube) לעיניו של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה.
5. במהלך ניתוח, קצב נשימה וטמפרטורת גוף ליבה של העכברים מנוטרים. את קצב הנשימה should להיות יציב ונשמר בתוך 40-90 נשימות / דקה. טמפרטורת גוף ליבה היא פיקוח עם תצפית של הצבע של הריריות והכפות ורודות של כפות רגליים.
6. הפוך ס"מ חתך בגב עור אורך זמן 1.0. תמשיך לחתוך את דופן הבטן בחתך אורכי 0.5 ס"מ.
7. לוחץ בעדינות את הכליה מתוך הבטן ולשמור על לחות פני השטח הכליות באמצעות טיפות של תמיסת מלח סטרילית.
8. בעדינות לנקב את הקפסולה הכליות באמצעות מחט מזרק 27 מד ריק. לנקב רדוד מאוד מספיק. זה יהיה איפה אתה מכניס מחט הקהה להזריק התערובת הסלולרית שלך.
9. מלא מחט מזרק בוטה 28 מד עם 10 μl של התערובת הסלולרי שלך. לאט לאט להכניס את האתר לנקב ולחדור parenchyma הכליות להגיע לאזור שמתחת הקפסולה הכליות. הזרק 10 μl של התערובת הסלולרית כדי ליצור בולוס על הכליות מתחת הקפסולה הכליות. נסיגת המחט.
10. להחזיר את הכליות לעבדוחלל minal. אבטח את השכבה השרירית של הצפק עם תפרי ניילון 4-0.
11. סגור את העור עם או תפר או סיכות.
12. יש לנקות את הדם מהעור באמצעות תמיסת מלח סטרילית.

4. שיכוך כאבים שלאחר ניתוח וניטור

1. הזרק את החיה עם עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג בכל שעה 12) או ketoprofen (3-5 מ"ג / ק"ג בכל שעה 12 מלוחה) לטיפול בכאב שלאחר ניתוח, ו1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס IP מלח כדי לשמור על בעלי החיים חמים ולמנוע התייבשות.
2. שים את בעל החיים בכלוב נקי והנח אותו על כרית חימום קלה.
3. שלח את בעלי החיים בחזרה לחדר של חיה ברגע שהם יחזרו להכרה ונעים בתוך הכלוב.
4. שים לב לבעלי החיים מדי יום לסימנים בלתי צפויים של מחלה ודלקת בשלושת הימים הבאים. העכברים מנוטרים עם תצפית של פעילות בכלובים כוללים מזון ומים הניגשים יום 1 לאחר הניתוח. אם העכברים להציג פעילויות פחות, Ketoprofen הוא intraperitoneally מודעהכהן שוב פעם ביום.
5. הסר את הסיכות או תפרים עור 2 שבועות לאחר ניתוח.
6. ניתן לקצור רקמות xenograft מוקדם ככל 8 שבועות לאחר ניתוח. ניתן הדמיה xenografts in vivo באמצעות אולטרסאונד של חיות קטנות (איור 2 א), ורקמות קבועות יכולות להיות מחולק ומוכתמות לחלבונים שונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (איור 3).

תוצאות

בונה על הדו"ח המרגש על ידי טיילור, et al., המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול engrafting באמצעות H1 הנפוץ (NIH המיועד WA01, גנטי גברי) שורת תאי גזע עוברית אנושית. ¹ קו זה נבדק בקפדנות על בקרת איכות ו הוא karyotypically רגיל ¹³ כאשר בתרבית כראוי, יכולים להישמר תאי הס, הרחיב, וcryopreserve...

Discussion

רקומבינציה רקמות באמצעות UGSM היא טכניקה שימושית להפליא כדי לחקור את התפתחותו של סרטן הערמונית ואת האירועים המולקולריים מובילים לייזום סרטן הערמונית. הפוטנציאל אינדוקטיבית של UGSM שימש במשך מספר רב של יישומים בערמונית מחקר, אלה כוללים גידול שיפור לקחת משורות תאי ערמונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x stock
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET (ketamine hydrochloride)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
AnaSed (xylazine)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
Trypsin	BD Biosciences	215240
Collagenase	Sigma	C2014
Ketoprofen	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline
Altalube eye ointment	Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stereomicroscope	Leica		Any good dissecting scope can be used.
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Syringe	Hamilton	84855
Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)	Hamilton	7803-02	Custom Needle
Ethanol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62
Sterile Gauze Pads	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Needle-in, dissolvable suture
Autoclip 9 mm Wound Clips	Becton Dickenson	427631
PVP Iodine Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-98
Dissector scissor with blunt end	Fine Science Tools	14072-10
Dumont fine tip forceps	Fine Science Tools	11252-50
Needle holder with Scissor	Fine Science Tools	12002-14