Metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

Riepilogo

Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.

Abstract

È stata stabilita una tecnica ex vivo per l'imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l'analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l'imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l'intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l'analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d'onda. Con l'aggiunta di perline fluorescenti durante l'imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.

Introduzione

Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare ^1. La semplice protocollo sviluppato per l'imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel corso di una schermata di mutagenesi del mouse su larga scala per consentire una rapida valutazione della funzione delle ciglia mobili (cilia frequenza del battito, forma battito delle ciglia, ciglia flusso generato) in mutanti con cardiopatia congenita associata a heterotaxy ^2-5.

Le attuali tecniche utilizzate per lo studio delle vie respiratorie ciglia motilità possono essere raggruppati in due l'ex vivo tipo acuto o lontermine ger in approcci sperimentali in vitro. Esperimenti acuti includono ex vivo di visualizzazione nasali / vie aeree biopsie spazzola umani ^6,7 e analisi di semplici sezioni trasversali ⁸ vie respiratorie. Gli approcci in vitro utilizzano varie tecniche di coltura cellulare per produrre fogli di differenziata epiteli ciliato, come nelle culture di interfaccia Liquid Air o respiratori sospensione culture ^9-11. Tuttavia, queste vie respiratorie epiteli tecniche reciliation richiedono investimenti molto significativo nel tempo e la formazione prima di tutte le cellule epiteliali ciliate utilizzabili sono prodotte per la sperimentazione (4-6 settimane ^9,10). Mentre acuta analisi ex vivo delle vie respiratorie epiteliali biopsie pennello sono comunemente utilizzati per gli studi clinici umani, questo metodo non è utilizzabile in studi del mouse a causa di lesioni aggravate tessuto meccanico ^12.

La tecnica descritta in questo protocollo per l'analisi del moustracheale e vie aeree epiteli non è solo semplice da eseguire, ma non richiede particolari doti dissezione né le attrezzature specializzate, oltre a quelli standard per l'imaging da videomicroscopia. Ci sono molti vantaggi a questo semplice protocollo. Prima, come mouse trachea raccolta dei tessuti è rapida e facile da eseguire, esso consente la rapida valutazione della funzione cilia vie aeree in un gran numero di topi. Questo può includere analisi acuta degli effetti a breve termine diversi trattamenti in vitro. Secondo, essendo una tecnica ex vivo, l'epitelio ciliato vie respiratorie rimane attaccata ad esso sottostanti tessuti di sostegno e conservano quindi associate percorsi di segnalazione cellulare. Quindi in confronto a in vitro reciliated epiteli delle vie aeree, questa preparazione è una migliore rappresentazione del naturale in ambiente tessuto vivo. Terzo, questo protocollo permette l'acquisizione di una serie di parametri quantitativi differenti che possono fornire la valutazione oggettiva motile cilia funzione. Infine, a differenza di altri metodi attuali per via aerea visualizzazione cilia, questo protocollo permette la visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo vista di profilo delle ciglia che è ottimale per l'imaging ad alta risoluzione del battito ciglia e generazione di onda metacronale .

Questo protocollo può essere modificato in vari modi per affrontare una vasta gamma di esigenze sperimentali come il ruolo di agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico sulla funzione cilia muco delle vie aeree e la generazione / manutenzione di vie respiratorie battito delle ciglia e propagazione delle onde metacronale.

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Protocollo

1. Setup Reagenti

1.1 Dissezione e immagini Media

L-15 Leibovitz (L15) è completato con FBS (10%) e penicillina-streptomicina (100 unità / ml di penicillina G sodica e 100 pg / ml di streptomicina solfato) è usato sia durante il raccolto e di imaging di campioni trachea.

2. Shallow Walled Cultura della Camera dell'Assemblea

La camera utilizzato per contenere trachea tessuto è mostrato in Figura 1. Il pavimento della camera è il fondo di vetro 35 millimetri capsula di Petri. La parte superiore e laterale della camera è generato mettendo un piccolo pezzo di 0,3 mm di spessore fogli silicone sopra il piatto di vetro. Il bordo del foglio è tagliato per adattarsi al piatto fondo rotondo ed il centro è ulteriormente tagliato per formare una camera centrale poco profonda (vedere i punti 2.1-2.3). In cima a questa assemblea, un vetrino di vetro 18 millimetri rotonda è posto per generare un ambiente avente adatto per l'imaging.

1. Coprire completamente il vetrino in vetro mm 18 round con un quadrato di 0,3 mm di spessore rivestimento di silicone.
2. Con forbici normali dissezione netta tagliare il telone di silicone in eccesso intorno al bordo del vetrino (risultante in uno strato circolare di fogli di silicone).
3. Con un bisturi affilato tagliare e rimuovere una piazza centrale di fogli di silicone (circa 10 mm quadrati) dal centro del vetrino coperto (formando così la parte superiore e sui lati della camera di imaging).

3. Trachea Raccolta e Preparazione

1. Euthanize topi secondo locale la cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato e / o linee guida governative e rimuovere trachea in plastica 35 millimetri capsula di Petri standard abbastanza L15 supporto al tessuto sommergere (autori hanno usato topi appena prima della nascita al giorno di gestazione 16.5, fino alla appena nati, neonatale e adulto animali ^2).
2. Rimuovere non trachea corrispondente tessuto applicata all'esterno dila trachea utilizzando dissezione smussa.
3. Rimuovere la laringe con un taglio trasversale appena sotto la cartilagine cricoide usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 1).
4. Rimuovere i rami bronchiali principali destro e sinistro con un taglio trasversale appena sopra la carena usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 2).
5. Premere delicatamente la trachea con una pinza sottile e lavare il lume 2-3 volte con circa 1 ml di balneazione L15 mezzo con un P1000 e P1000 Pipetman punta a cancellare qualsiasi muco e sangue.
6. Tagliare un segmento di anello 3-4 di trachea utilizzando un taglio trasversale con micro forbici dissezione (Figura 2B, linea 1).
7. Tagliare longitudinalmente attraverso il centro del muscolo trachealis di questo breve segmento trachea usando forbici micro dissezione (Figura 2B, linea 2).
8. Tagliare longitudinalmente attraverso il centro degli anelli di cartilagine tracheale con micro forbici dissezione (Figura 2C , riga), lasciando due sezioni di trachea tessuto adatto per l'imaging (sezione singolo illustrato nella Figura 2D).

4. Cilia Imaging

1. Trasferimento segmenti di tessuto trachea, lato lumen giù, sul centro di un mm con fondo di vetro piatto 35 cultura con 100-200 ml di L-15.
2. Per quantificare cilia flusso generato aggiungere una piccola quantità di microsfere fluorescenti 0,20 ìm alla L-15 bagnando il campione di tessuto trachea (~ 1 x 10 ¹¹ particelle / ml o 20 microlitri / ml della Fluoresbrite 2,5% sospensione acquosa microsfere).
3. Posizionare la camera di imaging preparato precedentemente (vedere Procedura di 1-3 sopra) in cima alla trachea campione silicone lato del foglio in basso, con il campione trachea situato nel centro della camera murato superficiale formata dal taglio finestra nella lastra di silicone (figura 1 ).
4. Premere delicatamente sul vetrino per fissare in posizione e rimuovere qualsiasi eccesso di L-15 supporti dai bordi usinga P1000 e P1000 punta Pipetman.
5. Montare il fondo di vetro cultura piatto 35 millimetri e il campione trachea su un microscopio invertito con ottica 100X oggettivi e DIC.
6. Utilizzando una macchina fotografica ad alta velocità e il software di acquisizione filmato raccoglie i film di ciglia motilità a + 200 fotogrammi al secondo lungo il ciliato epiteli tracheale del raggomitolati bordo del muscolo trachealis (box, e figura 2D Delineato: esempio ancora immagine da filmato registrato) (Movie supplementare 1).
7. Utilizzando FITC immagini epifluorescente e una luce CCD basso (Vedi elenco delle attrezzature di cui sopra), raccogliere i film di movimento microsfere fluorescenti sulla superficie degli epiteli tracheale ciliato per consentire successivamente la quantificazione delle ciglia flow generato (Movie integrativa 2).

5. Quantificazione di Cilia Motilità

1. Caricare DIC film imaged nel pacchetto software ImageJ e seguendo la tecnica descritta da Iain Drummond ¹³ utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea di trama che attraversa le ciglia battere. A "reslice" di questa linea genera un immagine tipo chimografo dove il movimento delle ciglia tutta la linea genera un modello di onda. Il numero di pixel tra ogni picco dell'onda è li misurati (un pixel = un fotogramma filmato) da cui è possibile calcolare il numero di battiti al minuto (cioè Hz).
2. Per misurare ciglia generato flussi di carico fluorescenti film tallone nel pacchetto software ImageJ, e usare il plugin MTrackJ ¹⁴ per tenere traccia manualmente perline fluorescenti sulla superficie della trachea epiteli e lasciare che il software genera velocità di perline e direzionalità per ciascuna sfera rintracciato.

Si deve prestare attenzione quando si utilizza perline fluorescenti per quantificare il flusso come la distanza tra le ciglia battere può influenzare fortemente il flusso misurato grandezza. Il movimento del tallone in Supplemental Movie 2 è un buon esempio di questo. In questo esempio beadmovimento è veloce alla superficie delle ciglia battere e riduce notevolmente spento per perline più lontano nei media balneazione. Per controllare per questo, perline tracciati dovrebbero essere raccolti solo ad una distanza fissa sopra la epiteli ciliato in tutti i campioni per permettere una comparazione corretta da fare. Infine, per ottenere dati rappresentativi sul flusso del fluido, sfere dovrebbero essere monitorati a lungo possibile, preferiamo usare tracce tallone che coprono 10 + cellule ciliate per calcolare il flusso del fluido.

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Risultati

Controllo ciglia delle vie aeree deve essere chiaramente visibile e visto da battere in modo coordinato (Movie Supplemental 1; la riproduzione del filmato è rallentato a tempo reale 15%), con un flusso notevole nella direzione di battito delle ciglia (Movie Supplemental 2; la riproduzione di film è al 100% tempo reale). Quantificazione dei film ciglia dovrebbe produrre risultati simili a quello visto in Figura 3. Raccolta di film DIC alta velocità rende possibile la ...

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Discussione

Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware ^13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l'importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin