בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Summary

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש וספציפי In vivo מבחני לפרשנות שונים בהפתולוגיה אנושית. מניפולציה גנטית חולפת דרך microinjection של mRNA האנושי וWT מוטנט וoligonucleotides (MO) morpholino antisense לרתום נהילות של דג הזברה מתפתח עובר במהירות מוטציות assay פתוגניים, במיוחד, אך לא רק, בהקשר של הפרעות התפתחותיות אדם.

Abstract

כאן, אנו מציגים שיטות לפיתוח מבחני לבצע שאילתות שינויי nonsynonymous פוטנציאל קליני משמעותיים בשימוש בשלמת vivo בדג הזברה. הזברה (Danio rerio) הן מערכת חיה שימושית בשל נהילות הניסיונית שלהם; עוברים הם שקופים כדי לאפשר צפייה קלילה, עובר vivo לשעבר ההתפתחות המהירה, ניתן להשפיע גנטי ¹ היבטים אלו אפשרו להתקדמות משמעותית בניתוח של עובר,. תהליכים מולקולריים, והמוךפו"גנטי איתות. יחדיו, את היתרונות של מודל חוליות זו להפוך דג הזברה נוחה מאוד לדוגמנות הפגמים התפתחותיים במחלה בילדים, ובמקרים מסוימים, הפרעות במבוגרים. כי הגנום דג הזברה הוא שמור ביותר עם זה של בני אדם (~ 70% orthologous), ניתן לשחזר מצבי מחלה אדם בדג הזברה. מטרה זו מושגת גם באמצעות ההזרקה של מוטציה אנושית מ 'RNA כדי לגרום לעלייה בדומיננטי שלילית או של אללים פונקציה או ניצול של oligonucleotides (MO) morpholino antisense לדכא גנים לחקות אובדן גרסאות פונקציות. באמצעות שלמה של פנוטיפים-Induced MO עם mRNA האנושי כתרים, הגישה שלנו מאפשרת פרשנות של ההשפעה המזיקה של מוטציות ברצף חלבון אנושי המבוסס על יכולתו של ה-mRNA מוטציה להציל את הפנוטיפ מדידה, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מודלים של אללים המחלה האנושיים מתרחש באמצעות microinjection של עוברי דג הזברה עם מ.ו. ו / או mRNA האנושי בשלב תא 1-4, וphenotyping עד שבע ימים לאחר הפריה (DPF). אסטרטגיה כללית זו ניתנת להארכה למגוון רחב של מחלות פנוטיפים, כפי שמודגם בפרוטוקול הבא. אנו מציגים מודלים הוקמו למוךפו"גנטי איתות, יושרת craniofacial, לב, כלי דם, תפקוד כליות, ופנוטיפים הפרעת שריר שלד, כמו גם לאחרים.

Introduction

הפרשנות הפונקציונלית של מידע גנטי והמחאת הערך הקליני החזוי לגנוטיפ מייצגת בעיה עיקרית בגנטיקה רפואית, והוא הופך יותר ויותר נוגע ללב עם ההיתכנות הטכנית וכלכלית המואצת של רצף הגנום כולו. לכן, יש צורך לפתח וליישם פרדיגמות חדשות כדי לבדוק את pathogenicity של גרסאות שונות של משמעות לא ידועה (ואס) זוהו בחולים. לאחר מכן מבחני אלה חייבים להיות מדויקים, בזמן ויעיל וחסכוניים, ובנמל הפוטנציאל לזרז מעבר לתועלת קלינית.

בעוד בעכבר באופן מסורתי את הכלי של בחירה בתחום דוגמנות מחלה אנושית, דג הזברה הם מתעוררים כתחליף מדעי והוגן מבחינה כלכלית. שלא כמו בעכבר, ביולוגיה דג הזברה מאפשרת גישה נוחה ומהירה לכל השלבים ההתפתחותיים, בסיוע של עוברי בהירות אופטית המאפשרת הדמיה בזמן אמת של פתולוגיות מתפתחות. ^{1 הדור החדש יחסית של דג הזברה קווים מוטנטים סיפקה בדיקות נוספות ואפשרויות דוגמנות, מועסקות על ידי רבים במחקרים פונקציונליים, אך טכנולוגיה זו ממשיכה להיות מוגבלת (הנסקרת ב 1,38). לא רק שמוטציות גנטיות עם דפיקה תוספות של מוטציות ספציפיות מייגע כדי להשיג, הם גם לא נוחים לניתוח בינוני או תפוקה גבוהה לבדיקה של מגוון רחב של מוטציות בתוך גן יחיד. חשוב לציין, חבילה אחת של בדיקות יכולה לספק מידע לא רק לפוטנציאל הפתוגני של אללים, אלא גם לכיוון של השפעה ברמה התאית (למשל אובדן התפקוד לעומת רווח של פונקציה), שהוא קריטי ליידוע מצב של ירושה במשפחות, במיוחד כאשר שושלות יוחסי אדם קטנות נמל מידע מוגבל על המצב של העברת גנטית. לשם השוואה נוספת של את השימושים של עכבר זמין ודגמי דג הזברה, ראה טבלת מס '1.}

אנחנו גם לציין כימחדש הם מגבלות מובנות למערכת מודל דג הזברה. למרות ד לי rerio פיתוח ראשוני מהיר של מערכות איברים, לבגרות מינית דורשת כשלושה חודשים. בגלל זה, הפרעות טרום לידתי וילדים הופעה הן נוחות ביותר למודל זה ביטוי חולף. בעוד אידיאלי לביצוע מסכי תרכובת כימית גדולים, השימוש של מוטציות גנטיות הוא לא ריאלי עבור הבדיקה השיטתית של אלפי גרסאות nonsynonymous שתורמות, וימשיך להיות מזוהים בהפרעות ילדים.

