Eine Stoff Screening Verfahren für die Glucocorticoid-Signalisierung mit einem Zebrafisch-Larve Luciferase-Reportersystems

Zusammenfassung

Wir beschreiben das Verfahren und die Analyse der Daten aus einer chemischen Screening-System für Glukokortikoid-Stress-Hormon-Signalisierung unter Verwendung von Zebrafisch-Larven: Die Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität (Grizly)-Assay. Der Test sensitiv und spezifisch erkennt Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung durch Verbindungen, die Metabolisierung verlangen oder beeinflussen endogene Glucocorticoid-Produktion.

Zusammenfassung

Glucocorticoid Stresshormone und deren Derivate sind künstliche häufigsten verwendeten Medikamente zur Behandlung von Entzündungen, aber langfristige Behandlung mit Glukokortikoiden kann zu schweren Nebenwirkungen führen. Testsysteme benötigt werden, um neue Verbindungen zu beeinflussen Glucocorticoid-Signalisierung in vivo zu suchen oder um unerwünschte Wirkungen von Verbindungen auf die Glucocorticoid-Signalweg zu bestimmen. Wir haben eine transgene Zebrafisch-Test, der die Messung von Glukokortikoid-Signalaktivität in vivo und in Echtzeit ermöglicht gegründet, die Grizly-Assay (Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität). Die Luciferase-Assay weist basierend Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung mit hoher Sensitivität und Spezifität, einschließlich der Effekte durch Verbindungen, die Metabolisierung verlangen oder beeinflussen endogene Glucocorticoid-Produktion. Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll für die Durchführung chemischer Bildschirme mit diesem Test. Wir beschreiben die Datenerfassung, Normalisierung undAnalyse, indem ein Fokus auf Qualitätskontrolle und Datenvisualisierung. Der Assay stellt eine einfache, zeitaufgelösten und quantitative Anzeige. Sie kann als Stand-Alone-Plattform betrieben werden, sondern ist auch einfach in Hochdurchsatz-Screening Abläufe integriert. Es ermöglicht darüber hinaus für viele Anwendungen, die über chemische Screening, wie die Umweltüberwachung von endokrine Disruptoren oder Stressforschung.

Einleitung

Glukokortikoide (GCs) sind Steroidhormone durch die Nebenniere, die bei der Stressantwort und in der Regulation des Stoffwechsels eine wichtige Rolle spielen ¹ produziert. GCs binden zytoplasmatischen Glucocorticoid-Rezeptoren (GRs) des Kernrezeptor-Superfamilie, die bei der Bindung, Translokation in den Kern ^2. Hier können sie zum Beispiel die Transkription durch Eingriffe mit anderen Transkriptionsfaktoren (Transrepression) oder aktivieren Gen-Transkription über Glucocorticoid-Response-Elemente (GREs, Trans). Aufgrund ihrer anti-inflammatorischen Eigenschaften werden sowohl natürliche als auch künstliche GCs in der Behandlung einer Reihe von Krankheiten, wie Asthma oder Arthritis ³ verwendeten Medikamente. Allerdings können vor allem langfristige Nutzung von GCs zu schweren Nebenwirkungen führen, einschließlich Diabetes und ^Glaukom-4. Daher werden neue Verbindungen gezielt GC-Signalisierung mit potentiell vorteilhafte Behandlung Effizienz und Verträglichkeit sehr begehrt achternäh. Wichtig ist, dass in kultivierten Zellen beobachtet Ligandeneffekte von den ^in-vivo-5 gesehen unterscheiden. Solche Effekte könnten Befunden mit konventionellen Zellkultur erhalten Pharma-Screening-Assays. Chemische In-vivo-Screening, wie durch die Zebrafisch-Modell aktiviert wurde vor kurzem in den Fokus gerückt, da es erlaubt die Bestimmung der Auswirkungen nicht in der Zellkultur ^6,7 nachweisbar.

Hormonelle Signalwege kann auch durch Umweltschadstoffe beeinträchtigt werden. So genannte endokrin wirksame Substanzen (EDC) beeinflussen verschiedene Hormon reguliert Prozesse ^8. So kann die Wiedergabe und sexuelle Differenzierung von Wasserorganismen durch Substanzen mit Östrogen-ähnliche Aktivitäten moduliert werden. Kürzlich wurden Bedenken laut, dass Stoffwechselstörungen könnten EDZ in der Umwelt ⁹ verbunden werden. Ein Weg durch solche "Stoffwechselstörungen" gezielte ist der Glucocorticoid-Weg, der auch in xeno gebracht wurdeAntibiotika Auswirkungen auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems ^10,11. Doch im Vergleich mit der großen Menge an verfügbaren Informationen über Verbindungen stören Sexualsteroidhormonwirkung, relativ wenig über Störungen des Hormonhaushalts über die GR-vermittelte bekannt. Daher Werkzeuge benötigt werden, die Auswirkungen auf die Überwachung von Schadstoff GC-Signalisierung in vivo ermöglichen.

Der Zebrafisch ist seit langem ein beliebtes Modell in der Entwicklungsbiologie und hat vor kurzem zog auch Forscher aus anderen Bereichen, einschließlich Endokrinologie ^12. Im Vergleich zu anderen Knochenfischen, ist die GC-Signalisierungssystem des Zebrafisches, das jenem von Säugetieren, da die Zebrafisch-Genom enthält nur eine GR-Gens im Gegensatz zu den duplizierten Rezeptoren in vielen anderen Fischarten ^13-15. Darüber hinaus ist der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse bereits funktional in 5 Tage alten Zebrafischlarven, die endogene GC-Produktion als Reaktion auf Stressoren erhöhen ^14,16-18.

Wir haben kürzlich erzeugten eine transgene Zebrafisch-Linie, GRE: Luc, die für die Überwachung der GC-Signalaktivität in vivo und in Echtzeit ¹⁸ ermöglicht. Die Leitung ein Luciferase-Reportergen-Konstrukt unter der Kontrolle eines minimalen TATA-Box-Promotor und vier concatemerized GRE (Abbildung 1a). GC-induzierte Biolumineszenz können zwischen Einzel-GRE gemessen werden: Luc Larven in 96-Well Mikrotiterplatten in vivo über längere Zeiträume. Diese Grizly Test (für "Glucocorticoid Responsive In-vivo-Zebrafisch-Luciferase-Aktivität") in einer Reihe von verschiedenen Forschungsfeldern, wie beispielsweise Stressforschung, Umweltüberwachung, Bildschirme und pharmakologische ¹⁸ verwendet werden. Wir waren in der Lage, die körpereigene Cortisol-Anstieg nach der osmotischen Stress von einzelnen Larven erkennen und könnte die Reifung der Reaktion während der Entwicklung zu folgen. Außerdem konnten wir die Wirkungen von GC Signalisierungs zinnorganischer überwachens, die Metabolisierung von der Larve erfordern. Wichtig ist, war die Linie in der Lage, diese Effekte bei umweltrelevanten Konzentrationen zu erkennen. Schließlich wird in einem Pilot Bildschirm der Test sensitiv und spezifisch nachgewiesen Verbindungen mit GC-Aktivität aus einer chemischen Bibliothek, darunter eine Verbindung, die körpereigene Cortisol-Produktion in den Larven stimuliert. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll für die chemische-Bildschirme mit der Grizly-Assay.

Protokoll

1. Bereiten Arbeitsverdünnung der chemischen Bibliothek

Vorzuverdünnen die Verbindungen der Drogen Bibliothek getestet werden (z. B. FDA zugelassenen Medikamente, Enzo Life Science) in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂₎ mit einem Roboter-Liquid-Handling-Station (zB Multiprobe II, 8 Nadeln mit Entsorgung Spitzenadapter, PerkinElmer). Geeignete Konzentrationen sind z. B. 40 &mgr; g / ml in 3% DMSO, aber dies hängt von der Art der verwendeten Bibliothek ab. Die Multiprobe II Einstellungen entsprechend den unten beschriebenen Schritte sind in Tabelle 1 angegeben. Die in der Tabelle beschriebenen Protokoll ermöglicht die Herstellung von vier Aliquots Platten parallel.

