הליך מיון כימי לGlucocorticoid איתות עם מערכת כתב דג הזברה הזחל בלוציפראז

Summary

אנו מתארים את ההליך וניתוח נתונים של מערכת כימית הקרנה לאיתות הורמון לחץ glucocorticoid באמצעות זחלי דג הזברה: assay תגובה Glucocorticoid בvivo דג הזברה בלוציפראז הפעילות (GRIZLY). Assay ברגישות ובאופן ספציפי מזהה השפעות על איתות glucocorticoid ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני.

Abstract

הורמוני לחץ glucocorticoid ונגזרים המלאכותי שלהם נמצאים בשימוש נרחב תרופות לטיפול בדלקת, אבל טיפול ארוך טווח עם גלוקוקורטיקואידים יכול להוביל לתופעות לוואי חמורים. יש צורך במערכות בדיקה כדי לחפש תרכובות רומן המשפיעות על איתות glucocorticoid in vivo או לקבוע לוואי בלתי רצוי של תרכובות במסלול איתות glucocorticoid. הקמנו assay דג הזברה מהונדס המאפשר המדידה של פעילות איתות glucocorticoid in vivo ו בזמן אמת, assay GRIZLY (Glucocorticoid תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות). Assay מבוסס לוציפראז מזהה השפעות על איתות glucocorticoid עם רגישות גבוהה וספציפיות, כוללים השפעות על ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לביצוע מסכי כימיים עם assay זה. אנו מתארים רכישת נתונים, נורמליזציה, וניתוח, הצבת דגש על בקרת איכות ונתונים להדמיה. Assay מספק readout פשוט, זמן נפתר, וכמותי. זה יכול להיות מופעל כפלטפורמה עצמאית, אבל גם לשלב בקלות לתוך זרימות עבודה הקרנת תפוקה גבוהה. יתר על כן הוא מאפשר ליישומים רבים מעבר להקרנה כימית, כגון ניטור סביבתי של משבשים האנדוקרינית או מחקר לחץ.

Introduction

גלוקוקורטיקואידים (GCS) הם הורמוני סטרואידים המיוצרים על ידי בלוטת יותרת הכליה אשר ממלאות תפקידים חשובים בתגובת הלחץ ובויסות חילוף החומרים ^1. GCS לאגד קולטני glucocorticoid cytoplasmic (GRS) של superfamily רצפטור הגרעיני אשר, על כריכה, translocate לתוך הגרעין ^2. כאן, הם יכולים למשל לדכא שעתוק על ידי הפרעה עם גורמים אחרים שעתוק (transrepression) או להפעיל את שעתוק הגנים באמצעות אלמנטי glucocorticoid תגובה (Gres, transactivation). בשל התכונות אנטי דלקתית שלהם, GCS הטבעי והמלאכותי נמצא בשימוש נרחב תרופות לטיפול במספר המחלות, כגון אסטמה או דלקת פרקים ^3. עם זאת, ובמיוחד שימוש לטווח ארוך של GCS יכול להוביל לתופעות לוואי קשים, כוללים סוכרת וגלאוקומה ^4. לכן, תרכובות רומן מיקוד GC איתות עם יעילות טיפול שעלול להיות מועילה יותר וסבילות הן מאוד מבוקשים ומאחוראה. חשוב מכך, השפעות יגנד נצפו בתאים בתרבית יכולות להיות שונות מאלו שראו בvivo ^5. תופעות כאלה עלולות תוצאות הטיה שהושגו עם תרבית תאים קונבנציונלית מבחני מיון תרופות מבוססות. הקרנת in vivo כימית כמו מופעל על ידי מודל דג הזברה הגיעה לאחרונה אל מוקד, שכן היא מאפשרת הקביעה של השפעות לא ניתן לגילוי בתא התרבות ^6,7.

יכולים גם להיות מושפעים מסלולי איתות הורמונלי על ידי מזהמים סביבתיים. כימיקלים שנקרא האנדוקרינית לשבש (EDCs) להשפיע על תהליכי הורמון מוסדר שונים ^8. לפיכך, רבייה והתמיינות מינית של אורגניזמים החיים במים יכולים להיות מווסתת על ידי חומרים עם פעילות דמוית אסטרוגן. לאחרונה, חששות הועלו, כי הפרעות מטבוליות עשויות להיות קשורות לEDCs בסביבה ^9. מסלול אחד הממוקד על ידי "שיבוש מטבולים" כזה הוא מסלול glucocorticoid, שגם היה מעורב בקסנוהשפעות biotics על התפתחות ותפקוד מערכת החיסון ^10,11. עם זאת, בהשוואה לכמות הגדולה של מידע נגיש בתרכובות מפריעות לפעולה הורמון סטרואידי מין, יחסית מעט מאוד ידוע על השפעות הפרעה אנדוקרינית בתיווך באמצעות GR. לכן, יש צורך בכלים המאפשרים ניטור השפעות של מזהמים על איתות GC in vivo.

דג הזברה כבר זמן רב מודל פופולרי בביולוגיה התפתחותית ולאחרונה גם משך חוקרים מתחומים אחרים, כולל אנדוקרינולוגיה ^12. בהשוואה לבעלי חוליות אחרות, מערכת איתות GC של דג הזברה היא דומה יותר לזה של יונקים, שכן הגנום דג הזברה מכיל רק גן אחד GR בניגוד לקולטנים המשוכפלים בהרבה מיני דגים אחרים ^13-15. בנוסף, הציר ההיפותלמוס, יותרת המוח, יותרת הכליה הוא כבר פונקציונלי בזחלי דג הזברה בן 5 ימים, אשר להגביר את ייצור GC אנדוגני בתגובה ללחצים ^14,16-18.

יש לנו לאחרונה שנוצרו קו מהונדס דג הזברה, GRE: לוק, המאפשר הניטור של פעילות איתות GC in vivo ו בזמן אמת ^18. שורת נושא מבנה גן כתב לוציפראז תחת שליטה של אמרגן מינימאלי TATA תיבה וארבעה GRES concatemerized (איור 1 א). פליטת אור מושרה GC ניתן למדוד מGRE אחת: זחלי לוק ב96 צלחות microtiter גם in vivo על פני תקופות זמן ממושכות. assay זה GRIZLY (עבור "תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות Glucocorticoid") ניתן להשתמש במספר תחומי מחקר שונים, כגון מחקר מתח, ניטור סביבתי, ומסכי תרופתיים ^18. היינו מסוגל לזהות את עליית אנדוגני בקורטיזול לאחר לחץ האוסמוטי מזחלים בודדים ויכולים לעקוב אחר ההתבגרות של התגובה בזמן פיתוח. יתר על כן, אנחנו יכולים לעקוב אחר ההשפעות על איתות GC של organotinים שדורשים metabolization ידי הזחל. חשוב מכך, הקו היה מסוגל לזהות את ההשפעות הללו בריכוזים רלוונטיים לסביבה. לבסוף, במסך טייס assay ברגישות ובאופן ספציפי זוהה תרכובות עם פעילות GC מספרייה כימית, כולל מתחם אחד שמגורה ייצור קורטיזול אנדוגני בזחלים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למסכים כימיים באמצעות assay GRIZLY.

Protocol

1. הכן את העבודה דילול של הספרייה הכימית

Predilute התרכובות של ספריית התרופה להיבדק (לדוגמא ה-FDA אישרה תרופות, ENZO מדעי חיים) לE3 (5 mM NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl ₂₎ עם תחנת טיפול נוזל רובוטית (למשל multiprobe השני, 8 מחטים עם מתאם קצה לרשות, PerkinElmer). ריכוזים מתאימים 40 / מיליליטר מיקרוגרם לדוגמא בDMSO 3%, אבל זה יהיה תלוי בסוג של ספרייה בשימוש. הגדרות multiprobe השניה המקבילות לשלבים המתוארים להלן מפורטות בטבלת 1. הפרוטוקול המתואר בטבלה מאפשר ההכנה של ארבע צלחות aliquot במקביל.

1. פיפטה 10 aliquots μl של מניית הספרייה (2 מ"ג / מיליליטר בDMSO) לצלחות עמוקות היטב (למשל פלייט 96, גם חפצים, סיבוב ובכן, 0.8 מיליליטר, ABgene). עמודות 1 ו 12 יש להשאיר ריקות - כל אלה יקבלו את הפקדים בתוך הצלחת החיוביות ושליליים.
i> לוותר 490 μl של E3 עם DMSO 1% לaliquots מוכנים של הספרייה עם multiprobe השני. דילול מתבצע במחטים קבועות בלי עצות לרשותו.
2. הוסף 10 μl של DMSO לעמודה 1 ו10 μl של פתרון dexamethasone 5 מ"מ (DMSO) לעמודה 12 כפקדים בתוך הצלחת. הריכוז של DMSO בכל הבארות הוא כעת 3%, ריכוז dexamethasone בבארות ביקורת החיוביות הוא בE3 / 3 DMSO% 100 מיקרומטר.
3. חותם את הצלחת עם סדיני איטום דבקים DMSO עמיד. אחסן את הצלחות ב-80 ° C עד שימוש.

2. רבייה של דגי Reporter

איסוף עובר מהשרצה טבעית של הזדווגויות בין קבוצת GRE: דג מהונדס לוק. להעלות את העוברים (לא יותר מ 60) ב9 סנטימטר צלחות פטרי המכילות בינוני E3 בתוספת 1 מ"ג / מיליליטר של מתילן הכחול פטריות עד 4 ימים לאחר הפריה (DPF) בחממה ב28 ° C. שנה בינונית E3 באופן קבוע.

כותרת "> 3. הכנת בלוציפראז בינונית (E3L)

הכן את פתרון מניות וציפרין מימית של 50 מ"מ על ידי הוספת DH ₂ O לבקבוקון המכיל אבקת וציפרין. פתרון מניות זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לדלל את מניות וציפרין לתוך מדיום E3 לריכוז סופי של 0.5 מ"מ להשיג בינוני E3L.

4. הפץ זחלים ל96 צלחות גם

1. הכן טיפים פיפטה 1 מיליליטר עם שעם רחב על ידי ניתוק כ 5 מ"מ של הקצה ובקצרה בוער קצוות החדים.
2. זחלי בריכה מכמה צלבים על ידי שפיכה אותם בזהירות מצלחות פטרי לתוך כוס. קציר על 50 זחלים בכל פעם על ידי בעדינות לשפוך אותם על גבי מסננת (גודל נקבובית של 0.25 בקוטר מ"מ) ומניח מייד את המסננת לתוך צלחת פטרי קטנה (בקוטר 5.5 סנטימטר) מלאות בינוני E3L.
3. עם קצה פיפטה שעמם רחב, להעביר 225 μl של מדיום המכיל זחל אחד בכל לבארות לבנה96 צלחת היטב (OptiPlate, PerkinElmer).
4. לאטום את הצלחות עם גיליונות איטום דבק (למשל TopSeal-, PerkinElmer) ודגירה אותם 28 מעלות צלזיוס למשך לילה. preincubation זה מונע הקלטה של שינויים זמניים בפליטת אור מייד לאחר תוספת של וציפרין, תופעה המתרחשת גם בתאים בתרבית ^19.

5. טיפול תרופתי

1. הסר את הצלחת המכילה דילול העבודה של הספרייה מ-80 ° C במקפיא כ -4 שעות לפני השימוש. בעדינות מערבולת הצלחת ומסובב אותו לזמן קצר בצנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצלחת.
2. הסר גיליונות איטום דבק מצלחות הזחלים.
3. עם מכשיר pipetting 96 ערוץ מופעל ביד (למשל מפרק, סטיינברנר) פיפטה פתרון התרופה למעלה ולמטה 3 פעמים. אז aliquot 25 μl של דילול העבודה של הספרייה הכימית לתוך הבארות המכילות את הזחלים (עם הדוגמא לעיל, זהתוצאות בריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מיליליטר בE3 עם 0.3% DMSO). הכן 10 (מינימום: 5) צלחות העתק עם זחלים לכל צלחת ספרייה.
4. לאטום את הצלחות עם גיליונות האיטום דבקים ולתייג את כל צלחת עם מדבקה ברקוד.

6. הקלטת הארה

1. שים את הצלחות המכילות את הזחלים ליחידות לערום של קורא לדמיין פליטת אור ברגישות הארה משופרת (PerkinElmer). לחלופין, להשתמש במערכת חממת robotized כגון אלה המועסקים במערכות הקרנת תרבית תאים של יונקים בשילוב עם הקורא.
2. שיא פליטת אור במשך יומיים תוך שימוש בהגדרות קורא מקבילים לאלו המתוארים בטבלה 2 לקורא לדמיין. להתאים את מספר חזרות assay למספר הצלחות בטווח כדי להתאים את זמן הריצה הנדרש.
3. לאחר סיום הריצה, לבדוק את הצלחות לנוכחותם של זחלים מתים כדי להעריך את הרעילות כללית של compounds.

7. ניתוח נתונים

כל ניתוח הנתונים מתבצע בR סביבת תכנות הסטטיסטי באמצעות סקריפטים מותאמים אישית.

1. חישוב AUC
   על מנת לזהות תרכובות הפעלת GC איתות ללא קשר למאפייני הקינטית שלהם, לקבוע את השטח מתחת לעקומה (AUC) של העקבות נרשמו הארה (ספירות גלם פליטת אור לעומת זמן) כפרמטר ההקרנה. AUCs הם מקורבים לשלטון הטרפז (ראה 2a דמויות ו').
2. נורמליזציה
   התחבר להפוך את ערכי AUC כדי להבטיח נורמליות גבוהה יותר של נתונים (2b דמויות וב '). ואז לנרמל את ערכי AUC היומן הפך לכל צלחת ספרייה עם שיטת Z-הציון החזקה (ראה ^20). נורמליזציה התוצאה היא ערכים המייצגים את מספר סטיות תקן מהממוצע של כל נקודות הנתונים. בדרך זו,שגיאות שיטתיות, כגון השתנות בין ריצה, יוסרו מן הנתונים. כעת ניתן דמיינו את הנתונים על ידי התוויית Z-הציון הממוצע חזק של העתקים לכל טוב (2c הדמויות וג ').
3. מדדי איכות
   1. Heatmap
      על מנת להמחיש את ההשפעות צלחת קשורה, להתוות את הנתונים עבור כל צלחת כמו Heatmap באמצעות למשל פונקצית heatmap.2 של חבילת gplot ^21. בדרך זו, ניתן לאתר השפעות קצה או לשאת על מתחם בקלות (לדוגמא להשוות איור 3 א עם 3 ב). תכלול צלחות תת אופטימליות מניתוח נוסף.
   2. עקומת ROC
      כדי לקבוע את רגישות וסגוליות של assay, לחשב מקלט הפעלה למשל עקומה אופיינית (ROC) בעזרת חבילת BioConductor ROC ²² באמצעות ערכי Z-הציון שנקבעו ב( איור 3c) 7.2. בהמשך לכך, לקבוע את AUC של מ"ק זהRVE. ערך AUC קרוב ל -1 מצביע על רגישות גבוהה וספציפיות של assay.
4. הכה זיהוי
   כדי לייעל את ערך החתך לזיהוי של חומרים פעילים, לקבוע מדד Youden. כדי לחשב את המדד, יש להפחית את השיעור החיובי האמיתי המוערך (TPR) מהשיעור החיובי הכוזב (FPR) של עקומת ROC להגדלת ערכי חתך Z-ציון חזקים. קח Z-הציון חזק עם Youden המדד הגבוה ביותר (TPR מינוס FPR) כנקודת החתך. ניתן להעריך TPR / FPR על ידי זיהוי של בארות ביקורת חיוביות או של חומרים פעילים ידועים בספרייה. בעת השימוש בבקרה חיובית בארות לוודא שהם תואמים את כוח הלהיט הצפוי.

8. Retesting

1. להעריך מחדש את תרכובות להיט חיוביות על ידי טיפול בזחלים עם דילולים סדרתי של התרכובות המתקבלות מספק שונה, תוך שימוש באותה ההקלטה ההגדרה שתוארה לעיל. להיטים אמיתיים צריכים לגרום להארהסימפוני בassay זה, באופן אידיאלי באופן תלוי מינון.

תוצאות

בפרסום קודם ^18, אנו הוקרנו ספרייה של 640 תרופות FDA במסך טייס כדי להעריך את הביצועים של assay GRIZLY. ספרייה זו הכילה 12 תום לב GCS, ובכך מאפשר לנו לקבוע מדדי איכות לרגישות וסגוליות של assay.

איור 2 מראה דוגמאות טיפוסיות של ניתוח נתונים הגולמי והנורמליזציה נלקחה מהמסך הזה. תוצאה אופיינית משליטת dexamethasone גם מתוארת באיור 2 א, הממחישה את המידע הזמני שניתן על ידי נתונים. שיא בפליטת אור המתרחש בכ -12 שעות לאחר הטיפול יורד באיטיות על פני הבא 36 שעות של מדידה. איור 2 א 'מדגיש את הקירוב לערך AUC בשיטת הטרפז. חישוב זה מתבצע עבור כל הבארות וכל חוזר טכני. התוצאה של השינוי ביומן מוצגת איורים 2b </ Strong> וב '. הנה הממוצע של הבקרות החיוביות מותוות בעלילה QQ נורמלית. התחבר שינוי מוביל לקירוב רב יותר של נקודות נתונים לערכים מתפלגים נורמלי התיאורטי שצוינו על ידי האלכסונים האדומים. שינוי כדי להשיג את הנורמליות של הנתונים מגביר את הכוח הסטטיסטי של הניתוחים שלאחר מכן. לבסוף, 2c הדמויות ו2c 'להראות את ההשפעה של נורמליזציה Z-ציון חזק בהשתנות צלחת לצלחת: ערכי הבסיס השונים שהושגו עם צלחות שונות (איור 2 ג) הם מנורמלים בעלילת Z-הציון החזקה באיור 2 ג'.

ערכי Z-הציון חזקים יכולים לשמש כדי לזהות טעויות שיטתיות בנתונים על ידי הדמיה ההפצה של הלהיטים על פני הצלחות. איור 3 א מציגה דוגמא אחת לHeatmap של צלחת ספרייה, שבו Z-הציון חזק valUES הם זממו בצבעים לתפקידים טובים. אפשר בקלות מזהה עמודה 12 עם הבקרות חיוביות בצלחת. תרכובות ספריית ניקוד חיוביות נראות בF8 היטב ו, אם כי חלש יותר, 3 ב E2. איור מראה צלחת שבטעות שיטתית היא הווה. אחד מציין סדרה של תרכובות עם ירידה בערכי Z-ציון בשורות ו-E על פני כמה עמודים. אף אחת מהתרכובות בבארות אלה נבדק חיוביים בבדיקה מחדש. מאז הבארות עם פעילות מבחן זה של פחיתת GRIZLY ממוקמות לאורך שביל רובוט pipetting לוקח כאשר aliquoting צלחות הספרייה, תבנית זו מעידה על לשאת על של מתחם חיובי במהלך תהליך pipetting האוטומטי.

הנורמליזציה Z-הציון החזקה יחד עם הנוכחות של GCS הידוע בספרייה גם אפשרה לנו לחשב מקלט הפעלת עקומה אופיינית (ROC) עבור המסך ^18. איור 3 ג מציג עלילה של אסתיהזדווגו שיעור חיובי אמיתי נגד השיעור החיובי הכוזב המשוער לערכים חזקים שונים Z-ציון חתך. השיעור החיובי האמיתי המוערך מוגדר כאחוז מלהיטים חיוביים אמיתיים (כאן, גלוקוקורטיקואידים הידוע כיום בספרייה) הנמצאים בשווי חזק ניתנה Z-ציון חתך. השיעור החיובי הכוזב המוערך המקביל מצביע על אחוז של תרכובות שאינן חיוביות פגע בשווי חתך זה. AUC של עקומה זו הוא 0.95, מה שמעיד על רגישות וסגוליות גבוהות של המסך וביצועי assay מצוינים. עקומת AUC שימשה גם כדי להעריך את ערך החתך האופטימלי לזיהוי להיט על ידי חישוב מדד Youden לZ-ציונים חזקים שונים. אנחנו זיהינו את Z-הציון חזק של 1.49 כבעל מדד Youden הגבוה ביותר. ערך חתך זה מופיע באיור 2 ג 'כקו שחור שהפריד בין הלהיטים מחלק הארי של התרכובות.

במסך שלנו^18, הצלחנו לזהות GCS כמעט כל הידוע קיים בספרייה. רק שלוש מ12 GCS בתום הלב לא התגלו. במקרה של אצטט melengestrol, זה היה ממצא שלילי כוזב, שכן מתחם זה נמצא חיובי בבדיקה מחדש בריכוז גבוה יותר מזה המשמש בספרייה. שני GCS האחר היו שלילי גם בבדיקה החוזרת. Corticosterone הוא GC הגדול במכרסמים, אך לא בדגים או בני אדם ^1, בעוד פרדניזון prodrug לא יכול להיות חילוף חומרים היטב על ידי מערכת הזחל. מעניין, גם שתי תרופות שאינן מבוארות כGCS זוהו במסך, מתוכם אחד לא יכול להיות מאושרת בבדיקה מחדש (ספירונולקטון, אנטגוניסט לרצפטור mineralocorticoid). המתחם האחר, pregnenolone, הוא מבשר ביוסינתזה סטרואידים, אשר מומרת לקורטיזול מבלוטת יותרת הכליה. ואכן, טיפול עם pregnenolone מגורה ייצור הקורטיזול בזחלים ^18. כל תוצאות אלה מאשרות את ביצועים גבוהיםormance של assay: רק אחד שלילי כוזבת ומתחם אחד חיובי כוזב היו בין תוצאות המסך הראשי, ו10 של 11 תרכובות אישרו עם פעילות גירוי איתות GC כבר זוהו במסך הראשי.

איור 1. עיקרון כללי של assay ואת זרימת עבודה של הליך המיון.) תכנית של לבנות כתב assay GRIZLY. ביטוי לוציפראז (צהוב) נשלט על ידי אמרגן מינימאלי _(דקות P, כתום) וארבעת אלמנטי GRE concatemerized ((GRE) _4, לבן), שמאוגדים על ידי homodimers GR-הופעל ליגנד (GR, כחול). תיבות אדומות מצביעות אתרי transposase Tol2 המאפשרים אינטגרציה של המבנה לתוך הגנום. התיבה הוורודה מייצגת אתר poly-adenylation (PA). זחלים הטרנסגניים שנשאו קון זהstruct ממוקמים בצלחות microtiter גם 96 אטומות למדידות פליטת אור. ב) ערכה של תגובת לוציפראז. בלוציפראז מזרז החמצון של Luciferin לoxyluciferin, מה שמוביל לפליטת אור (hν). התגובה דורשת גם ה-ATP וMg ^{2 +,} הניתן על ידי הזחל. _אני PP, זרימת העבודה pyrophosphate. ג) של המסך. דילולים מניית עבודה מוכנים מן ה-FDA אישרה תרופה בספריית 96 צלחות היטב, עמודה אחת המכילה שלילית בתוך צלחת שליטה (DMSO בלבד, ירוק) ועמודה אחת המכילה ביקורת חיובית (דקסאמתאזון, אדום) (עיצוב ספרייה). GRE: זחלי לוק מופצים ב96 צלחות היטב (5-11 משכפל) וטופלו בתרכובות הספרייה (יישום תרופה). עקבות פליטת אור נרשמות עם קורא פליטת אור במשך יומיים (איסוף נתונים). עקבות פליטת אור משולבים (חישובי AUC), להיכנס והפכתי Z-ציון חזק מנורמל (normaliלאספקה). נתונים מנורמלים משמשים לקביעת מדדי איכות ולזיהוי להיט (ניתוח נתונים). להיטים נבחרו נבדקים מחדש לפעילות תלוית מינון בassay (החוזר). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. ניתוח נתונים מאויר עם נתונים ממסך של ה-FDA אישרה תרופת ספרייה. א) עקבות נציג מביקורת חיובית כן. ') השטח מתחת לעקומה (AUC) מקורב לשלטון בצורת הטרפז. הטרפזים המשמשים לחישוב מוצגים בגוונים שונים של אדום. ב) עלילה רגילה QQ של ערכי גלם AUC של הבארות החיוביות שליטה (ציר y) לעומת אוכלוסייה (ציר x נורמלי סטנדרטי) לפני שינוי היומן. ב ' ) עלילת QQ נורמלית של ערכי AUC לאחר שינוי היומן. התפלגות נורמלית הוא הצביע על ידי הליניאריות של נקודות נתוני היומן השתנה. מגרש ג) ליומן הפך הנתונים גולמיים לכל נבדק במסך התרכובות. מגרש אפור, כל התרכובות האחרות ג ') של נתוני מסך לאחר נורמליזציה Z-ציון חזק; כחול, גלוקוקורטיקואידים בתום לב.. שגיאות שיטתיות כגון וריאציות בין צלחת הוסרו מהנתונים. קווים אדומים מציינים את הממוצע ± SEM של חיובי בקרות בתוך הצלחת. קו שחור: פגע ערך חתך זיהוי כפי שנקבע על ידי אופטימיזציה של Youden המדד (איור 3). לשכפל באישור ^מ14 2012 ACS. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