בדיקות השלמה מתוארות כאן לנצל את העקיבות הזו, רמה הגבוהה של הומולוגיה, ושימור של תפקוד בין חלבונים אנושיים ודג זברה, במיוחד כך למולקולות הנדרשות לתהליכים התפתחותיים משומרים. איור 1 מתאר את הבדיקות ואסטרטגיה לזיהוי השפעות אלל שונות. ניתן לבצע גם אובדן התפקוד (LOF) ומבחנים דומיננטיים. לLOF, הניסוי מתחיל עם הדיכוי של הגן של עניין עם מציאה morpholino, וassaying לפנוטיפים שעשויות להיות רלוונטית לפנוטיפ הקליני תחת חקירה. דיכוי ניתן להשיג גם על ידי חסימת תרגום על ידי מיקוד MO ליד או אתר תחילת translational של לוקוס דג הזברה (תרגום חוסם morpholino; tbMO) או על ידי הפרעה בשחבור על ידי הצבת MO בצומת אחוי, בדרך כלל או גרימת הכללתו של אינטרון או אקסון הסוטה דילוג (אחוי החסימה morpholino; sbMO).

כתוצאה מכך, ה-mRNA כתרים מהתמליל האנושי orthologous הוא הציג וההצלה כימות של הפנוטיפ נמדדת. ברגע שassay היא הוקם, יכולה להיות הציגה מוטציות מועמד במסר האנושי וassayed ביכולתם כדי להציל את הפנוטיפ-Induced MO באותה היעילות כמו ה-mRNA האנושית WT. לעומת זאת, למועמד אללים דומיננטיים, mRNA האנושי (אבל לא MO) הוא introducאד עם ציפייה שmRNA האנושי WT לא גס להשפיע אנטומיה ופיזיולוגיה דג הזברה, ואילו כניסתה של בדיקת מוטציות שיש לו השפעה דומיננטית תהיה לגרום לפנוטיפים דומים לאלה שנצפו בתנאים הקליניים בבני האדם. ניסוי זה יכול להיות עוד יותר פרטנית לנתח אם האפקט הדומיננטי מתרחש על ידי רווח של פונקציה (GOF) או מנגנון דומיננטי שלילי על ידי מיזוג mRNA האנושי WT ומוטציה; לאירועי GOF, תוספת של ה-mRNA האנושית WT צפוי להיות רלוונטי, ואילו עבור אללים דומיננטיים שליליים, מיזוג של mRNA WT מוטנט וצריך לשנות את חומרת הפנוטיפ הנגרם על ידי מסר מוטציה. בכל המקרה, אנו ממליצים שכל שילובים של זריקות (MO עם mRNA האנושי WT לעומת morpholino עם מוטציה אנושית וכו 'mRNA להתבצע, רצוי בתוך אותו המצמד של עוברים (ראה איור 1) פרשנות היא כדלקמן.:

לבדיקות LOF:

• אם מציאהמייצר פנוטיפ אשר יכול היה להציל באופן שקול על ידי mRNA מוטנט וWT, אלל עשוי שפיר.
• אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה היא שאין להבחין בין פנוטיפ מציאה עצמו, אלל הוא null תפקודי סביר. הניסוי לא יכול להפלות בין nulls האמיתי (לא חלבון פונקציונלי) ורמות פעילות חלבון ultralow שאין להם יכולת הצלה.
• אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה סטטיסטית טובה יותר מאשר MO, אבל יותר גרועה מWT, אלל עשוי hypomorph כתוצאה זו מדגימה אובדן חלקי של פונקציה.

לבדיקות דומיננטיות:

• אם אין פנוטיפ מציאה, אבל זריקה של mRNA WT מייצרת הפנוטיפ, חייבת לשמש תכנית מגירה אם הניסוי הוא להמשיך (ראה בהמשך).
• אם אין פנוטיפ מציאה והזרקה של mRNA WT לא מייצר פנוטיפ, הניסוי ממשיך כרגיל.
• אם זריקהמוטציה של mRNA הוא שווה ערך לזה של טבע מסוג mRNA, אלל עשוי להיות או שפיר או אובדן התפקוד, או assay אולי נכשל. זה מצריך ניסויים נוספים כדי להבחין בין האפשרויות הללו.
• אם זריקה של mRNA מוטציה היא שאין להבחין בין מציאה MO, את הפונקציה של מוצר הגן הוא צפוי לשנות באופן כלשהו. כדי להבחין בשינוי בתפקוד, טיטרציה של mRNA מוטנט עם פראי סוג mRNA צריכה להתבצע.
• אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA פראי סוג לבדו, זה כבר הראה כי מוצר חלבון המוטנטי משתמש בחלבון פראי הסוג כמצע, כהשפעתו מגוונת עם הכמות של טיטרציה. הדבר זה מצביע על הפנוטיפ שלילי דומיננטי.
• אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA מוטציה לבד, זה כבר הראה כי מוצר חלבון המוטנטי כבר אין לו את אותו התפקיד כמו בטבע מהסוג, ולכן אינו מושפע מכמות חלבון מראש מוצר פראי סוגנשלח. זה מוכיח שאלל הוא רווח צפוי של פונקציה.

תכנית מגירה:

• אם לא מציג פנוטיפ ממציאת MO, אבל עושה כיום עם ה-mRNA WT, ניסויים נוספים יכולים להתרחש, אם כי אנו מדגישים כי מצב זה אינו אידיאלי. mRNA האנושי WT צריך להיות טיטרציה כדי למזער את הפנוטיפ, והוא יכול לשמש גם כנקודת סט חדשה. coinjection נוסף של WT וmRNA האנושי מוטציה יכולה להיות מוערך על סמך יכולת ההצלה של המוטציה.

Protocol

1. ביואינפורמטיקה ניתוח

1. לקבוע אם הגן האנושי של עניין יש ortholog דג הזברה, ואם כן, כמה עותקים. אנו ממליצים תפציץ גומלין (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) של החלבון האנושי נגד הגנום דג הזברה, ואת הפיצוץ הבא של דג הזברה הטובה ביותר להכות נגד הגנום האנושי. נכון orthologs יהיה הלהיט הכי טוב בכל מקרה.
2. לקבוע את הגודל של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של הגן האנושי. אם יותר מ 6 קילו, הדגם הזה הוא בלתי פתיר בהווה, בגלל מגבלות של איכות גבוהה בשעתוק במבחנה של תבניות ארוכות.
3. להשיג או ליצור מבנה המכיל ORF האנושי בpCS2 + עמוד השדרה וקטור (או שווה ערך וקטור עם 'אתר השעתוק SP6 ו 3' 5 הפולה אות).
4. עיצוב MO לחסום שחבור או תרגום של גן דג הזברה הממוקד. אם מספר עותקים קיימים בגנום דג הזברה, יסדואר הן שתי אופציות: א) תכנון של חודש נוסף, או ב) זיהוי של אתר אחוי נשמרים באופן מלא בין עותקים שכנגד מ.ו. אחת יכול להיות יעיל. כמה רצפים שפורסמו MO זמינים בwww.zfin.org.

