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요약

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

초록

점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석​​을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.

서문

기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 한 영향을 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된.

기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 6,7 간단한 가로기도 섹션 8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 9-11에서와 같이 차별화 된 섬모 상피의 시트를 생성하는 다양한 세포 배양 기술을 활용합니다. 모든 사용 가능한 섬모 상피 세포가 실험 (4-6주 9,10)에 대해 생성되기 전에 그러나, 이러한기도 상피 reciliation 기술은 시간과 교육에서 매우 중요한 투자를 필요로합니다. 기도 상피 브러시 생검의 급성 전 생체 분석은 일반적으로 인간의 임상 연구에 사용하고 있지만,이 방법은 더욱 악화 기계적 조직 손상 12에 의한 마우스 연구에서 사용할 수 없습니다.

양해 각서 (MOU)의 분석을 위해이 프로토콜에 설명 된 기술E 기관기도 상피 실행할 단순 아니지만, 그것은 특별한 해부 기술도 videomicroscopy하여 이미징을위한 그 표준 이외의 특수 장비 전혀 필요하지 않습니다. 이 간단한 프로토콜에 많은 장점이 있습니다. 마우스 기관 조직 수확을 실시 할 빠르고 쉽기 때문에 첫째, 그것은 쥐의 큰 숫자기도 섬모 기능의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이 체외 치료 다른의 단기 효과 급성 분석을 포함 할 수 있습니다. 둘째, 생체 기술되고, 섬모기도 상피 세포는 지원 조직을 기본에 붙어 남아 있으므로 관련된 세포 신호 경로를 유지합니다. 따라서 체외 reciliated기도 상피 세포에 비해,이 혼합물은 생체 조직 환경에서 자연의 더 나은 표현입니다. 셋째,이 프로토콜을 허용 운동성 섬모 F의 객관적인 평가를 제공 할 수있는 다른 양적 변수의 숫자의 취득기름 부음. 마지막으로,기도 섬모 시각화를위한 다른 현재의 방법과는 달리,이 프로토콜은 섬모 비트의 고해상도 이미징 및 metachronal 파 생성을위한 최적 속눈썹의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각 속눈썹의 시각화 수 있습니다 .

이 프로토콜은 이러한 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는기도 섬모 기능 및 생성 / 유지 보수 등의 점액 부하 등의 기계적 요인의 역할과 실험의 다양한 요구를 해결하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다 기도 섬모 비트와 metachronal 파동 전파.

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프로토콜

1. 시약 설정

1.1 해부 및 영상 매체

Leibovitz의 L-15 배지 (L15)는 기관 샘플 수확 및 이미징을 수행하는 동안 사용되는 FBS (10 %)과 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / 페니실린 G 나트륨과 스트렙토 마이신 황산염 100 ㎍ / ㎖의 ML)로 보충된다.

2. 얕은 벽으로 둘러싸인 문화 챔버 어셈블리

기관 조직을 보유하는 데 사용되는 챔버는 그림 1에 표시됩니다. 챔버의 바닥은 유리 35mm 배양 접시 바닥이다. 챔버의 상단과 측면이 유리 접시 위에 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 작은 조각을 배치하여 생성됩니다. 시트의 가장자리가 둥근 바닥 요리에 맞게 절단 및 센터는 추가 (단계 2.1-2.3 참조) 얕은 중앙 챔버를 형성하기 위해 트림합니다. 이 어셈블리의 상단에, 18mm의 둥근 유리 커버 슬립이 영상에 적합한 밀폐 챔버를 생성하기 위해 배치됩니다.

  1. 완전히 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 사각형 18mm 원형 유리 커버 슬립을 포함한다.
  2. 표준 날카로운 해부 가위 커버 슬립 (실리콘 시트의 원형 레이어의 결과)의 가장자리 주위에서 초과 실리콘 시트를 트림.
  3. 날카로운 메스를 잘라와 커버 커버 슬립 (따라서 이미징 챔버의 상단과 측면을 형성)의 중간에서 실리콘 시트 (약 10mm 광장)의 중앙 광장을 제거와 함께.

3. 기관 수확 및 준비

  1. 지역 기관 동물 관리에 따라 쥐를 안락사와위원회 및 / 또는 정부의 지침을 사용하여 잠수함의 조직에 충분한 L15 미디어 (저자를 통해, 단지 임신 일 16.5에서 출생하기 전에 마우스를 사용하고있는 표준 플라스틱 35mm 배양 접시에 기관을 제거 신생아, 신생아, 성인 동물 2).
  2. 의 외부에 부착 된 비 기관 관련 조직을 제거무딘 절개를하여 기관.
  3. 다만 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 1)를 사용하여 윤상 연골 아래에 가로 컷 후두를 제거합니다.
  4. 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 2)를 사용하여 바로 카리나 위의 가로 컷으로 왼쪽과 오른쪽 주 기관지 분지를 제거합니다.
  5. 부드럽게 미세 집게로 기관을 보유하고 점액과 혈액을 맑게하는 P1000 Pipetman과 P1000 팁 입욕 L15 매체의 ~ 1 ml의 루멘 2 ~ 3 회 세척하십시오.
  6. 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 1) 가로 컷을 사용하여 기관지의 3-4 링 세그먼트를 잘라.
  7. 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 2)를 사용하여이 짧은기도 세그먼트의 trachealis 근육의 중앙을 세로 방향으로 잘라.
  8. 마이크로 해부 가위 (그림 2C를 사용하여 기관 연골 고리의 중앙을 세로 방향으로 잘라 그림 2D에서와 같이)를 떠나> 라인).

4. 속눈썹 영상

  1. 이전 기관 조직 부문, L-15 매체의 100-200 μL와 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중간에 내려 루멘 쪽.
  2. 속눈썹 생성 흐름이 기관의 조직 샘플을 (~ 1 × 10 11 입자 / ㎖ 또는 Fluoresbrite 2.5 % 수성 microsphere의 현탁액 20 μL / ㎖) 목욕 L-15 배지에 형광 0.20 ㎛의 작은 양의 마이크로를 추가 계량합니다.
  3. 실리콘 시트로 잘라 창에 의해 형성된 얕은 벽 챔버의 중앙에있는 기관의 샘플, 이미징 챔버 아래 기관 샘플 실리콘 시트면의 상단에 (위의 1-3 절차를 참조하십시오) 이전에 준비를 놓습니다 (그림 1 ).
  4. 조심스럽게 제자리에 고정 coverslip을 아래로 밀어 가장자리저기서을 넘는 L-15 용지를 제거조지아 P1000 팁 P1000 Pipetman.
  5. 100X 목적 및 DIC 광학 거꾸로 현미경에 35mm 유리 바닥 문화 요리와 기관 샘플을 장착합니다.
  6. 고속 카메라와 영화 수집 소프트웨어를 사용하여 200 섬모 운동의 영화를 수집 +의 섬모 기관 상피에 따라 초당 프레임 (그림 2D 박스, E 윤곽 : 녹화 된 동영상에서 예를 스틸 이미지) trachealis 근육의 가장자리를 웅크 리고 (보충 영화 1).
  7. FITC epifluorescent 이미징 및 저조도 CCD 카메라 (위의 장비 목록을 참조)를 사용하여, 속눈썹 생성 흐름 (보충 영화 2) 이후 정량화 할 수 있도록 섬모 기관 상피의 표면에 형광 microsphere의 운동의 영화를 수집합니다.

5. 섬모 운동성의 정량

  1. ImageJ에 소프트웨어 패키지에 DIC 이미지 한 영화를로드하고 I에서 설명하는 방법에 따라아인 Drummond는 13 박동 섬모를 건너 래스터 선을 그리는 선 도구를 사용합니다. 이 라인의 "다시 분할은"라인에 걸쳐 섬모 운동이 파형을 생성 kymograph 형식 이미지를 생성합니다. 각 파의 피크 사이의 픽셀 수는 그들을 측정 (하나의 픽셀 = 1 동영상 프레임) 분당 비트 (즉 Hz에서)의 수는 다음 계산 될 수있는 것입니다.
  2. ImageJ에 소프트웨어 패키지로 속눈썹을 흐름이 생성 부하 형광 구슬 영화를 측정하고 수동으로기도 상피의 표면에 형광 구슬을 추적하고 소프트웨어를 추적 각 비드 비드 속도와 방향성을 생성하도록 MTrackJ 플러그인 14을 사용합니다.

치는 속눈썹의 거리로 흐름을 정량화하는 강력한 측정 유량 크기에 영향을 미칠 수있는 형광 구슬을 사용하는 경우주의해야합니다. 보충 영화 2 구슬 운동은 이것의 좋은 예입니다. 이 예제 비드의운동 박동 섬모의 표면에 빠르고 훨씬 더 멀리 목욕 미디어 비즈 끊깁니다. 이를 위해 제어하려면, 구슬 트레이싱은 정확한 비교를 할 수 있도록 모든 샘플에있는 섬모 상피 위의 고정 된 거리에서 수집해야한다. 마지막으로, 유체의 흐름에 대한 대표적인 데이터를 얻기 위해, 구슬은 가급적 대해 추적해야한다, 우리는 유체 흐름을 계산하기위한 10 + 섬모 세포를 커버 비드 트랙을 사용하는 것을 선호합니다.

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결과

동영상 재생 100 %, 속눈썹 비트 (보충 영화 2의 방향으로 눈에 띄는 흐름; 통제기도 섬모가 명확하게 볼과 조정 방법 (동영상 재생이 15 % 실시간으로 느려집니다 보충 영화 1)에서 이길 볼 수 있어야합니다 ) 시간 진짜. 섬모 영화의 정량은 그림 3에서 본 것과 유사한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 형광 구슬의 추적 섬모 생성 유속의 측정 (그림 3D)을

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토론

속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인...

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공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

이 프로젝트는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소에서 NIH 교부금 U01HL098180에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐의 공식 견해를 대변하지 않습니다, 및 혈액 연구소 또는 국립 보건원

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 Medium Invitrogen21083-027No phenol red
Fetal bovine serum HycloneSH30088.03
Penicillin-Streptomycin Invitrogen15140-122
2x fine forceps RobozRS-4976
Dissection scissors RobozRS-5676
Micro dissection scissors RobozRS-5620
Scalpel RobozRS-9801-15
P1000 pipetman Gilson, IncF123602
P1000 tips Molecular BioProducts2079E
18 mm round glass cover slips Fisher Scientific430588
Plastic 35 mm culture dishes Corning430588
Glass bottom 35 mm culture dishes Warner InstrumentsW3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick AAA Acme Rubber CoCASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres Polysciences09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters LeciaDMIRE2Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filtersLeciaBrand is not critical.
Microscope stage IncubatorLecia11521749Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field Vision ResearchPhantom v4.2Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera HamamatsuC9100-12Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis softwareNational Institutes of HealthImageJ with MtrackJ plugin

참고문헌

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