0439fig3.jpg "/>
איור 3. תוצאות מסך. א) Heatmap של תוצאות מסך. ערכי Z-ציון חזק של תרכובות ספרייה הם זממו לעמדות גם בהתאמה. הביקורת החיובית בטור 12 כמו גם שני מתחמי להיט חיוביים בבארות F8 וE2 גלויות. ב) Heatmap של צלחת מראה לשאת על של מתחם חיובי במהלך הכנת ספרייה עם רובוט pipetting. שיפוע של פעילות גלוי לאורך שביל pipetting נלקח על ידי הרובוט. ג) מקלט הפועל עקומה אופיינית (ROC) עבור המסך. השיעורים מוערכים נכונים החיוביים (ציר y השמאלי) ושווא השיעורים חיוביים (ציר x) הם זממו להגדלת ערכים חזקים Z-ציון חתך (מקודד לפי צבע, ציר y ימני). ערך AUC של העקומה וכתוצאה מכך הוא קרוב ל -1, המעיד על ביצועי assay טובים. תרכובות לוח לשכפל באישור ^מ14 2012 ACS. ד) מראה פעיל (Yellow) או לא פעיל (כחול) במסך הראשי (prim.) או במבחן החוזר. גלוקוקורטיקואידים בתום לב לא תמיד להערכה מחדש (לבן). מצויר מחדש באישור ¹⁴ 2012 ACS. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

הגדרות כלליות:
שלב 1.1
נוהל	סוג:	נוזל אחת
	מצב:	נשיפה
	מחלק לכל לשאוב:	1
	אופטימיזציה עבור מהירות:	כן
	מערכת פערי אוויר:	10 μl
	תחבורה:	0
סומק / לשטוף	לא
לשאוב	סוג של הגדרה	ערך	הערות
	עמדה	B7, B10, B13, B16
	לשאוב Vol.	10 μl
	מהירות	200 μl / sec
	מעקב נוזלי	60%
	גובה לשאוב	ברירת מחדל מעבדתי	22.28
לחלק	סוג של הגדרה	ערך	הערות
	עמדות	D7, D10, D13, D16
	לוותר Vol.	10 μl
	מהירות	200 μl / sec
	מעקב נוזלי	100 μl
	לוותר על גובה	ברירת מחדל מעבדתי	17.01
שלב 1.2
נוהל	סוג:	מגיב
	מצב:	פסולת
	מחלק לכל לשאוב:	3
	אופטימיזציה עבור מהירות:	כן
	מערכת פערי אוויר:	15 μl
	תחבורה:	0
סומק / לשטוף		לא
לשאוב	סוג של הגדרה	ערך	הערות
	עמדה	A4
	לשאוב Vol.	3 x 490 μl
	פערי אוויר	15 ו0
	מהירות	200 μl / sec
	מעקב נוזלי	400%
	גובה לשאוב	פני נוזל
לחלק	סוג של etting	ערך	הערות
	עמדה	D7, D10, D13, D16
	לוותר Vol.	490 μl
	פערי אוויר	15 ו0
	מהירות	200 μl / sec
	מעקב נוזלי	100%
	לוותר על גובה	ברירת מחדל מעבדתי	17.01

טבלת 1. הגדרות עבור multiprobe השני. הפרוטוקול בטבלה 1 מתאר את ההכנה של 4 צלחות (כל 96 בארות). הצלחות ממוקמות על מתאמי צלחת באזור עובד בתפקידים שצוין על ידי הרובוט (B7 למשל, B10, B13, B16).

1 "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> הגדרות כלליות: מספר חזרות assay תלוי באורך של הריצה מספר הצלחות בלתי מוגבל בקרת טמפרטורה 28 ° C פרוטוקול חישובים לום ארה"ב 96 (CPS) לקרוא זמן מדידה 2.5 שניות תיקון crosstalk מרחק בין צלחת וגלאים 0 מ"מ זוהר גורם תיקון (CT2) 0% תוכן "> הגדרות Envision טבלה 2. משמשות למסך.

Discussion

אנו מציגים כאן את העבודה וניתוח נתונים עבור מסך כימי מדידת פעילות GC in vivo באמצעות assay GRIZLY ^18. יש assay מאפייני בקרת איכות ומדדי ביצוע שניתנים להשוואה עם מסכי סלולריים מבוסס קונבנציונליים, יתרון חשוב עבור השימוש בו בהגדרות תפוקה גבוהה. בנוסף לכך, עם זאת, vivo assay במזהה גם תרכובות שאינן נגישים במבחנת מסכים. זה בא לידי ביטוי על ידי הנוכחות של pregnenolone prohormone בין הלהיטים. לפיכך, assay GRIZLY מרחיב את היקף מסכי שמטרת פעילות איתות GC.