2. ניתוח ביטוי בעובר דג הזברה מתפתח

1. לקבוע אם ortholog דג הזברה בא לידי ביטוי בהקשר רלוונטי לspatiotemporal readout פנוטיפי. אם אין נתונים ביטוי זמינים לגן של עניין, לבצע שעתוק לאחור (RT)-PCR באמצעות cDNA מכל עוברי דג הזברה או הכלאה באתרו. (ראה ^2,3).

3. Mutagenesis אתר מכוון

1. primers mutagenesis עיצוב 25-45 בסיסים באורך, עם המוטציה הרצויה במרכז. טמפרטורת התכת פריימר צריכה להיות גדולה או שווה ל -78 ° C. עיצוב פריימר mutagenesis קדימה ולאחור כדי לחשל את ההפךגדילים של פלסמיד.
2. השג פריימרים לאישור רצף של ORF לאחר mutagenesis; אלה צריכים אריח על פני ~ 300 סעיפי בסיס זוג כדי לכסות את כל ORF.
3. להרכיב את תגובת mutagenesis עם פולימראז באיכות גבוהה ומחזור כדלקמן (1: 95 מעלות צלזיוס 30 שניות, 2: 95 מעלות צלזיוס 30 שניות, 3: 55 מעלות צלזיוס דקות 1, 4: 68 מעלות צלזיוס 6 דקות, 5: עבור ל2 18x, 6: 4 מעלות צלזיוס לנצח, 7: הסוף).
4. הוסף 1 הגבלת endonuclease μl DpnI לכל תגובה להסיר תבנית מפוגלת סכר; לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
5. להפוך 2 μl של תגובת mutagenesis לתוך 20 תאים מוסמכים μl פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
6. פיק מושבות 3-4 ולחסן -5 מ"ל של תקשורת LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לנער על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 225 סל"ד.
7. Miniprep דנ"א ולקבוע את ריכוז.
8. רצף אתר המוטציה כדי לאשר את קיומו של המוטציה של עניין.
9. הרצף כולו ORF כדי לאשר יושרת רצף.

4. תמלול mRNA במבחנה

1. שימוש pCS2 + תבנית לינארית, ליצור mRNA באמצעות כתרים mMessage mMachine SP6 הערכה (Ambion). אנו ממליצים להשתמש במחצית מכמות מרכיבי התגובה.
2. לטהר את מדגם RNA עם ממטרים LiCl או כלורופורם פנול כמתואר בהוראות ערכה.
3. קבע את הריכוז של ה-mRNA באמצעות הספיגה, להבטיח את תקינותו של ה-mRNA באמצעות ג'ל אלקטרופורזה, ולאחסן את הדגימה בשלוש או יותר aliquots ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. אנחנו לא ממליצים להקפיא להפשיר מחזורים מרובים של aliquots mRNA.

5. ב assay vivo של אובדן וריאנט של פונקציה

1. השג עוברי דג הזברה דג הזברה הזדווגויות טבעיות, ולשמור אותם על 28 מעלות צלזיוס עובר במים ב 6 או 10 מנות ס"מ.
2. לנהל עקומת תגובת מינון morpholino להעריך סגוליות פנוטיפ, יעילות ורעילה MO MO. הזרק עקומת מינון של בלפחות שלושה ריכוזים שונים בין 1-10 ng MO ל50-100 (שלב תא 1-4) עוברי דג הזברה / אצווה. MOS יעיל צריך להצמיח עלייה תלויה מינון של שיעור עוברים שנפגעו ביצווה.
3. עוברי הפנוטיפ בשלב התפתחותי מתאים בהתבסס על ביטוי של גן דג הזברה הממוקד של ריבית ושלב שבו הפנוטיפ רלוונטי יקויימו. זה יכול להיות גם כמותי (כגון מדידה בין מבנים אנטומיים) או איכותי (על פי קריטריונים פנוטיפי סטנדרטיים). לכל זריקות קלע> 24 hpf: יש להתייחס אל עוברים עם PTU (0.003% 1-פניל-2-thiourea בתקשורת עובר) בשעה 24 hpf לצמצום מרבי של היווצרות מלנוציט.
4. לאחוי לחסימת MOS, יעיל MO מבחן על ידי מיצוי רנ"א הכל מכל עובר lysates בנקודת הזמן של ניקוד פנוטיפי, ליצור ולנהל cDNA RT-PCR של גן המטרה באמצעות פריימרים איגוף אתר יעד מיזורי.
5. כדי לוודא effic הדיכויiency של TB-MO, קציר שלם lysates חלבון עוברי ולנהל immunoblotting להשוות רמות של החלבון לעומת שליטה הממוקד. עם זאת, גישה זו אינה מקובלת על כל גני המטרה, כי יש תגובה הצולבת מוגבלת לנוגדנים מסחריים רבים לחלבוני דג הזברה. שתי שיטות עקיפות של מראה MO ספציפי, כוללות: א) הוכחה כי יש השפעה תלוית מינון בפנוטיפ; ו-B) מראה כי שיתוף הזרקה של mRNA wildtype עם TB-MO מצילה את הפנוטיפ ביעילות. מסיבות אלה, אנו ממליצים חוסם אחוי במידת האפשר, כי יעילות ניתן לפקח באופן ישיר.
6. אם הפנוטיפ הוא ציין המשך לשלב 5.7, אם לא פנוטיפ הוא ציין המשך לשלב 6.1.
7. לפנוטיפים איכותיים, בחר מנת מיזורי שב50-75% מעוברים מושפעים; לפנוטיפים כמותיים, בחר מנת מיזורי שבמידת פנוטיפי היא שונה באופן משמעותי מפראי סוג (p <0.001). הזרק קבוצות חדשות של דג הזברה EMBryos (שלב תא 1-4, n = 50-100/batch) עם קוקטייל המכיל את המינון "assay" של מיזורי ועקומת מינון של mRNA WT האנושי (הנע בין PG-mRNA 10-200; מינונים אלה להבטיח overexpression המשמעותי מעל נקודת ההתחלה של כל תמליל אחת, המייצגת 0.25-0.5% של ה-mRNA הפולה הכוללת בעובר דג הזברה). ⁴
8. רעול פנים לנהל ניקוד של קבוצות הזרקה; לבחור את מינון ה-mRNA WT עם ההצלה המשמעותית ביותר בהשוואה למיזורי לבד, זה המינון "assay" של ה-mRNA.
9. הזרק קבוצות חדשות (שלב תא 1-4, n = 50-100/batch) עם מינון assay של מיזורי ומינון assay של mRNA האנושי מוטציה. עוברי הפנוטיפ בשלב המתאים ולהשוות תוצאות כדי להציל את ה-mRNA אנושי WT באמצעות מבחן סטטיסטי מתאים (מבחן t או צ'י בריבוע). ראה איור 1 לתוצאות והמשיכו לשלב 7. להזריק את מינוני assay של WT וmRNA מוטציה לבד לשלוט על השפעות רעילות mRNA.

6. ב assay vivo של Variant דוםinant שלילי או רווח של אפקטי Function

1. אם לא הפסד של הפנוטיפ פונקציה הוא ציין (שלב 5.5) או אם ה-mRNA מוטציה מעוררת פנוטיפים לא שונים באופן משמעותי מMO לבד (שלב 5.7), להזריק עקומת מינון הנעה בין ה-mRNA אנושי PG WT 10-200 (מומלץ 25, 50 , ו100 עמ 'כבדיקה ראשונית) לקבוצות עובר (שלב תא 1-4; 50-100 עוברים / אצווה).
2. בשלב המתאים (ראה 5.3 לעיל), לנהל ניקוד פנוטיפי, ולקבוע את המינון הגבוה ביותר שבי אין מספר משמעותי סטטיסטי של עוברים מתים ו / או מושפע בהשוואה לקבוצת ביקורת uninjected. זהו המינון "assay".
3. הזרק מנת assay של mRNA האנושי מוטציה (שלב תא 1-4; 50-100 עוברים / אצווה). עוברי פנוטיפ ולהשוות את תוצאות לניקוד ממינון assay של הזרקת mRNA האנושית WT או ריכוז MO assay. ראה איור 1 לתוצאות.
4. אם תוצאות אינן נבדל MO, לכייל mRNA מוטציה אנושי עם mRNA WTולהשוות לWT האנושי וזריקות mRNA שעברו מוטציה. שיפור של פנוטיפים עם קבוצות ה-mRNA-מוזרק מוטציה בתוספת WT מציין שלילי דומיננטי. שום שיפור מצביע על רווח של פונקציה.

7. להתרבות בתוצאות בדיקת vivo

1. חזור במבחני vivo מינימום של שלוש פעמים.

8. שלב את דג הזברה בנתוני pathogenicity vivo עם קווים אחרים של ראיות

1. להשוות את הנתונים המתקבלים מניסויים pathogenicity דג הזברה ל: נתונים גנטיים בתוך אילן (אם רלוונטי), נתונים בתדירות אוכלוסיית ביקורת, במבחנה (מבחני מבוססי תאים של יציבות חלבון, לוקליזציה סלולרית, תפוקת איתות, או פעילות האנזימטית).

תוצאות

הפרעות רצסיבי וPseudorecessive

ריסים העיקריים הם מבנים כמעט בכל מקום בתכנית גוף החוליה שממלאת תפקידי איתות סלולריים בגורלם של תאים רבים, כולל התפשטות, קוטביות, בידול ותחזוקת רקמות. ⁵ חוסר תפקוד של אברונים אלה מוביל למגוון רחב של מחלות גנטיות אדם מכונים קולקטיבי ciliopathies. ^6,7 ישות קלינית אחת כזו היא תסמונת Bardet-Biedl (BBS), הפרעה בילדים multisystemic מתאפיינת בניוון רשתית, השמנת יתר, פעילות של בלוטות, פולידקטיליות ותפקוד לקוי של כליה. ⁷ ההתפתחות במבחני vivo של pathogenicity אלל היה הכרחי בגלל BBS) היא הפרעה גנטית הנגרמת על ידי הטרוגנית ובעיקר שינויי nonsynonymous פרטיים המתרחשים בלפחות 17 גנים ^7-10; וב) בירושת oligogenic> 25% ממשפחות BBS, שבו הנוכחות של שינויים הטרוזיגוטיים בשניBBS גן (בנוסף למוטציות סיבתיים עיקריות רצסיבי) יכול לווסת penetrance והאקספרסיביות קליניות. בדרך כלל, אללים שלישיים אלו הם שינויי nonsynonymous הטרוזיגוטיים של, מבחינה גנטית, פוטנציאל פתוגניים ברור, דבר שיחייבו פרשנות מדויקת של ההשפעה הביולוגית שלהם על תפקוד חלבון. ^11-13

כדי לחקור את הפוטנציאל הפתוגני של מוטציות שתרמו לעומס מוטציה בBBS, אנחנו בהתחלה בדקנו את כל השינויים שזוהו בmissense BBS1 - BBS14. גם אנחנו ואחרים הראינו שהאובדן של חלבוני גוף שחר מעורר dysregulation של קוטביות תא מישוריים (PCP; איתות Wnt הלא קנוניות). מפגין כפגמי הארכה מתכנסים בעוברי דג הזברה אמצע somitic ¹⁴ שימוש readout פנוטיפי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה, מצאו כי הדיכוי של גני BBS הסתיים בקיצור צירי גוף, רחב יותר ודק יותר, וsomites notochords הרחב, מפותלת. ^{15 <}/ Sup> (איור 2) פגמי gastrulation דיכוי מושרה MO הופק, והזרקה משותפת עם ה-mRNA אדם חולץ באופן משמעותי (וreproducibly) פנוטיפים אלה כפי שדורג על ידי שלוש שיטות שונות בvivo. ראשית, עוברים היו הבקיע לחיות על פי קריטריונים איכותיים פנוטיפי (רגיל, בכיתה אני וכיתה השנייה, להגדרות מפורטות של סוגים פנוטיפי לראות ^15). בשלב בא, אנחנו נבדקים ונדידת תאים במהלך epiboly (שלב התפתחותי מוקדם מאופיינים בהידלדלות והפצה של שכבות תאים מעל לתא החלמון ¹⁶⁾ על ידי העסקת נותב העמסה לדמיין תאים נודדים. לבסוף, אנו נמדדים אורך תא מטען somite בעוברי תשעה somite באתרו הכלאה עם קוקטייל של krox20, pax2 וriboprobes MyoD, שהיו רכוב שטוח לניתוח צורני.

מתודולוגיה זו כבר משמשת לבדיקה בעודף של 500 אללים בחלל מוטציוני הריסים. באחדללמוד לבד, בבדיקות vivo של> 130 אללים יצרו מגוון של עשרות פנוטיפי; כפי שעולה מהפרוטוקול שלנו (תרשים 1) שלמה המציל סווגו כשפיר (לא שונה באופן משמעותי מהצלת WT), חלקי מציל סווגו כhypomorphs (השתפר באופן משמעותי מMO, אבל חמור יותר מהצלת WT), כישלון בהצלה סווגו כnull תפקודי (לא שונה באופן משמעותי מMO), ופנוטיפים הנגרמים על ידי המוטציה mRNA לבד לעומת MO סווגו כשלילי דומיננטי.

יש לנו גם להעריך את הרגישות וסגוליות של assay בשלמת vivo בדג הזברה. הספציפיות אושרו על ידי שיתוף הזרקה משותף SNPs (> תדירות אלל קטין 5% באוכלוסיות של אנשים בריאים); אלה נמצאו לתת פנוטיפים שפירים בנבדק 14/17 (> 82%), והרגישות הוצגה להיות 98% כפי שמצוינת על ידי התאמה בין הנתונים בvivo וטיעונים גנטיים לא מספיקo מייחסת אלל כסיבתי באילן BBS. ¹⁷ בנוסף, השפעות פנוטיפי נצפו באמצעות שלושה צעדי vivo (ניקוד חי, epiboly מעקב, והאיש morphometrics) היו תקפים במבחנה באמצעות מחקרי לוקליזציה immunoblotting וסלולריים. בעוד הפרשנות של התוצאות הללו נדרשה ידע מוקדם מנגנון לפחות אחד מהיווצרות מחלה, דוגמה זו מספקת ראיות כדי לבסס את השירות ואת החוסן של הפרוטוקול שלנו. מאז יש לנו חיזוק שלנו בניקוד vivo עם מספר שורות אחרות של ראיות ניסיוניות בהקרנת מוטציוני משוחדת ולימוד פונקציונלי ניתוח TTC21B, חלבון תחבורה intraflagellar מדרדר. ¹⁸

הפרעות דומיננטיות

ניוון שרירי חגורת גפיים (LGMD) הוא כיתה אוטוזומלית של ניוון שרירים, גורם לחולשת שרירים מתקדמת באיטיות בירכיים והכתפיים. זה גנטי וקבוצה הטרוגנית של הפרעות chanistically נגרמת על ידי שני מוטציות דומיננטיות ורצסיבי ברחבי sarcolemmal המרובים, sarcomeric, cytoplasmic, וחלבונים גרעיניים. בהתבסס על המצגת של פנוטיפים וראיות למעורבות שריר מהדמיה בתהודה מגנטית קליניים, חקרנו את סיבת LGMD דומיננטי שנמצא בפינית, בארה"ב, ובמשפחות איטלקיות ^19. רצף של מועמדי positional בתוך הלוקוס הממופה גילה מוטציות בDNAJB6, גן מקודד שיתוף מלווה של משפחת HSP70 הביע כלפחות שני isoforms אחוי (גרעיני וcytoplasmic) בבני אדם. כדי לקבל תובנות נוספות DNAJB6 פונקציה ואת הרלוונטיות שלה לLGMD, בדקנו את תפקידה בשלמות שריר בדג הזברה. RT-PCR של ortholog דג הזברה (dnajb6b) זוהה ביטוי כבר בשלב של חמישה somite, אשר בעקבות הזרקה של עוברים עם morpholino אחוי חסימה. ב 48 שעות לאחר הפריה, ניקוד רעול פנים הראה ניתוק מאיטיסיבים מנקודות הכניסה שלהם. הספציפיות של פנוטיפ זה נבדק ולאחר מכן עם MO שאינו חופף שני והצילו לאחר מכן עם DNAJB6 mRNA האנושי WT.

לשאילתא איך אובדן DNAJB6 הפונקציה מוביל לפגמים ביושרת שרירים, הצגנו מוטציות missense נמצאו בחולים לתעתיקי אדם של שני isoforms והזרקתי אותם לעוברי דג הזברה. תוך הזרקה של mRNA האנושי WT הפיק לא פנוטיפ ניכר, שינויים אלו phenocopied אובדן השפעות הפונקציה של MO כאשר הונדסו בcytoplasmic, אבל איזופורם לא גרעיני. זאת בעקבות coinjection סכומי equimolar של mRNA מוטנט וWT, אשר הראה חומרה משופרת של הפנוטיפ שרירי, דבר המצביעה על השפעה דומיננטית. כדי לבחון את הרעיון הזה, זריקות נוספות בוצעו עם שינוי יחס טוחן של mRNA מוטנט וWT. עולה בקנה אחד עם התחזית, עודף של mRNA המוטנטי לעומת קטלני נגרם WT בעוברים, ואילועודף n של WT הפיק הצלה עלתה בהדרגה. זאת בעקבות בניסויים במבחנה כדי לקבוע מאפייני oligimerization ואינטראקציות חלבון אפשריים. אלה הראו כי המוטציות לפגוע בפעילות של antiaggregation DNAJB6 cytoplasmic ולהפריע למחזור של שניהם מוטציה וWT, כמו גם אינטראקציה עם מולקולה אחרת, BAG3, שהוא רלוונטי גם לpathomechanism של LGMD, מאז LOF BAG3 גורם צורה של ילדים ניוון שרירים ^20. לאחר מכן, אנו נשאלים האם BAG3 יכול לווסת את הפנוטיפ הנגרם על ידי מוטציה בDNAJB6b דג הזברה. בעוד זריקה של WT BAG3 לבד לא הניבה שום פנוטיפ, coinjection עם DNAJB6 מוטציות גדלו באופן משמעותי חומרת פנוטיפי, טוען כי BAG3 משחק תפקיד בתיווך pathogenicity של מוטציות כאלה ^19.

	מודל דג הזברה חולף	Mutant דג הזברה קו	קו עכבר מהונדס
גיל ההופעה של הפנוטיפ אנושי תחת חקירה	שלפני הלדה ילוד ילדים	שלפני הלדה ילוד ילדים	שלפני הלדה ילוד ילדים מבוגר
פנוטיפים אפשריים	craniofacial שרירים איתות של הלב של כליות של כלי דם	craniofacial שרירים איתות של הלב של כליות של כלי דם	craniofacial שרירים איתות של הלב של כליות של כלי דם חושי שלד קרביים התנהגותית של נשימה של רבייה endocrinal חילוף חומרים
זמן עד לשימוש (מלידה ו)	1-7 ימים	> 3 חודשים	> 6 חודשים
תפוקה	בינונית עד גבוה	נמוך	נמוך
יתרונות	יכולת לבדוק מוטציות ספציפיות יכולת ליצור מודלים דפיקה ב יכולת להשתמש בknockdowns morpholino תחזוקת עלות נמוכה	השתנות ניסיוניות פחות	מערכת יחסים קרובה יותר אבולוציונית שימור של מבני איברים יכולת גןדפיקה בקצב דגמים

טבלת מס '1. השוואה במודלי vivo.

טבלת 2. דוגמאות בדוגמנות vivo של dysmorphologies אדם. הפנוטיפים שונים נבדקו תחת הפרוטוקול שהוצג. מגוון readouts פנוטיפי וטכניקות להדמיה יכול להיות מועסק על בסיס הסוג של הפרעה. לחץ כאן לצפייה בטבלה גדולה יותר.

איור 1. בבדיקות פונקציונליות vivo של גרסאות nonsynonymous. גישה שיטתית לבדיקה פונקציונלית של כלeles בעלי משמעות לא ידועה או שיערו. מציאה גן דרך microinjection morpholino ואחריו סדרה של (CO) גם זריקות של WT וmRNA האנושי מוטציה. ניתוחים סטטיסטיים של תוצאות פנוטיפי להודיע ​​pathogenicity אלל ותפקוד מולקולרי. בקצרה, לאובדן של בדיקות תפקודיות: אם מציאה מייצרת פנוטיפ אשר יכול היה להציל באופן שקול על ידי mRNA מוטנט וWT, אלל עשוי שפיר (ירוק תיבה). אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה היא שאין להבחין בין פנוטיפ מציאה, אלל הוא null פונקציונלי סביר (תיבה צהובה). אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה סטטיסטית טובה יותר מאשר MO, אבל יותר גרועה מWT, אלל עשוי hypomorph (קופסה ירוקה) לבדיקות דומיננטיות:. אם הזריקה של mRNA מוטציה היא שווה ערך לזה של טבע מסוג mRNA , אלל עשוי להיות או שפיר או אובדן התפקוד, או assay אולי נכשל (קופסה ירוקה). אם זריקה של mRNA מוטציה היא indis tinguishable ממציאת MO, את הפונקציה של מוצר הגן הוא צפוי לשנות באופן כלשהו. כדי להבחין בשינוי בתפקוד, לכייל mRNA מוטציה עם פראי סוג ה-mRNA. אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA פראי סוג לבד, מוצר חלבון המוטנטי משתמש בחלבון פראי הסוג כמצע, ובכך מצביע על הפנוטיפ דומיננטי שלילי (קופסה כחולה). אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA מוטנט לבד, מוצר חלבון המוטנטי כבר אין לו את אותו התפקיד כמו בטבע מהסוג, ובכך הוא צפוי רווח של פונקציה (קופסה כחולה). אם לא מציג פנוטיפ ממציאת MO, אבל עושה כיום עם ה-mRNA WT, ניסויים נוספים יכולים להתרחש, mRNA האנושי WT צריך להיות טיטרציה כדי למזער את הפנוטיפ, והוא יכול לשמש גם כנקודת סט חדשה. coinjection נוסף של ה-mRNA האנושית WT ומוטציה יכולה להיות מוערך על סמך יכולת ההצלה של המוטציה (התיבה הוורודה).et = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. הערכה כמותית ואיכותית של MKS1 מוטציות זוהו בבני אדם. פגמים התפתחותיים בmks1 עוברי morphant. בהתבסס על חומרה, פנוטיפים סווגו לשלוש קבוצות. דוגמאות לכל כיתה מוצגות (א), והשכיחות שלהם בתוך העוקבה העובר שלהם (n = 100-160 עוברים) הייתה נספרה (לא מוצג). MO הזריק עוברים עם כיתה שהיו לי פנוטיפים גס מורפולוגיה נורמלית אבל היו קצרים יותר, עם רקמה עוברית מוגזמת על החלמון לעומת השליטה עובר מוזרק באותו הגיל (8-9 somitic somites). morphants הכיתה השנייה היו דליל, קצר ופתח את הראש וזנב מבנים בצורה גרועה, ובנוסף הייתה חסרה הגדרת somiticוסימטריה. עוברי III ייצוגי עוכבו קשות עם somites מפותח והמעווה בצורה גרועה, התנחשל notochords, ובדרך כלל לא שרדו ועבר את שלב 10-somite. שיתוף הזרקה של MKS1 mRNA אדם חולץ כל אחד מפגמים אלה, המדגים את הספציפיות של פנוטיפים לmks1 דיכוי. בכלאה באתרו של עובר בשלב 11-somite (± somite 1) מוכתם krox20, pax2 וriboprobes MyoD (ב, ג ). פנוטיפים היו לכמת ידי מדידות מהראשונים לאחרון somite הניכר של כל עובר (חיצים), לכמת בג. איור מותאם באישור ^15.

איור 3. דוגמאות בדוגמנות vivo של dysmorphology האנושי. (א) dysmorphology Craniofacial. mRNA הבקרה הזריק עובר (משמאל) ועובר מוזרק מוטציה (מימין) מוכתם Alcian כחול ב5 DPF. מוטציות עוברים mRNA-מוזרקים יציגו ראשים בעיקר קטנים ומעווים עם חוסר ארגון כללי של שלד craniofacial הסחוסים כולל מפושקים קשתות branchial וחסרות או מבני מבנה פגום. (ב) מיקרו / macrocephaly. שליטת uninjected עובר (משמאל) ועובר MO-מוזרק kctd13 (מימין) בשעה 5 DPF. Morphants להציג התרחבות של הראש, כפי שניתן לראות ברווח שבין העיניים. ²¹ (ג) תקינות כלי דם מופחתת. שליטת uninjected עובר (למעלה) ועובר MO-מוזרק eng (למטה) צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב2 DPF בfli1: קו כתב מהונדס eGFP. Morphants להציג לקוי הנבטה של כלי מיגזריות ומבני כלי דם אחרים. ⁴¹ (ד) looping הלב השתנה. בכלאה באתר של חדעוברים פראיים מסוג njected (משמאל) מראים ביטוי Spaw במזודרם צלחת הרוחב משמאל, ואילו ccdc39 העוברים morphant הראו דו צדדי (מימין) או, ברוב המקרים, ביטוי בלתי ניתן לגילוי Spaw (לא מוצג). ציסטות בכליות ⁴³ (ה). עובר uninjected WT (למעלה) וift80 morphant (תחתון). Morphants מוצג ציסטות גדולות בכליות (חץ), בצקת קרום הלב (ראש החץ) וזנב מסולסל. ⁽⁴⁴⁾ סינון גלומרולרי מופחת. הדמיה של פלורסנט שליטה הזריקו עובר (למעלה) וift80 morphant (תחתון) 24 שעות לאחר הזרקה של rhodamine dextran אל הלב. הקרינה מתפזרת ברחבי מערכת כלי הדם והוא פונה כמעט לגמרי על ידי הכליות כפי שניתן לראות עדר המוחלט של הקרינה בשליטה. Morphant מציג מתמשך הניאון dextran, המצביע על סינון גלומרולרי מופחת. ניוון שרירים ⁴⁶ (ז). WT DNAJB6 מרעוברים מוזרקים NA (למעלה) מראים myofibers איטי הנורמלי פורש את somites בדרך כלל בין myosepta הסמוך, כפי שנקבע על ידי immunostaining באמצעות נוגדן אנטי שרירן איטי. המוטציה DNAJBb (תחתון) הראה חלקי כדי להשלים את הניתוק של myofibers מmyosepta באחד או somites מרובים. זווית ¹⁹ (ח) somite. מוגדל נוף לרוחב חיות של השליטה uninjected (למעלה) או kif7 morphants (תחתון) צלם ב30 hpf. Morphants להציג somites בצורה חריגה, המיוחס לאקטופי קיפוד האיתות בmyotome דג הזברה. ⁴⁷

כל הנתונים מותאמים באישורו.

Discussion

השיטות שתוארו כאן מייצגים פרוטוקול כללי החלים על assay של שינויי nonsynonymous קשורים למגוון של פנוטיפים מחלה גנטיים אנושיים (טבלה 2, איור 3). הגישות שלנו הוכיחו שימושיות כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של וריאציה על פנוטיפים מחלה, ועל מנת לסייע לנתח מנגנוני מחלה (כגון תרומה של מוטציות שליליות דומיננטיות לתסמונת Bardet-Biedl, הפרעה בעיקר ¹⁷ אוטוזומלית רצסיבית). נכון להיום, באמצעות הפיתוח של עץ ההחלטה שהוצג, יש לנו מודל בעלות סבירה וזמן העולה על 200 גנים הקשורים קשר סיבתי עם הפרעות גנטיות, לעודף של 1,000 אללים.

למרות שלא נדון בהרחבה כאן, יש לנו גם הראו כי שיטות אלה הן מתאימים למודל סוגים אחרים של נגעים גנטיים, כגון גרסאות של מספר עותקים (CNVs), כמו גם ואינטראקציות גנטיות. ניתוח של אירועים כאלה הם מעבר להיקף שלתיאור השיטה הנוכחי, למרות שהם ביסודו להסתמך על אותו העיקרון של בדיקה שיטתית של גני המועמדים (כולל זוגות של גנים שהוחדרו במקביל) כדי לקבוע אינדוקציה או החמרה של פנוטיפים קליני מתאימים. לדוגמה, כדי להבהיר שמתוך 29 גנים ב16p11.2 CNV יכול להיות רלוונטי לmicrocephaly הנצפה נצפה בחולים עם כפילויות של מקטע גנומי 660 KB, mRNAs המקביל לכל אחד מ29 גנים במיגזר הוזרקו וראש מדידות גודל נערכו ב2 DPF ו5 DPF, חושפות את התרומה עיקרית של תעתיק יחיד, KCTD13. ²¹ בנוסף, יש לנו להשתמש במודל זה כדי אינטראקציות גנטיות assay של נגעי גנומי בחולים עם תסמונת שניהם Bardet-Biedl ומחלת הירשפרונג. ²² על ידי השוואה של דיכוי MO מהגנים סיבתיים של שתי הזהויות הקליניות בנפרד ובו זמנית, שהיינו מסוגל לזהות את הפנוטיפ שנוצר כbeing אינטראקציה סינרגיסטית ולא רק חומרת תוסף.

למרות שהוקם רגישות גבוהה (98%) וסגוליות (> 82%) לגרסות התורמים לciliopathies ^17, אין לנו עדיין מספיק נתונים כדי לקבוע אם אלה הם להכליל את כל readouts פנוטיפי במודלים של דג הזברה. לשם כך, מספר גדול של אללים, חזה גנטי להיות או שפיר או פתוגניים, חייב להיבדק בתוך כל קטגוריה פנוטיפי. זה יהיה חשוב במיוחד לביצוע מבחני כאלה בהגדרה הקלינית, שבו פרשנות פונקציונלית של VUSs יכול להודיע ​​אבחון וניהול רק אם הבנה חזקה של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא יכולה ללוות את המסירה של תוצאות כאלה לרופאים וחולים. עם זאת, שיטות אלה יכולים לתרום באופן משמעותי לכיוון הבנה טובה יותר של הנוף של מחלה גנטית אנושית. אנו צופים כי מודלים אלה לא רק לשמש כfounשעשועים לפרשנות משופרת של מידע גנטי קליני, אלא גם להיות מועסקים כמודלים שימושיים לנהל מסכי טיפוליים. בנתונים vivo יכול להיות גם בהשוואה לתחזיות חישוביות סיליקו ממקורות כגון PolyPhen ^23, לנפות ^24, SNPs & Go ^25, או MutPred ²⁶ כדי להראות התאמה. שימו לב כי במחקר קודם של חיזוי מסדי נתונים SNPs & Go וMutPred נמצאו להיות מדויק ביותר, עם דיוקים להגיע רק 0.82 ו 0.81, בהתאמה. ²⁷

אמנם יש לנו התווינו את החוסן של שיטות אלה לקבוצת משנה של מומים אנטומיים ילדים (טבלת 2, איור 3), פנוטיפים מסוימים הם פחות צייתנים בשיטות אלה. על אף חריגים מסוימים, ישנם שלושה סוגים עיקריים של הפרעות לא מקובל הפרוטוקול שלנו. הפרעות מבוגרי תחילה (כגון מחלת פרקינסון) מהוות אתגר למודל במערכת עוברית. להאט פרוגפנוטיפים ניווניות ression (כגון דמנציה frontotemporal) עשויים לדרוש יותר זמן מאשר חלון DPF שבע פעילות MO לייצר פנוטיפ. טכנולוגיות מציאה גן אחרות כגון RNAi וsiRNA זמינים כדי להפריע או לבזות את יעד הגן, אבל זה הוכח שאף אחד ספציפי כ, יציב, שאינו רעיל, או ארוך טווח כחודש ^28, ובכך גם הגבלת הזמן עבור phenotyping. שלישית, כמה מבנים בעלי חוליות, כגון ריאות של יונקים, אין לי מבנה מספיק orthologous בעובר דג הזברה. יש לנו גם סיפק הציעה תכנית מגירה לחקירה של מקרים בם הזרקת mRNA האנושית WT מובילה לפנוטיפ, למרות שאנו מזהירים זה הוא מצב חריג ולא רצוי.

אז פנוטיפים מחלות מסוימים עשויים לדרוש מידה רבה יותר של הפשטה ופונדקאות. יתכן כי תפקוד גן כבר התפצל מספיק כדי להחליש את הדמיון פנוטיפי בין המודל וtrהפנוטיפ UE, או שדג זברת הפיסיולוגיה מיסודו מסבכת את ההשפעות של המחלה המושרית. במקרים כאלה, אנו ממליצים לנתיחה נוספת של הפנוטיפ הופק לפני הפיטורים. יש לנו יצרנו כמה דוגמאות מוצלחות שבי פנוטיפים בעייתיים עבור assay זה כבר דגם בעוברי דג הזברה. לדוגמה, מוטציות בTCF8, גן הקשור למחלת ניוון קרנית פוקס (FCD), היו assayed באמצעות הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש בפגמי gastrulation כreadout פנוטיפי פונדקאית מבוסס על התפקידים הידועים של תמליל זה בהתפתחות מוקדמת. ^-29 במקרים אחרים, כגון כניוון שרירי מבוגרים תחילת נגרמת על ידי מוטציות בDNAJB6, שהיינו מסוגל לייצר פנוטיפים myofiber בעוברי 5dpf למרות העובדה שבני האדם הם חסרים שרירים ניכר פתולוגיה בשלושה עד ארבעה העשורים הראשונים לחייהם. ¹⁹

בנוסף לדגמי מוטציה החולפים שהוצגו כאן, אחרים לקחו גם AdvantaGE של מערכת חולפת זו למודל מחלה אנושית במגוון רחב של מערכות גוף. בדוגמה אחת, רטיניטיס פיגמנטוזה היה במתכונת בדג זברה על ידי מציאה של RP2 הגן, וכתוצאה מכך המוות של תאי רשתית וירידה בלמינציה רשתית. הצלה עם mRNA פראי סוג האנושי הביאה לפיתוח של כל שלוש השכבות של למינציה רשתית, ואילו ארבע מתוך חמש mRNAs מוטציה לא הצליחו להציל. אף ³⁰ מודל זה של הפרעה חושית אנושית מבוסס על פנוטיפ מורפולוגי, הוא גם ניתן תגובת assay לגירויים כגון הלה אקוסטית או Prepulse עיכוב ^47.

לאחרונה, מודל דג הזברה היה בשימוש כדי לחקור את היווצרות המחלה אלצהיימר באמצעות חלבון מקדים עמילואיד. ³¹ החוקרים הראו כי מציאה הגן גרמה תולדת axonal לקויה של תאי עצב מוטורי, שניתן היה להציל עם mRNA האנושי. המודל הזה הוכיח את עצמו במיוחד אינפורמטיבי, כמודלים עכבר להציג רק phenot העדיןypes (מציאה יחידה) או קטלני לאחר לידה (מציאה כפולה). היכולת להעריך את עוברי דג הזברה in vivo לאורך פיתוח סייעה להבחין אפקט הפתוגני של חלבון עמילואיד מבשר מופחת, כמו גם עדות ישירה ובלבד שהחלבון דורש גם תחום תאי ותוך תאים לתפקוד תקין. דגמים בולטים אחרים כוללים זה של ניוון שרירים נוסף ^{32, 33} היהלומים Blackfan אנמיה, Axenfeld-Reiger תסמונת (פיתוח עיני וcraniofacial) ^34, מחלות מעי דלקתיות ³⁵ (פעילות נגד חיידקים), מחלת פרקינסון ⁽³⁶ נוירון ואובדן תנועה), ותפיסה ³⁷ (הידרוצפלוס והיפראקטיביות).

נפוץ יותר הם קווי דג הזברה מוטציה אשר הוכחו לשחזר פנוטיפ מחלה אנושי גם. נבדקו ^ב1,38, דגמים כוללים לוקמיה, מלנומה, cardiomyopathies המורחבים, ניוון שרירים דושן,ועוד רבים אחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S, M0530L
DpnI restriction endonuclease	NEB	R0176L, R0176S
Max Efficiency DH5α competent cells	Invitrogen	18258-012
Big Dye Terminator	Applied Biosystems	4337455
mMESSAGE mMACHINE Kit	Invitrogen	AM1340, AM1344, AM1348
Morpholino	Gene-Tools	n/a
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629	Prepare as 0.003% PTU in embryo media
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%
Tricaine methane sulfonate	Western Chemical	N/A	For anesthetization and euthanasia
Equipment
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler	BioRad	Any equivalent thermal cycler
Nano Drop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
SMZ 745T Stereomicroscope	Nikon
AZ100 Stereomicroscope	Nikon
DS Fi1 Digital Camera	Nikon	For color/fluorescent imaging
DS QiMC Digital Camera	Nikon	For black/white imaging
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software	NIS- Elements