Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

Resumo

Para desvendar são desesperadamente necessários os primeiros mecanismos moleculares subjacentes câncer de próstata iniciação, romance e sistemas de modelos humanos e abordagens inovadoras. O potencial de pré-prostática seio urogenital mesênquima (UGSM) para induzir as populações de células estaminais pluripotentes para formar o epitélio da próstata humana é uma ferramenta poderosa na investigação experimental próstata.

Resumo

Avanços na pesquisa sobre o câncer de próstata é severamente limitada pela disponibilidade de sistemas-modelo de origem humana e hormônio-naïve, que limitam a nossa capacidade de compreender os eventos genéticos e moleculares subjacentes próstata iniciação doença. Para o desenvolvimento de melhores sistemas de modelo para o estudo da próstata humana carcinogênese, nós e outros aproveitaram o único potencial indutivo pró-prostática de embriões de roedores próstata estroma, denominado mesênquima do seio urogenital (UGSM). Quando recombinado com certas populações de células, tais como células pluripotentes estaminais embrionárias, UGSM induz a formação de epitélio da próstata humana normal de uma forma dependente da testosterona. Tal sistema modelo humano pode ser utilizado para investigar experimentalmente e testar a capacidade dos candidatos genes de susceptibilidade de cancro da próstata a um ritmo acelerado em comparação com os estudos de roedores transgénicos típicos. Uma vez que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) pode ser geneticamente modificado em cultura using de expressão do gene indutivel ou siRNA knock-down vectores anteriores à recombinação dos tecidos, tal modelo facilita os testes das consequências funcionais de genes ou combinações de genes, que são pensados ​​para promover ou prevenir a carcinogénese.

A técnica de isolamento de populações puras de células UGSM, no entanto, é um desafio e aprendizagem muitas vezes requer a alguém com experiência anterior ensinar pessoalmente. Além disso, a inoculação de misturas de células sob a cápsula renal de um hospedeiro imunocomprometido pode ser tecnicamente desafiadora. Aqui destacamos e ilustrar adequado isolamento de UGSM a partir de embriões de roedores e implantação cápsula renal de misturas de tecidos para formar epitélio da próstata humana. Tal abordagem, em seu estágio atual, requer in vivo xeno de células-tronco embrionárias; aplicações futuras poderiam incluir na formação da glândula vitro ou a utilização de populações de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Introdução

Há uma tremenda necessidade de melhores sistemas de modelos humanas de câncer de próstata. Em particular, os sistemas modelo humanos relevantes de tecidos normais da próstata, não malignas que podem ser geneticamente manipulados para discernir directamente o papel de genes específicos no início do cancro da próstata seria extremamente informativo. O advento da era genômica identificou vários genes que podem ter um papel na formação do câncer. A falta de sistemas de modelos experimentais humanos, no entanto, prejudica gravemente a nossa capacidade de testar e caracterizar funcionalmente candidatos genes de susceptibilidade ao câncer de próstata. Um sistema modelo ideal facilitaria as análises funcionais rápidas e mais rápida de genes de susceptibilidade de cancro em combinação com os sistemas modelo de roedores transgénicos adequados. Além disso, tal sistema modelo humano permitiria a caracterização molecular dos mecanismos de sinalização de carcinogênese da próstata em direção à descoberta e validação de novas terapias paraevitar a formação de cancro da próstata.

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são capazes de formar tecidos humanos prostáticas como xenografts. Em 2006, Taylor, et ai. HESCs relatado que podem ser induzidas a formar epitélio da próstata in vivo, quando re-combinado com o roedor mesênquima do seio urogenital (UGSM) dentro de um período de 8-12 semanas. ^Uma Estes estudos foram baseados em trabalhos anteriores por o laboratório Cunha mostrando que roedor UGSM embrionário pode promover a diferenciação de células da próstata e as populações de células estaminais embrionárias epiteliais in vivo. ^2,3 A próstata se desenvolve a partir de um denominado Anlagen embrionária do seio urogenital (UGS), e antes do dia embrionário 17 (E17 rato ; E18 dia no rato) os UGS pode ser fisicamente removido e dividido em epitélio (UGSE) e mesênquima (UGSM) ⁴ Essa abordagem recombinação tecido aumentou significativamente a nossa compreensão do desenvolvimento e carcinogénese da próstata, em particular.factor de crescimento ly e vias de sinalização hormonais e as relações moleculares entre epitélio e estroma da próstata. ^5-8 Este método envolve a combinação de UGSM ex vivo, com as células estaminais epiteliais ou da mesma ou de espécies distintas e estes recombinantes celulares / tecido e são implantados cultivados e xenoenxertos de dentro do rato hospedeiro. ^4,9 Após um período de crescimento in vivo, o implante contém estruturas epiteliais glandulares da próstata incorporados no tecido estromal. Mais de coloração pode ser realizado para determinar se tais estruturas são verdadeiramente prostática e de origem humana ^10,11.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Universidade de Chicago Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC, números de protocolo 72066 e 72231). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O células estaminais embrionárias humanas linha WA01 (H1; NIH-registro # 0043) foi adquirida da WiCell (Madison, WI) e cultivados utilizando o protocolo alimentador independente usando mTeSR1 mídia (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). Células-tronco embrionárias foram usadas dentro de dez passagens de descongelamento.

1. Isolamento do seio urogenital de rato ou o rato embriões

1. Sacrificá um mouse cronometrado grávidas (17,5 dias) ou rato (18,5 dias) por inalação de CO ₂ por 5 min. A morte é confirmada pelo desaparecimento dos sinais vitais do rato. Em seguida, quebrar o pescoço humanamente. O ra é sacrificado neste momento. Spray de etanol de 70% para esterilizar a pele abdominal e flancos. Cortar a pele abdominal e camadas musculares e, em seguida, cortou o útero, separar os embriões de ratos a partir do saco amniótico, e cortar o cordão umbilical. Transferir os embriões num tubo Falcon de 50 ml contendo solução salina equilibrada de Hank arrefecida com gelo (HBSS) e manter em gelo. Fetos são sacrificados por decapitação com uma tesoura cirúrgica.
2. Colocar o embrião 100 mm de Petri. Bissectar o embrião com uma tesoura, a nível do cordão umbilical (Figura 1A). Remover o estômago e intestino delgado. Revelam-se as ovários no embrião do sexo feminino e testículos no embrião do sexo masculino (Figura 1B e 1C). (Os ovários estão localizados nos pólos caudal dos rins. Os testículos são aproximadamente ao nível da bexiga). Neste estágio de desenvolvimento, UGSM isolado a partir ambos os embriões de machos e fêmeas são capazes de induzir uma linhagem epitelial prostática, na presença de acolhimentotestosterona. ⁴ Após este ponto o tempo de desenvolvimento, no entanto, os botões da próstata começam a se formar no UGSM, e isolamento de UGSM puro é muito desafiador. ⁴
3. Sob o microscópio de dissecação, corte na parede abdominal na linha média com Vannas tesoura para expor a bexiga e parede posterior do abdome. Livre do trato genital superior de anexos (em embriões masculinos, corte o ureter, canal de Wolff e de Müller duto, em embriões do sexo feminino, corte o ureter e duto de Müller). Libertar a bexiga do cordão umbilical. Corte osso púbico e sem rodeios separada da parede anterior do seio urogenital com uma pinça de ponta fina Dumont. Finalmente, separar a parede posterior do seio urogenital, do recto. Corte do seio urogenital, com a bexiga na extremidade inferior (da uretra), e armazenar o seio urogenital em bloco (com a bexiga), em gelo HBSS frio.

2. A separação do seio urogenital Mesênquima

1. Remover a bexiga do seio urogenital sob o microscópio de dissecação (Figura 1D).
2. Transferência do seio urogenital para um tubo Falcon contendo 1% de tripsina em cálcio ^{(Ca2 +)} e magnésio (Mg ^{2 +)} HBSS sem. Colocar o tubo no frigorífico a 4 ° C durante 75 min.
3. Remover a tripsina e neutralizar tripsinização com 10% de Soro Fetal Bovin (FBS) em meio DMEM/F12.
4. Cuidadosamente provocar a manga mesenquimal pegajoso do tubo epitelial com uma agulha ou Dumont pinça fina ponta (mantendo o tubo epitelial intacta reduz as hipóteses de contaminação das células epiteliais do mesênquima, o que pode resultar na formação de glândulas roedor, juntamente com a sua haste derivada de células humanas epitélio glandular) (Figura 1D) ^12.
5. Transferir UGSM para um novo tubo Falcon contendo meio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% de Penicilina / Estreptomicina (Pen / Strep, 0,5 mg / ml) + 1% de não-essenciais Aminoácidos (NEAA), mais de 1 nM R1881. Place o tubo dentro de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante a noite.
6. Centrifugar o tecido a 200 xg e desprezar o sobrenadante. Lava-se com tampão fosfato salino (PBS) (não perturbar o sedimento de tecido).
7. Adicionar 0,2% de colagenase (em DMEM/F12) para re-suspender o tecido. Incubar em 37 ° C com agitação suave durante 1 hora.
8. Vortex vigorosamente a digestão do tecido três vezes até que se torne mistura homogénea de uma única célula e adicionar meio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% de P / S 1% + NEAA R1881 1 nM + para neutralizar a colagenase.
9. Centrifugar a 200 xg e depois lave por re-suspender as células UGSM em HBSS, e repita três vezes para lavar completamente o UGSM. Finalmente suspender as células mesenquimais em DMEM/F12 e contar as células utilizando um hemocitómetro ou dispositivo de contagem de células.
10. Dissociar as células-tronco embrionárias humanas culta protocolo com alimentador-livre com mTeSR1 mídia (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC), utilizando uma digestão Accutase (Millipore, Billerica, MA). Lave as células-tronco embrionárias humanasdurante a fase logarítmica do seu crescimento em meio DMEM/F12 quentes, em seguida, adicionar solução Accutase 1x quente, e incubar a 37 ° C durante 15-20 min, até que as células individuais são uniformemente dissociadas a partir de colónias. Adicionar uma quantidade igual de 1x definido inibidor de tripsina (Invitrogen, Grand Island, NY) para neutralizar o Accutase e pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar e acabar com aglomerados de células. Células de pipeta para um tubo de centrífuga e centrifugar por 3 min a 200 xg, e re-suspender pellet celular em DMEM/F12 mídia. Centrifugar tubo por 3 min a 200 xg novamente e remover o sobrenadante, em seguida, re-suspensão em HBSS frio ou DMEM/F12 no volume desejado.
11. Adicionar células-tronco embrionárias humanas com relação de 1:2,5 hES / células mesenquimais. ³ Esta será uma composição celular de 1E ⁵ células UGSM com 4E ⁴ hESCs por 10 ml de injeção (um único rato UGS normalmente produz cerca de 2E ⁶ células mesenquimais). Centrifugar a 200 xg durante 5 min e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Re-suspender, com 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, misturado com 25% HBSS frio para facilitar o manuseio) e coloque o tubo no gelo por injeção cápsula sub-renal.

3. Transplante de tecido recombinante Debaixo da cápsula renal

1. Prepare a área cirúrgica esterilizada.
2. Anestesiar um rato nu atímica masculino com ip cetamina / xilazina; usar um mix fresco contendo uma proporção de 01:01:08 ketamina: xilazina: soro fisiológico. A dosagem será de 100 mg / kg de cetamina e 2,5 mg / kg de xilazina. Animais que não respondem a um dedo do pé-pitada deve ser totalmente sob por 20-30 min.
3. Cirurgicamente preparar o mouse raspando o local da cirurgia (se não estiver usando um mouse nu), limpeza com três panos alternados de álcool a 70%, seguido por solução betadine e aplicação de um campo cirúrgico.
4. Coloque olho umidade pomada (Altalube pomada) para os olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia.
5. Durante a cirurgia, a taxa de respiração e temperatura corporal dos ratinhos foram monitorizados. As taxas de respiração shoULD ser estável e mantida dentro de 40-90 respirações / min. A temperatura corporal central é monitorizado com observação da cor das membranas mucosas e as solas dos pés-de-rosa.
6. Faça uma incisão na pele cm de comprimento 1,0 longitudinal na parte de trás. Continuar a cortar a parede abdominal, numa incisão longitudinal de 0,5 cm.
7. Aperte suavemente o rim para fora do abdômen e manter a umidade da superfície renal usando gotas de solução salina estéril.
8. Gentilmente perfurar a cápsula renal usando uma agulha de seringa de calibre 27 vazios. A punção muito superficial é suficiente. Este será o lugar onde você inserir a agulha sem corte para injetar sua mistura de celular.
9. Encha uma agulha de seringa sem corte de calibre 28, com 10 ml de sua mistura de células. Lentamente inserir o local de punção e penetrar no parênquima renal para alcançar uma área por baixo da cápsula renal. Injectam-se 10 ul da mistura celular para formar um bolo no rim sob a cápsula renal. Retirada da agulha.
10. Retorne o rim à abdocavidade minal. Fixe a camada muscular do peritônio com fio de náilon 4-0.
11. Feche a pele ou com sutura ou grampo.
12. Limpar o sangue a partir da pele utilizando solução salina estéril.

4. Analgesia pós-operatória e Monitoramento

1. Injectar o animal com buprenorfina (0,1 mg / kg a cada 12 horas) ou cetoprofeno (3-5 mg / kg em salina a cada 12 horas), para controlar a dor pós-operatória, e 1 ml de 37 ° C, solução salina IP para manter o animal aquecido e evitar a desidratação.
2. Coloque o animal em uma gaiola limpa e coloque-o sobre uma almofada de aquecimento suave.
3. Envie os animais de volta para a sala de animais, uma vez que recuperar a consciência e estão se movendo dentro da gaiola.
4. Observar o animal diariamente para sinais inesperados de doença e de infecção para os três dias seguintes. Os ratos são monitorados com a observação de atividades em gaiolas, incluindo comida e água acessando um dia de pós-operatório. Se os ratos exibir menos atividades, cetoprofeno é intraperitoneal anúncioministrou novamente uma vez por dia.
5. Remova os grampos de pele ou suturas duas semanas após a cirurgia.
6. Xenoenxerto tecidos podem ser colhidas mais cedo 8 semanas pós-cirurgia. Os xenoenxertos pode ser trabalhada in vivo utilizando ultra-sons de pequenos animais (Figura 2A), e os tecidos fixos pode ser seccionada e corada para proteínas utilizando vários imuno-histoquímica (Figura 3).

Resultados

Baseando-se no relatório emocionante por Taylor, et al., Nosso laboratório desenvolveu um protocolo de enxerto usando o H1 utilizado (NIH-designado WA01, geneticamente masculino) linha de células estaminais embrionárias humanas. ¹ Esta linha tem sido rigorosamente testados para o controle de qualidade e é normal, karyotypically ¹³ quando cultivadas de forma adequada, as células-tronco embrionárias humanas pode ser mantida, ampliada e criopreservados em um estado indiferenciado e plu...

Discussão

Recombinação de tecido, utilizando UGSM é uma técnica extremamente útil para investigar o desenvolvimento da próstata e os acontecimentos moleculares que conduzem a cancro da próstata iniciação. O potencial indutor de UGSM foi usado para numerosas aplicações na investigação da próstata, que incluem a melhoria do tumor ter de linhas de células da próstata e tumores, estudar interacções estromal-epiteliais, e formando próstata recombinantes inter-espécies ^7,17-20 preparação adequada de UGS...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x stock
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET (ketamine hydrochloride)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
AnaSed (xylazine)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
Trypsin	BD Biosciences	215240
Collagenase	Sigma	C2014
Ketoprofen	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline
Altalube eye ointment	Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stereomicroscope	Leica		Any good dissecting scope can be used.
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Syringe	Hamilton	84855
Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)	Hamilton	7803-02	Custom Needle
Ethanol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62
Sterile Gauze Pads	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Needle-in, dissolvable suture
Autoclip 9 mm Wound Clips	Becton Dickenson	427631
PVP Iodine Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-98
Dissector scissor with blunt end	Fine Science Tools	14072-10
Dumont fine tip forceps	Fine Science Tools	11252-50
Needle holder with Scissor	Fine Science Tools	12002-14