החשיבות של זיהוי של in vivo אפקטים עם assay שלנו באה לידי ביטוי גם בתוצאות שהשגנו עם DBT מזהמי organotin וTBT ^18. DBT, אבל לא TBT, הוכח לעכב איתות GC בתרבית תאים של יונקים, ואנו נצפו באותו בתרביות תאי דג הזברה לבטאing GRE: כתב לוק. חשוב לציין עם זאת, בassay GRIZLY, TBT הראה פעילות מעכבת על מסלול GC, כפי שהוא יכול להיות מומר לDBT על ידי חילוף החומרים הזחל. עיכוב זה נצפה כבר בריכוזים רלוונטיים לסביבה של TBT. תוצאות אלה נוספות להמחיש את הפוטנציאל של assay GRIZLY באיתור תופעות מורכבות, המבוססות על שיחה צולבת וחילוף חומרי שינויים בין אורגן של התרכובות בחי. הם גם מדגישים את פוטנציאל היישום של assay GRIZLY לניטור סביבתי. לפיכך, ניתן ללמוד אפקטי משבש אנדוקריני ברמה של איתות קולט, שבו המשבש מפריע לפעילות איתות GC הנגרמת על ידי אגוניסט GR כגון dexamethasone. אפשרות נוספת היא ללמוד השפעות מתחם על סינתזת GC-מגורה pregnenolone. איכות התפוקה הגבוהה של assay צריכה להתיר את ההקרנה המהירה של ספריות מדגם סביבתי.

השימוש בלוציפראז כמו arגן eporter מאפשר טווח דינמי גבוה של זיהוי של איתות פעילות ^23. ואכן, הרגישות של assay מאפשרת לזהות ייצור GC-Induced מתח האוסמוטי מזחלים בודדים ^18. הרזולוציה הגבוהה הזמנית שהושגה עם הכתב בלוציפראז מאפשרת לנו לעקוב אחר פעילות איתות לאורך זמן, מה שהופך אותו ניתן לנתח גם קינטיקה של נתונים.

חסרון פוטנציאלי עבור יישומים מסוימים הוא התאמתו המוגבלת לניטור המרחבי של מערכת הכתב הזה. מערכות כתב ניאון עשויות להיות מתאימות יותר עבור מבחני הדורשים ניטור של אזורים מסוימים של הזחלים. עם זאת, מבחני כאלה עלולים לסבול מרגישויות נמוכות יותר בשל השפעות רקע הנגרמות על ידי אור העירור, שגם מציב מגבלות על זיהוי של תרכובות ניאון. בנוסף, הם עשויים לספק פחות רזולוציה הקינטית בגלל היציבות בדרך כלל גבוהה יותר של חלבוני ניאון ^23.יתר על כן, הם מציגים את האתגרים במונחים של ציוד הדמיה, ניתוח נתונים ואחסון נתונים שעשויים להגביל את השימוש בם למעבדות מחקר קטנות יותר.

ההגדרה של assay GRIZLY כassay המבוסס צלחת microtiter מאפשרת אינטגרציה קלה לתוך זרימות עבודה הקרנה טיפוסיות. Assay הוא ישים בקלות גם במעבדות מחקר קטנות יותר כתוצאה מהטיפול שלה פשוט וניתוח נתונים. במקביל, היא מאפשרת למידה ניכרת של אוטומציה, למשל אוטומטית יישום תרופה על ידי pipetting רובוטים או הפצה אוטומטית של עוברים על ידי מכשירי עובר מיון ^24,25. את ההודעה הפשוטה אינו דורש מיקרוסקופים הקרנה אוטומטיים או תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת, ועם זאת מספקת מערך עשיר של נתונים על היבטים של זמן וכמותי של מסלול האיתות למד.

לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לassay הקרנה כימית זול יחסית, חזק וקל לידית לGCאיתות פעילות in vivo ובזמן אמת. Assay מאפשר קביעת in vivo השפעות של תרכובות בGC איתות לא ניתן לגילוי בתרבית תאים מבוסס מבחני. למשל הקביעה של השפעות גנטיות על איתות glucocorticoid, ניטור סביבתי של השפעות משבש אנדוקריני על סינתזת glucocorticoid ואיתות פעילות, וההקרנה של תרכובות להשפעות לא רצויות על איתות GC או לרומן במאפנני vivo מכך, בין יישומים רבים עבור assay הם מסלול איתות חשוב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2
Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe