שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

Summary

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

Abstract

טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.

Introduction

ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי ^1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים heterotaxy ^2-5.

טכניקות קיימות בשימוש כדי ללמוד תנועתיות ריסי דרכי הנשימה יכולה להיות מקובצים או סוג vivo לשעבר החריף או לוןטווח גר במבחנת גישות ניסיוניות. ניסויים אקוטיים כוללים הדמיה vivo לשעבר של ביופסיות אדם מכחול האף / נשימה ^6,7 וניתוח של סעיפי נשימה רוחביים פשוטים ^8. במבחנת הגישות להשתמש בטכניקות של תרביות תאים שונות כדי ליצור גיליונות של epithelia מובחן ריסים כמו בתרבויות ממשק נוזלי אוויר או תרבויות השעיה נשימה ^9-11. עם זאת, טכניקות הנשימה reciliation epithelia אלה דורשות השקעה משמעותית מאוד בזמן ובאימונים לפני כל תאי אפיתל ריסים שמישים מיוצרים לניסויים (4-6 שבועות ^9,10). בעוד ניתוח vivo לשעבר חריף של ביופסיות מברשת אפיתל נשימה משמש בדרך כלל למחקרים קליניים בבני אדם, שיטה זו אינה שמישה במחקרי עכבר בשל החמירה פגיעה ברקמות מכאנית ^12.

הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה לניתוח של mousדואר קנה הנשימה דרכי הנשימה epithelia הוא לא רק פשוט לביצוע, אבל זה לא דורש כישורים מיוחדים ולא לנתיחה כל ציוד מיוחד מלבד אלו סטנדרטי להדמיה על ידי videomicroscopy. ישנם יתרונות רבים לפרוטוקול זה פשוט. ראשית, כפי שקציר הרקמה מקנה נשימת העכבר הוא מהיר וקל לביצוע, שהוא מאפשר להערכה מהירה של תפקוד ריסי נשימה במספר רב של עכברים. זה יכול לכלול ניתוח חריף של ההשפעות לטווח הקצרים של טיפולים שונים במבחנה. שנית, להיות טכניקת vivo לשעבר, אפיתל דרכי הנשימה הריסים נשאר קשור אליו שבבסיס רקמות תומכות ובכך לשמור על מסלולים הקשורים תא איתות. לכן בהשוואה במבחנת reciliated הנשימה epithelia, הכנה זו היא ייצוג טוב יותר של הסביבה הטבעית ברקמות גוף חייה. שלישית, פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מספר הפרמטרים כמותיים שונים שיכול לספק הערכה האובייקטיבית של f ריסי ניעתימשיחה. לבסוף, בניגוד לשיטות קיימות אחרות לשם ויזואליזציה ריסי דרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשר צפייה בפרופיל של הריסים שהם אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של פעימת ריסים ודור גל metachronal .

פרוטוקול זה יכול להיות שונה במספר הדרכים לטפל במגוון רחב של צרכי ניסיוניים, כגון התפקיד של סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד דרכי הנשימה ריסים ודור / תחזוקה של קצב נשימה ריסים והתפשטות גלי metachronal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. התקנת ריאגנטים

1.1 Dissection והדמיה בינוני

L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ"ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה.

2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה

התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא זכוכית תחתית צלחת תרבות 35 מ"מ. למעלה ובצד של החדר נוצרת על ידי הנחת פיסה קטנה של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ על צלחת הזכוכית. שולי הגיליון הוא לחתוך כדי להתאים את צלחת תחתית העגולה והמרכז גזוז נוסף ליצירת חדר מרכזי רדוד (ראה שלבים 2.1-2.3). בחלק העליון של המכלול הזה, תלוש זכוכית עגול 18 מ"מ כיסוי ממוקם כדי ליצור תא סגור מתאים להדמיה.

1. לחלוטין לכסות תלוש 18 מ"מ עגול עם מכסה זכוכית מרובע של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ.
2. עם מספריים לנתיחה חדים רגילים לקצץ את יריעות סיליקון העודפים ממסביב לקצה של להחליק את המכסה (וכתוצאה מכך שכבה מעגלית של יריעות סיליקון).
3. עם אזמל חד לחתוך ולהסיר מרובע של יריעות סיליקון (כ 10 מ"מ מרובע) מאמצע להחליק את המכסה המכוסה (ובכך ליצור את החלק העליון והצדדים של חדר ההדמיה) מרכזית.

3. קציר והכנת קנה הנשימה

1. להרדים עכברים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים מקומי ולהשתמש בועדה ו / או הנחיות ממשלתיות ולהסיר קנה נשימה לתוך צלחת תרבות סטנדרטי פלסטיק 35 מ"מ עם מספיק L15 תקשורת לרקמה לצלול (מחברים השתמשו בעכברים ממש לפני הלידה בהריון היום 16.5, ועד בעלי חיים יילוד, יילודים, ומבוגר ^2).
2. סרה של רקמה שאינה משויכת קנה הנשימה מחוברת לחלק החיצוני שלאת קנה הנשימה באמצעות נתיחה בוטה.
3. הסר את הגרון עם חתך רוחבי מתחת לסחוס cricoid באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 1).
4. הסר את סניפי הסימפונות העיקריים ימין ועל שמאל עם חתך רוחבי מעל קארינה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 2).
5. בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עדינים ולשטוף את 2-3 פעמים עם הלום ~ 1 מ"ל של מדיום הרחצה L15 עם Pipetman P1000 P1000 ועצה כדי לנקות את כל ריר ודם.
6. גזור את קטע 3-4 טבעת של קנה הנשימה באמצעות חתך רוחבי עם מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, שורת 1).
7. לחתוך longitudinally דרך אמצע שריר trachealis של קטע קצר זה קנה הנשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, קו 2).
8. לחתוך longitudinally במרכז של טבעות הסחוס קנו נשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 ג , קו), והשאיר את שני חלקים של קנה הנשימה רקמות מתאימות להדמיה (סעיף יחיד שמוצג באיור 2 ד).

4. ההדמיה cilia

1. מגזרי העברה קנה נשימת רקמות, לוואי לומן למטה, אל אמצע צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה תרבות עם 100-200 μl של מדיום L-15.
2. כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ריסים להוסיף כמות קטנה של 0.20 מיקרומטר ניאון microspheres למדיום L-15 רחצה דגימת הרקמה מקנה נשימה (~ 1 x 10 ¹¹ חלקיקים / מ"ל או 20 μl / מ"ל של ההשעיה microsphere המימית Fluoresbrite 2.5%).
3. מקם את חדר ההדמיה שהוכן קודם לכן (ראה נוהל 1-3 לעיל) על גבי מדגם צד גיליון סיליקון קנה הנשימה למטה, עם מדגם קנה הנשימה הממוקם באמצע החדר המוקף חומה הרדוד שהוקם על ידי החלון חתוך ליריעות סיליקון (איור 1 ).
4. דחף בעדינות מטה על coverslip כדי להבטיח מקום ובלהסיר כל L-15 תקשורת עודפת ממנצלים הקצוותGA P1000 קצה וP1000 Pipetman.
5. הר צלחת 35 מ"מ הזכוכית התחתונה התרבות ומדגם קנה הנשימה במיקרוסקופ הפוכה עם אופטיקה 100X אובייקטיבית ודסק"ש.
6. באמצעות תוכנת רכישת סרט מצלמה ומהירות גבוהה לאסוף סרטים של תנועתיות ריסים ב 200 + פריימים לשנייה לאורך קנה הנשימה epithelia הריסים של מכורבל קצה של שריר trachealis (איור 2 ד מפורטים התיבה, E: ירושלים עדיין תמונה מסרט מוקלט) (סרט משלים 1).
7. באמצעות הדמיה epifluorescent FITC ואור נמוך מצלמת CCD (ראה רשימת ציוד למעלה), לאסוף סרטים של תנועת microsphere ניאון על פני ריסי epithelia קנה הנשימה על מנת לאפשר כימות מאוחר יותר של זרימה שנוצרה ריסים (משלים סרט 2).

5. Quantitation של תנועתיות צילה

1. טען סרטים צלמו דסק"ש לחבילת תוכנת ImageJ ולאחר הטכניקה שתוארה על ידיעין דראמונד ¹³ להשתמש בכלי הקו למתוח קו סריקה חוצה את הריסים פועמים. "Reslice" של קו זה יוצר תמונה מסוג שבו רשם גלי תנועת ריסים מעבר לקו מייצרת דפוס גל. מספר הפיקסלים בין כל שיא גל נמדד (פיקסל אחד = מסגרת סרט אחד) שממנו ניתן לחשב את מספר הפעימות לדקה (כלומר הרץ).
2. כדי למדוד סרטי cilia תזרים עומס ניאון חרוז לתוך חבילת תוכנת ImageJ, ולהשתמש בתוסף MTrackJ ¹⁴ כדי לעקוב אחר אופן ידני חרוזי ניאון על פני השטח של epithelia קנה הנשימה ולתת לתוכנה ליצור מהירות ויווני חרוז לכל חרוז במעקב.

יש להקפיד בעת שימוש בחרוזי ניאון לכמת זרימה כמו המרחק מהריסים פועמים חזק יכול להשפיע על עוצמת זרם נמדדת. תנועת חרוז בתוספת 2 סרט היא דוגמה טובה לכך. בדוגמה זו חרוזהתנועה היא מהירה על פני השטח של ריסי מכות ונושרים באופן משמעותי לחרוזים רחוקים יותר בתקשורת הרחצה. כדי לשלוט על זה, צריכים להיות שנאסף העתקי חרוז רק במרחק קבוע מעל epithelia הריסים בכל הדגימות על מנת לאפשר השוואה נכונה צריכה להתבצע. לבסוף, כדי לקבל נתונים יציגים בזרימת נוזל, חרוזים צריכים להיות במעקב במשך זמן רב ככל האפשר, אנחנו מעדיפים להשתמש בשירים חרוזים שמכסים תאי 10 + ריסים לחישוב זרימת נוזל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה ^13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin