Formazione di epitelio prostatico umano utilizzando tessuti ricombinazione dei roditori urogenitale Mesenchima Sinus e cellule staminali umane

Riepilogo

Per svelare sono disperatamente necessari dei primi meccanismi molecolari alla base della prostata cancro iniziazione, il romanzo e sistemi modello umane innovative e approcci. Il potenziale di pre-prostatica seno urogenitale mesenchima (UGSM) per indurre pluripotenti popolazioni di cellule staminali di formare epitelio prostatico umano è un potente strumento sperimentale nella ricerca della prostata.

Abstract

I progressi nella ricerca sul cancro alla prostata è fortemente limitata dalla disponibilità di sistemi modello di derivazione umana e l'ormone-naïve, che limitano la nostra capacità di comprendere gli eventi genetici e molecolari alla base delle malattie della prostata iniziazione. Verso lo sviluppo di migliori sistemi modello per lo studio di carcinogenesi della prostata umana, noi e altri hanno approfittato della unico potenziale induttivo pro-prostatica di embrionale roditore stroma della prostata, del seno urogenitale chiamato mesenchima (UGSM). Quando ricombinato con alcune popolazioni di cellule pluripotenti come le cellule staminali embrionali, UGSM induce la formazione di umana normale della prostata epiteli in maniera testosterone-dipendente. Tale sistema modello umano può essere usato per studiare e sperimentalmente testare la capacità del candidato cancro alla prostata suscettibilità geni a un ritmo accelerato rispetto ai tipici studi transgenici roditori. Dal momento che le cellule staminali embrionali umane (hESC) possono essere geneticamente modificati nella cultura Using espressione genica inducibile o siRNA vettori di knock-down prima della ricombinazione dei tessuti, tale modello facilita la verifica delle conseguenze funzionali di geni, o combinazioni di geni, che si pensa di promuovere o prevenire la carcinogenesi.

La tecnica di isolare popolazioni pure di cellule UGSM, però, è impegnativo e di apprendimento spesso richiede una persona con esperienza precedente di insegnare personalmente. Inoltre, l'inoculazione di miscele di cellule sotto la capsula renale di un ospite immunocompromesso può essere tecnicamente impegnativo. Qui delineare ed illustrare il corretto isolamento dei UGSM da embrioni di roditori e capsula renale impianto di miscele di tessuto per formare epitelio prostatico umano. Tale approccio, nella sua fase attuale, richiede in vivo xenotrapianto di cellule staminali embrionali; applicazioni future potrebbero potenzialmente includere nella formazione ghiandola vitro o l'uso di pluripotenti indotte popolazioni di cellule staminali (iPSCs).

Introduzione

C'è una grande necessità di migliori sistemi di modelli umani di cancro alla prostata. In particolare, i pertinenti sistemi modello umano del normale, i tessuti della prostata non-maligne che possono essere geneticamente manipolate per discernere direttamente il ruolo di specifici geni nell'insorgenza del cancro alla prostata sarebbero incredibilmente informativo. L'avvento dell'era genomica ha individuato numerosi geni che possono avere un ruolo nella formazione del cancro. La mancanza di sistemi sperimentali modello umano, però, compromette gravemente la nostra capacità di testare e caratterizzare funzionalmente candidati cancro alla prostata geni di suscettibilità. Un sistema modello ideale dovrebbe facilitare le analisi funzionali rapidi e più rapido di geni di suscettibilità al cancro in combinazione con opportuni sistemi modello di roditori transgenici. Inoltre, un tale sistema modello umano consentirebbe caratterizzazione molecolare dei meccanismi di segnalazione di carcinogenesi prostatica verso la scoperta e la convalida di nuove terapie perprevenire la formazione del cancro alla prostata.

Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono in grado di formare tessuti prostatici umani come xenotrapianti. Nel 2006 Taylor, et al. Riferito che hESCs possono essere indotte a formare epiteli prostatica in vivo quando ri-unita roditore seno urogenitale mesenchima (UGSM) entro un periodo di 8-12 settimane. ¹ Questi studi erano basati su precedenti lavori da il laboratorio Cunha mostrando che roditore UGSM embrionale può promuovere la differenziazione prostatica delle cellule staminali embrionali e le popolazioni di cellule epiteliali in vivo. ^2,3 La prostata si sviluppa da un Anlagen embrionale chiamato il seno urogenitale (UGS), e prima di giorno embrionale 17 (topo E17 , giorno E18 nel ratto) le UGS possono essere rimossi e fisicamente divisi in epitelio (UGSE) e mesenchima (UGSM) ⁴ Questo approccio ricombinazione tessuto ha migliorato significativamente la nostra comprensione dello sviluppo della prostata e carcinogenesi, particolare.fattore di crescita ly e ormonali vie di segnalazione e le relazioni molecolari tra prostata stroma e l'epitelio. ^5-8 Questo metodo comporta la combinazione ex vivo di UGSM con staminali o cellule epiteliali della stessa o di diversa specie e queste ricombinanti cellulare / tissutale vengono impiantati e coltivati e xenotrapianti all'interno ospitante topo. ^4,9 Dopo un periodo di crescita in vivo, l'impianto contiene prostata epiteliali strutture ghiandolari incorporate nel tessuto stromale. Ulteriori colorazione può essere condotta per determinare se tali strutture sono veramente prostatica e di origine umana. ^10,11

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Protocollo

Questo studio è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla University of Chicago Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC, numeri di protocollo 72066 e 72231). Tutto l'intervento è stato eseguito in anestesia, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. La linea di cellule staminali embrionali umane WA01 (H1; NIH-registrazione # 0043) è stata acquisita da WiCell (Madison, WI) e coltivate utilizzando il protocollo alimentatore indipendente con mTeSR1 supporti (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). Cellule ES sono stati utilizzati entro dieci passaggi di scongelamento.

1. Isolamento del seno urogenitale da mouse o Rat Embrioni

1. Eutanasia di un mouse a tempo-gravidanza (17,5 giorni) o di ratto (18,5 giorni) per inalazione di CO ₂ per 5 min. La morte è confermata dalla cessazione dei segni vitali nel ratto. Si interrompe quindi il collo umanamente. La ra è l'eutanasia, a questo punto. Spruzzare il 70% di etanolo per sterilizzare la pelle del ventre e fianchi. Tagliare la pelle addominale e strati muscolari e poi tagliare l'utero, separare gli embrioni di ratto dal sacco amniotico, e tagliare il cordone ombelicale. Trasferire gli embrioni in un tubo da 50 ml Falcon contenente soluzione salina bilanciata di ghiacciata Hank (HBSS) e tenere in ghiaccio. Feti sono sacrificati per decapitazione con le forbici chirurgiche.
2. Posizionare l'embrione a 100 millimetri piatto di Petri. Bisecare l'embrione con le forbici a livello dell'ombelico (Figura 1A). Rimuovere lo stomaco e l'intestino tenue. Rivelare le ovaie nell'embrione femminile e testicolo nell'embrione maschio (Figura 1B e 1C). (Le ovaie sono situate ai poli caudali dei reni. I testicoli sono approssimativamente al livello della vescica). In questa fase evolutiva, UGSM intercettare sia embrioni maschili e femminili sono in grado di indurre un lignaggio epiteliale prostatica in presenza di ospitantetestosterone. ⁴ Dopo questo punto il tempo di sviluppo, tuttavia, gemme prostatiche iniziare formando nel UGSM, e l'isolamento di puro UGSM è molto impegnativo. ⁴
3. Al microscopio dissezione, tagliare la parete addominale nella linea centrale con Vännäs forbici per esporre la vescica e la parete posteriore dell'addome. Libero il tratto genitale superiore da allegati (in embrioni di sesso maschile, ha tagliato l'uretere, Wolff condotto e Mülleriani condotto, in embrioni di sesso femminile, tagliare l'uretere e Mülleriani condotto). Liberare la vescica dal cordone ombelicale. Tagliare l'osso pubico e senza mezzi termini separato dalla parete anteriore del seno urogenitale con Dumont pinza sottile punta. Infine, separare la parete posteriore del seno urogenitale dal retto. Tagliare seno urogenitale con la vescica all'estremità inferiore (dall'uretra) e memorizzare il seno in blocco urogenitale (con la vescica) in ghiaccio HBSS freddo.

2. La separazione del Sinus Mesenchima urogenitale

1. Rimuovere la vescica dal seno urogenitale al microscopio di dissezione (Figura 1D).
2. Trasferire il seno urogenitale a un tubo falcon contenente 1% tripsina nel calcio (Ca ^{2 +)} e magnesio (Mg ^{2 +)} HBSS gratuiti. Posizionare il tubo in frigorifero a 4 ° C per 75 min.
3. Rimuovere la tripsina e neutralizzare tripsinizzazione con il 10% Fetal Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12 medie.
4. Stuzzicare delicatamente il manicotto mesenchimale appiccicoso dal tubo epiteliale con un ago o Dumont pinza sottile punta (mantenendo il tubo epiteliale intatta riduce le possibilità di contaminazione delle cellule epiteliali del mesenchima, questo può causare ghiandole roditori formando insieme al tuo cellule staminali di derivazione umana epitelio ghiandolare) (Figura 1D). ¹²
5. Trasferire UGSM in un nuovo tubo Falcon contenente DMEM/F12 medio + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep; 0,5 mg / ml) + Aminoacidi non essenziali 1% (NEAA) più 1nM R1881. Place il tubo in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ durante la notte.
6. Centrifugare il tessuto a 200g e scartare il surnatante. Lavare con tampone fosfato salino (PBS) (non disturbare il precipitato di tessuto).
7. Aggiungere 0,2% collagenasi (in DMEM/F12) per ri-sospendere il tessuto. Incubare a 37 ° C con il dolce dondolio per 1 ora.
8. Vigorosamente vortice il tessuto digestione tre volte fino a diventare miscela cella singola omogeneo e aggiungere DMEM/F12 media + 10% FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1 nM R1881 per neutralizzare la collagenasi.
9. Centrifugare a 200 xg e poi lavare da ri-sospensione delle cellule UGSM in HBSS, e ripetere tre volte per lavare completamente il UGSM. Infine sospendere cellule mesenchimali in DMEM/F12 e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo di conteggio delle cellule.
10. Dissociare le cellule hES colta protocollo utilizzando alimentatore-Free con mTeSR1 supporti (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) utilizzando un digestione Accutase (Millipore, Billerica, MA). Lavare le cellule HESdurante la fase logaritmica della loro crescita in caldi DMEM/F12 supporti, quindi aggiungere tiepida soluzione Accutase 1x, e incubare a 37 ° C per 15-20 minuti fino a quando le cellule singole sono uniformemente dissociata dalla colonie. Aggiungere una quantità uguale di 1x definito inibitore della tripsina (Invitrogen, Grand Island, NY) per neutralizzare il Accutase e pipettare delicatamente su e giù per mescolare e rompere grumi di cellule. Cellule Pipettare in una provetta da centrifuga e centrifugare per 3 minuti a 200 xg, e risospendere il pellet cellulare in DMEM/F12 media. Centrifugare tubi per 3 min a 200 xg di nuovo e rimuovere il surnatante, quindi risospendere in HBSS freddi o DMEM/F12 al volume desiderato.
11. Aggiungi cellule hES con 1:2.5 rapporto di HES / cellule mesenchimali. ³ Questa sarà una composizione cellulare del 1E ⁵ celle UGSM con 4E ⁴ hESCs per iniezione 10 ml (un singolo ratto UGS tipicamente produce circa 2E ⁶ cellule mesenchimali). Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e poi scartare il surnatante. Risospendere con il 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, miscelato con il 25% HBSS freddo per una più facile gestione) e posizionare il tubo in ghiaccio per iniezione sotto-capsula renale.

3. Trapianto di tessuto ricombinante Sotto la capsula renale

1. Preparare una area chirurgica sterile.
2. Anestetizzare un maschio atimico nudo mouse con ketamina / xylazina ip; utilizzare una miscela fresca che contiene un rapporto di ketamina 01:01:08: xylazina: salina. Il dosaggio sarà di 100 mg / kg di ketamina e 2,5 mg / kg Xylazina. Gli animali che non rispondono ad un dito del piede-pizzico dovrebbero essere pienamente sotto per 20-30 min.
3. Chirurgicamente preparare il mouse con la rasatura del sito chirurgico (se non si utilizza un mouse nudo), Risanamento con tre alternati salviette di alcol al 70% seguita da soluzione Betadine e l'applicazione di un telo chirurgico.
4. Mettere umidità collirio (Altalube occhio unguento) per gli occhi del mouse per evitare l'essiccazione durante l'anestesia.
5. Durante l'intervento chirurgico, la frequenza respiratoria e la temperatura corporea dei topi sono monitorati. I tassi di respirazione should essere costante e mantenuta all'interno di 40-90 atti / min. Temperatura corporea viene monitorata con osservazione del colore delle mucose e le suole rosa dei piedi.
6. Fare un cm lunga incisione cutanea 1.0 longitudinale sul dorso. Continuare a tagliare la parete addominale in una incisione longitudinale 0,5 cm.
7. Premere delicatamente il rene fuori del ventre e mantenere umido superficie rene usando gocce di soluzione salina sterile.
8. Delicatamente forare la capsula renale, utilizzando un ago di siringa vuota calibro 27. Una puntura molto superficiale è sufficiente. Questo sarà dove si inserisce l'ago senza punta per iniettare la miscela cellulare.
9. Riempire una siringa con ago senza punta 28-gauge con 10 ml di miscela tuo cellulare. Inserire lentamente il sito di puntura e penetrare il parenchima renale di raggiungere una zona sotto la capsula renale. Iniettare 10 pl della miscela cellulare per formare un bolo sul rene sotto la capsula renale. Ritiro l'ago.
10. Riportare il rene alla Abdocavità terminale. Fissare lo strato muscolare del peritoneo con punti di sutura in nylon 4-0.
11. Chiudere la pelle con o sutura o fiocco.
12. Pulire il sangue dalla pelle con soluzione salina sterile.

4. Analgesia post-operatoria e di monitoraggio

1. Iniettare l'animale con buprenorfina (0,1 mg / kg ogni 12 ore) o ketoprofene (3-5 mg / kg in soluzione salina ogni 12 ore) per la gestione del dolore post-operatorio, e 1 ml di 37 ° C ip soluzione fisiologica per mantenere l'animale caldo e prevenire la disidratazione.
2. Mettere l'animale in una gabbia pulita e posizionarlo su una piastra elettrica mite.
3. Respingere gli animali per camera animale una volta che riprendano conoscenza e si muovono all'interno della gabbia.
4. Osservare l'animale al giorno per segni inattesi di malattie e infezioni per i successivi tre giorni. I topi sono monitorati con osservazione delle attività in gabbie tra cui cibo accesso e l'acqua 1 giorno post-operatorio. Se i topi mostrano un minor numero di attività, ketoprofene è intraperitoneale annuncioministrato ancora una volta al giorno.
5. Rimuovere i punti della pelle o suture due settimane post-operatorie.
6. Tessuti xenotrapianto può essere raccolto a partire da 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Xenotrapianti possono essere esposte in vivo utilizzando ultrasuoni piccoli animali (Figura 2A), e tessuti fissati possono essere sezionati e colorati per varie proteine ​​usando immunoistochimica (Figura 3).

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Risultati

Sulla base del rapporto emozionante da Taylor, et al., Il nostro laboratorio ha messo a punto un protocollo engrafting utilizzando l'H1 comunemente usato (NIH-designato WA01, geneticamente maschio) linea di cellule staminali embrionali umane. ¹ Questa linea è stato rigorosamente testato per il controllo di qualità e è cariotipo normale ¹³ Quando coltivate in modo appropriato, le cellule HES possono essere mantenute, ampliato, e crioconservati in uno stato indifferenziato e pluripote...

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Discussione

Ricombinazione tessuto usando UGSM è una tecnica estremamente utile indagare lo sviluppo della prostata e gli eventi molecolari che portano al cancro della prostata iniziazione. Il potenziale induttivo di UGSM è stata utilizzata per numerose applicazioni nel campo della ricerca della prostata; questi includono miglioramento tumore prendere di linee di cellule della prostata e tumori, lo studio delle interazioni stroma-epiteliali, e la formazione di cross-specie ricombinanti prostata ^7,17-20 Una corretta pre...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x stock
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET (ketamine hydrochloride)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
AnaSed (xylazine)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
Trypsin	BD Biosciences	215240
Collagenase	Sigma	C2014
Ketoprofen	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline
Altalube eye ointment	Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stereomicroscope	Leica		Any good dissecting scope can be used.
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Syringe	Hamilton	84855
Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)	Hamilton	7803-02	Custom Needle
Ethanol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62
Sterile Gauze Pads	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Needle-in, dissolvable suture
Autoclip 9 mm Wound Clips	Becton Dickenson	427631
PVP Iodine Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-98
Dissector scissor with blunt end	Fine Science Tools	14072-10
Dumont fine tip forceps	Fine Science Tools	11252-50
Needle holder with Scissor	Fine Science Tools	12002-14