1. Je 10 ul Aliquots der Materialbibliothek (2 mg / ml in DMSO) in Deep-Well-Platten (z. B. 96-Well-Platte Aufbewahrung, Rund Nun, 0,8 ml, ABgene). Spalten 1 und 12 sollte leer gelassen werden - diese werden die positiven und negativen Kontrollen innerhalb Platte erhalten.
i> Dispense 490 ul der E3 mit 1% DMSO in die vorbereiteten Teilmengen der Bibliothek mit der Multiprobe II. Die Verdünnung wird mit festen Nadeln ohne Entsorgungs Tipps durchgeführt.
2. Werden 10 ul DMSO in die Säule 1 und 10 ul einer 5 mM Dexamethason-Lösung (in DMSO) auf Spalte 12, wie in Platte steuert. Die DMSO-Konzentration in allen Vertiefungen nun 3%, die Dexamethason-Konzentration in den positiven Kontrollvertiefungen 100 uM in E3 / 3% DMSO.
3. Verschließen Sie die Platte mit DMSO beständigen Klebstoff Dichtungsbahnen. Speichern die Platten bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Zucht von Fisch-Reporter

Sammle Embryonen aus natürlichen Laich der Gruppe Paarungen zwischen GRE: Luc transgene Fische. Heben Embryonen (nicht mehr als 60) in 9 cm Petrischalen mit E3-Medium mit 1 mg / ml der Methylenblau Fungizid ergänzt bis 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) in einem Brutschrank bei 28 ° C. Ändern E3 Medium regelmäßig.

Titel "> 3. Vorbereitung der Luciferase-Medium (E3L)

Bereiten Sie eine wässrige Lösung von Luciferin Lager 50 mM durch Zugabe von dH ₂ O, um das Fläschchen mit dem Luciferin Pulver. Diese Stammlösung kann bei -80 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Verdünnen Sie die Luciferin Lager in E3 Medium zu einer Endkonzentration von 0,5 mM bis E3L Medium zu erhalten.

4. Verteilen Larven in 96 Well Platten

1. Bereiten 1 ml Pipettenspitzen mit breiten Bohrung durch Abschneiden von etwa 5 mm von der Spitze und kurz flamm die scharfen Kanten.
2. Pool Larven mehrere Kreuze durch vorsichtiges Gießen sie von den Petrischalen in ein Becherglas. Ernte etwa 50 Larven in einer Zeit, indem Sie vorsichtig gießen sie auf ein Sieb (Porengröße von 0,25 mm Durchmesser) und sofort legen Sie das Sieb in eine kleine Petrischale (Durchmesser 5,5 cm) mit E3L Medium gefüllt ist.
3. Mit einer großen Bohrung Pipettenspitze, Transfer 225 ul Medium, das jeder eine Larve in die Vertiefungen eines weißen96-Well-Platte (Optiplate, PerkinElmer).
4. Verschließen Sie die Platten mit Klebedichtungsbahnen (zB TopSeal-A, PerkinElmer) und inkubieren sie bei 28 ° C über Nacht. Diese Vorinkubation verhindert Aufzeichnung von transienten Änderungen der Biolumineszenz unmittelbar nach der Zugabe von Luciferin, ein Phänomen, das auch in kultivierten Zellen ¹⁹ auftritt.

5. Drug Treatment

1. Entfernen Sie die Platte mit der Arbeitsverdünnung der Bibliothek aus dem -80 ° C Gefrierschrank ca. 4 Stunden vor dem Gebrauch. Die Platte vorsichtig vortexen und kurz drehen Sie es in einer Zentrifuge, um die Flüssigkeit am Boden der Platte zu sammeln.
2. Entfernen Sie die Klebedichtungsbahnen aus den Larven Platten.
3. Mit einer handbetriebenen 96-Kanal-Pipettieren Gerät (zB Liquidator, Steinbrenner) pipettieren die Wirkstofflösung nach oben und unten 3 mal. Dann aliquotiert 25 ul der Arbeitsverdünnung des chemischen Bibliothek in die Vertiefungen mit den Larven (mit dem Beispiel oben, diesezu einer Endkonzentration von 4 ug / ml in E3 mit 0,3% DMSO). Bereiten 10 (Minimum: 5) Replika-Platten mit Larven pro Bibliothek Platte.
4. Verschließen Sie die Platten mit den Klebedichtungsbahnen und beschriften Sie jede Platte mit einem Barcode-Aufkleber.

6. Lumineszenz-Aufnahme

1. Setzen Sie die Platten, die die Larven in die Stapeleinheiten eines EnVision Biolumineszenz Leser mit verstärkten Lumineszenz-Empfindlichkeit (PerkinElmer). Alternativ können Sie einen Roboter-Inkubator System wie die für Säugetierzellkultur-Screening-Systeme in Kombination mit dem Leser beschäftigt.
2. Rekord Biolumineszenz für zwei Tage mit Leser-Einstellungen analog zu den in Tabelle 2 für die EnVision Leser beschrieben. Passen Sie die Anzahl der Test wiederholt, um die Anzahl der Platten in der Flucht, um die erforderliche Laufzeit entsprechen.
3. Nach dem Ende des Laufs, überprüfen Sie die Platten auf das Vorhandensein von toten Larven auf allgemeine Toxizität der Layout-Datei bewertenounds.

7. Datenanalyse

Alle Daten-Analyse ist in der statistischen Programmierumgebung R mit eigenen Scripts durchgeführt.

1. AUC-Berechnung
   Zur Herstellung von Verbindungen der Aktivierung GC Signalisierung unabhängig von ihrer kinetischen Eigenschaften zu identifizieren, die Fläche unter der Kurve (AUC) der aufgezeichneten Spuren Lumineszenz (Biolumineszenz rohen Zählungen gegen Zeit) als die Parameter-Screening. AUC mit der Trapezregel (siehe 2a und a ') angenähert.
2. Normalisierung
   Log-Transformation die AUC-Werte, um einen höheren Normalität der Daten (Fig. 2b und b ') zu gewährleisten. Dann normalisieren die Log-transformierten AUC-Werte für jede Bibliothek Platte mit der robusten Z-Score-Methode (siehe ^20). Diese Normalisierung führt zu Werten, die die Anzahl von Standardabweichungen von dem Mittelwert von allen Datenpunkten. Auf diese Weisesystematische Fehler, wie interLaufSchwankungen, aus den Daten entfernt. Die Daten können nun durch Auftragen der mittleren robuste Z-Score der Replikate für jede Vertiefung (2c und c ') visualisiert werden.
3. Qualitätsmetriken
   1. Heatmap
      Um Platte bedingte Effekte sichtbar zu machen, zeichnen die Daten für jede Platte als Heatmap zB mit dem heatmap.2 Funktion des gplot Paket ^21. Auf diese Weise können Randeffekte oder Verbindung Verschleppung leicht erkannt werden (zB vgl. Abb. 3a mit 3b). Ausschließen suboptimalen Platten von der weiteren Analyse.
   2. ROC-Kurve
      Um zu bestimmen, Empfindlichkeit und Spezifität des Tests zu berechnen eine Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve z. B. mit Hilfe der ROC Bioconductor Paket ²² mit den in 7.2 (3c) bestimmt Z-Punktzahlen. Anschließend bestimmen die AUC von diesem curve. Ein AUC-Wert nahe 1 zeigt eine hohe Sensitivität und Spezifität des Assays.
4. Hit-Identifizierung
   Um den Cut-off-Wert für die Identifizierung der Wirkstoffe zu optimieren, bestimmen die Youden Index. Um den Index zu berechnen, subtrahieren Sie die geschätzte wahre Positive-Rate (TPR) von der falsch positiv Rate (FPR) der ROC-Kurve für die Erhöhung robuste Z-Score-Cut-off-Werte. Nehmen Sie die robuste Z-Score mit der höchsten Youden Index (TPR minus FPR) als Cut-Off-Punkt. Der TPR / FPR kann durch den Nachweis der positiven Kontrolle Brunnen oder von bekannten Wirkstoffen innerhalb der Bibliothek geschätzt werden. Bei der Verwendung von positiven Kontrollvertiefungen stellen Sie sicher, dass sie die erwarteten Hit Stärke entsprechen.

8. Wiederholungsprüfung

1. Neu zu bewerten positive Hit Verbindungen, die durch die Behandlung von Larven mit seriellen Verdünnungen der von einem anderen Anbieter erhaltenen Verbindungen mit der gleichen Recording-oben beschrieben. Echte Hits sollte ein Lumineszenz induzierenlso in diesem Assay im Idealfall in einer dosisabhängigen Weise.

Ergebnisse

In einer früheren Publikation ^18, abgeschirmt wir eine Bibliothek von 640 FDA zugelassenen Medikamente in einer Pilot-Bildschirm, um die Leistung des Grizly Assay zu beurteilen. Diese Bibliothek enthielt 12 bona fide GCs, was es uns ermöglicht, Qualitätsmaßnahmen für die Sensitivität und Spezifität des Assays zu bestimmen.

Abbildung 2 zeigt typische Beispiele für die Roh-Daten-Analyse und Normalisierung von diesem Bildschirm genommen. Ein typisches Ergebnis einer Dexamethason-Kontrollvertiefung ist in Fig. 2a dargestellt ist, veranschaulicht die Zeitinformation von den Daten. Ein Höhepunkt in Biolumineszenz, die bei etwa 12 Stunden nach der Behandlung erfolgt langsam über den folgenden 36 Stunden der Messung. Abbildung 2a 'unterstreicht die Annäherung der AUC-Wert mit der Trapezmethode ab. Diese Berechnung wird für alle Brunnen und jedes technische Wiederholung durchgeführt. Das Ergebnis der Log-Transformation ist in Fig. 2b / Strong> und b '. Hier ist der Mittelwert der positiven Kontrollen sind in einem normalen QQ-Plot aufgetragen. Log-Transformation führt zu einer größeren Angleichung der Datenpunkte auf den theoretischen normal verteilten Werte mit den roten Diagonalen angegeben. Eine Transformation zur Normalität der Daten zu erreichen erhöht die statistische Aussagekraft der nachfolgenden Analysen. Schließlich 2c und 2c 'zeigen die Wirkung von robusten Z-Score-Normalisierung auf Platte zu Platte Variabilität: Die mit verschiedenen Platten (2c) erhalten unterschiedliche Ausgangswerte normalisiert in der robusten Z-Score-Diagramm in Abbildung 2c'.

Die robuste Z-Score-Werte können verwendet werden, um systematische Fehler in den Daten durch die Visualisierung der Verteilung der Treffer auf den Platten zu identifizieren. 3A zeigt ein Beispiel eines heatmap der Bibliotheksplatte, bei der die robuste Z-Score values aufgetragen sind gut in die Positionen farblich gekennzeichnet. Eine leicht identifiziert Spalte 12 mit den in-Platte positiven Kontrollen. Positive Scoring-Verbindungen sind in der Bibliothek gut gesehen und F8, wenn auch schwächer, E2. 3b zeigt eine Platte, in der ein systematischer Fehler vorliegt. Man beobachtet eine Reihe von Verbindungen mit abnehmender Z-Score-Werte in den Zeilen A und E über mehrere Spalten. Keine der Verbindungen in diesen Vertiefungen wurde in der Re-Test positiv getestet. Da die Vertiefungen mit diesem abnehm Grizly Testaktivitäten sind auf dem Weg, wenn die Aliquotierung Bibliotheksplatten der Pipettier-Roboter nimmt platziert, ist dieses Muster anzeigt Verschleppung von einer positiven Verbindung während des automatisierten Pipettieren.

Die robuste Z-Score-Normalisierung zusammen mit der Anwesenheit von bekannten GCs in der Bibliothek konnten wir auch einen receiver operating characteristic (ROC)-Kurve für den Bildschirm ¹⁸ zu berechnen. Abbildung 3c zeigt eine Darstellung der geschätztengepaart richtig positiv Kurs gegenüber dem geschätzten falsch positiv Rate für verschiedene robuste Z-Score-Cut-off-Werte. Die geschätzte wahre positive Satz wird als Prozentsatz der richtig positiven Treffern (hier die in der Bibliothek vorhanden bekannt Glucocorticoide), die zu einem bestimmten robuste Z-Score-Cut-off-Wert gefunden werden, definiert. Die geschätzten False Positive Rate zeigt an, der Anteil der nicht-positive Verbindungen zu diesem Cut-off-Wert getroffen. Die AUC von dieser Kurve ist 0,95, was auf eine hohe Sensitivität und Spezifität des Bildschirms und hervorragende Testergebnis. Die AUC-Kurve wurde auch verwendet, um die optimale Cut-off-Wert für Hit-Identifizierung durch Berechnung der Youden Index für verschiedene robuste Z-Werte zu schätzen. Wir identifizierten die robuste Z-Score von 1,49, wie mit der höchsten Youden Index. Dieser Cut-off-Wert ist in Abbildung 2c 'als schwarze Linie trennt die Hits aus der Masse der Verbindungen angezeigt.

In unserem Bildschirm^18, waren wir in der Lage, nahezu alle bekannten in der Bibliothek vorhanden GCs zu identifizieren. Nur drei der 12 bona fide GCs wurden nicht nachgewiesen. Im Fall von Melengestrolacetat, war dies ein falsches negatives Ergebnis, da diese Verbindung Positiv in der Wiederholungsprüfung in einer höheren Konzentration als die in der Bibliothek verwendet. Die beiden anderen GCs waren auch in der Re-Test negativ. Corticosteron ist die Haupt GC in Nagetieren, aber nicht in Menschen, Fischen oder ^1, wobei die Prodrug Prednison vielleicht nicht gut durch die Larven System metabolisiert werden. Interessant ist, dass auch zwei Medikamente nicht als GCs kommentierte wurden auf dem Bildschirm identifiziert, von denen man nicht in der Re-Test (Spironolacton, ein Mineralokortikoid-Rezeptor-Antagonist) bestätigt werden. Die andere Verbindung, Pregnenolon ist ein Vorläufer in Steroid-Biosynthese, die Cortisol durch die Nebenniere umgewandelt wird. Tatsächlich Behandlung mit Pregnenolon stimuliert Cortisol-Produktion in der ¹⁸ Larven. Alle diese Ergebnisse bestätigen die hohe performance des Tests: nur eine falsch negative und falsch positive Verbindung ein gehörten zu den primären Bildschirm Ergebnisse, und 10 der 11 bestätigte Verbindungen mit GC-Signalisierung stimulierende Aktivität wurden bereits in der primären Bildschirm identifiziert.

Abbildung 1. Allgemeines Prinzip des Assays und Arbeitsfluss des Screening-Verfahren. A) Schema der Grizly Assay Reporter-Konstrukt. Luciferase (gelb) Expression von einem minimalen Promotor (P _min, orange) und vier concatemerized GRE Elemente ((GRE) _4, weiß), die durch Liganden-aktivierten GR Homodimere gebunden sind (GR, Blau) gesteuert wird. Rote Felder zeigen Tol2 Transposase Websites, die Integration des Konstrukts in das Genom zu erleichtern. Die rosa Box stellt eine Polyadenylierungsstelle (pA). Transgene Larven Durchführung dieses VerStruktur sind in opaken Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen für Biolumineszenz-Messungen gelegt. b) Schema des Luciferase-Reaktion. Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin zu Oxyluciferin, was zu Lichtemission (hv) führt. Die Reaktion erfordert auch ATP und Mg ^{2 +,} die von der Larve zur Verfügung gestellt wird. PP _i, Pyrophosphat. C) Arbeitsablauf auf dem Bildschirm. Arbeitsstamm Verdünnungen werden hergestellt aus einer von der FDA zugelassene Medikament Bibliothek in 96-Well-Platten, einer Säule, die eine negative innerhalb Plattenkontrolle (DMSO nur, grün) und eine Spalte, die eine positive Kontrolle (Dexamethason, rot) (Bibliothek Design). GRE: Luc Larven werden in 96-Well-Platten verteilt (5-11 Wiederholungen) und mit den Bibliotheks Verbindungen (Drug Application) behandelt. Biolumineszenz Spuren sind mit einem Biolumineszenz-Leser für zwei Tage (Datenerhebung) aufgezeichnet. Biolumineszenz Spuren sind integriert (AUC Berechnungen), melden Sie sich transformiert und robuste Z-Score normalisiert (Normalisierungrung). Normierte Daten werden für die Ermittlung und Qualitätsmetriken für Hit-Identifizierung (Datenanalyse) verwendet. Gewählt Treffer werden für dosisabhängige Aktivität im Test (Retest) erneut getestet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

2. Datenanalyse dargestellt mit Daten aus einem Bildschirm eine FDA zugelassene Medikament Bibliothek. a) Vertreter Spur von einem positiven Steuer gut. a ') Die Fläche unter der Kurve (AUC) mit der Trapezregel angenähert. Die für die Berechnung verwendeten Trapeze in verschiedenen Schattierungen von rot dargestellt. B) Normal-QQ-Plot von Roh-AUC-Werte der Positivkontrolle Brunnen (y-Achse) im Vergleich zu einem Standard-Normalbevölkerung (x-Achse) vor dem Log-Transformation. B ' ) Normale QQ-Plot der AUC-Werte nach Log-Transformation. Eine Normalverteilung wird durch die Linearität der Log-transformierten Datenpunkte angezeigt. C) Plot von log verwandelt Rohdaten für alle auf dem Bildschirm getesteten Verbindungen. Blau, bona fide Glukokortikoiden;. Grau, alle anderen Verbindungen, c ') Plot von Bildschirmdaten nach robusten Z-Score-Normalisierung. Systematische Fehler wie Plattenzwischen Variationen aus den Daten entfernt. Rote Linien zeigen den Mittelwert ± SEM von positiven innerhalb Platte Kontrollen. Schwarze Linie: Hit-Identifizierung Cut-off-Wert von Youden-Index Optimierung (Abbildung 3). Mit Genehmigung aus ^14, 2012 wiedergegeben ACS. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 3. Bildschirm Ergebnisse. a) Heatmap von Bildschirm Ergebnisse. Robuste Z-Score-Werte der Verbindungen der Bibliothek werden in die jeweiligen Positionen gut aufgetragen. Die positiven Kontrollen in Spalte 12 sowie zwei positive Hit Verbindungen in Brunnen F8 und E2 sind sichtbar. B) Heatmap einer Platte, die Verschleppung von einer positiven Verbindung während Bibliothek Zubereitung mit einem Pipettier-Roboter. Ein Gradient von Aktivität ist sichtbar an der Pipettier-Pfad vom Roboter übernommen. C) Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve für den Bildschirm. Die geschätzten wahren positiven Raten (linke y-Achse) und falsch positiven Raten (x-Achse) zur Erhöhung robuste Z-Score-Cut-off-Werte (farbcodiert, rechte y-Achse) aufgetragen. Die AUC-Wert der resultierenden Kurve nahe 1, was auf eine gute Testleistung. Nachdruck mit Genehmigung aus ^14, 2012 ACS. D) Tabelle mit Verbindungen aktiv (yellow) oder inaktiv (blau) in der primären Bildschirm (prim.) oder in der Wiederholungsprüfung. Bona fide Glukokortikoiden nicht immer erneut getestet (weiß). Neu gezeichnet mit Genehmigung aus ^14, 2012 ACS. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Allgemeine Einstellungen:
Schritt 1.1
Verfahren	Typ:	einzigen flüssigen
	Modus:	auspusten
	spendet pro absaugen:	1
	Optimierung der Geschwindigkeit:	Ja
	Luftspalte System:	10 ul
	Verkehr:	0
Flush / Wash	Nicht
Absaugen	Art der Einstellung	Wert	Bemerkungen
	Position	B7, B10, B13, B16
	Saugen Vol.	10 ul
	Geschwindigkeit	200 &mgr; l / s
	Flüssig-Tracking	60%
	Saugen Höhe	Standardlaborartikel	22.28
Dosieren	Art der Einstellung	Wert	Bemerkungen
	Positionen	D7, D10, D13, D16
	Dispense Vol.	10 ul
	Geschwindigkeit	200 &mgr; l / s
	Flüssig-Tracking	100 ul
	Dispense Höhe	Standardlaborartikel	17.01
Schritt 1.2
Verfahren	Typ:	Reagens
	Modus:	Verschwendung
	spendet pro absaugen:	3
	Optimierung der Geschwindigkeit:	Ja
	Luftspalte System:	15 ul
	Verkehr:	0
Flush / Wash		Nicht
Absaugen	Art der Einstellung	Wert	Bemerkungen
	Position	A4
	Saugen Vol.	3 x 490 ul
	Luftspalte	15 und 0
	Geschwindigkeit	200 &mgr; l / s
	Flüssig-Tracking	400%
	Saugen Höhe	Flüssigkeitsoberfläche
Dosieren	Art der s Etting	Wert	Bemerkungen
	Position	D7, D10, D13, D16
	Dispense Vol.	490 ul
	Luftspalte	15 und 0
	Geschwindigkeit	200 &mgr; l / s
	Flüssig-Tracking	100%
	Dispense Höhe	Standardlaborartikel	17.01

Tabelle 1. Einstellungen für die Multiprobe II. Das Protokoll in Tabelle 1 beschreibt die Herstellung von 4-Platten (jeweils 96 Löcher). Die Platten werden auf Platte Adapter in den Arbeitsbereich an den Positionen der Roboter (zB B7, B10, B13, B16) angegeben haben.

1 "fo: keep-together.within-page =" always "> Allgemeine Einstellungen: Anzahl der Testwiederholungen abhängig von der Länge der Lauf Anzahl der Platten unbegrenzt Temperaturregelung 28 ° C Protokoll Berechnungen US-Lum 96 (cps) lesen Messzeit 2,5 Sek. Crosstalk-Korrektur Die Entfernung zwischen Platte und Detektor 0 mm Glow (CT2) Korrekturfaktor 0% Inhalt "> Tabelle 2. EnVision Einstellungen für den Bildschirm verwendet.

Diskussion

Wir präsentieren hier die Workflow-und Datenanalyse für eine chemische Bildschirm messen GC-Aktivität in vivo-Assay mit der Grizly ^18. Der Test hat die Qualitätskontrolle Eigenschaften und Performance-Maßnahmen, die vergleichbar mit herkömmlichen Zell Basis-Bildschirme sind, ein wichtiger Vorteil für den Einsatz im Hochdurchsatz-Einstellungen. Außerdem erkennt jedoch, die in-vivo-Assay auch Verbindungen, die nicht zugänglich sind, in vitro Screens sind. Dies wird durch die Anwesenheit der Prohormon Pregnenolon unter den Hits veranschaulicht. Somit ist die Grizly Assay erweitert den Anwendungsbereich der Bildschirme im GC Signalaktivität ab.

Die Bedeutung der Erfassung von in vivo-Wirkungen mit unserem Test wird auch durch Ergebnisse, die wir mit dem Organozinn Schadstoffe DBT und TBT ¹⁸ dargestellt erhalten. DBT, aber nicht TBT, hat sich gezeigt, GC-Signalisierung in Säugerzellkultur zu hemmen, und man beobachtet die gleichen in Zebrafischzellkulturen auszudrückenING Das GRE: Luc Reporter. Wichtig ist jedoch bei der Grizly Assay zeigte TBT inhibitorische Aktivität auf die GC-Weg, da es zu DBT durch die Larven Metabolismus umgewandelt werden. Diese Hemmung war bereits bei umweltrelevanten Konzentrationen von TBT beobachtet. Diese Ergebnisse veranschaulichen weiter das Potential der Grizly Assay in Verbindung Erfassen Wirkungen auf der Basis zwischenOrganÜberSprechen und metabolischen Veränderungen der Verbindungen im lebenden Tier. Sie heben auch das Anwendungspotenzial der Grizly Assay für die Umweltüberwachung. Somit kann endokrin Wirkungen auf der Ebene der Rezeptor-Signalisierung, wobei die Unterbrecher stört GC Signalaktivität durch eine GR-Agonisten, wie Dexamethason induziert sucht werden. Eine andere Möglichkeit ist es, Verbindungswirkungen Pregnenolon-stimulierte Synthese GC studieren. Der hohe Durchsatz Qualität des Tests sollte ein schnelles Screening von Umwelt Sample-Bibliotheken zu ermöglichen.

Die Verwendung von Luciferase als areporter Gen ermöglicht eine hohe Dynamik der Erkennung von Signalaktivität ^23. Tatsächlich ist die Empfindlichkeit des Tests ist es möglich, osmotischer Stress-induzierte Produktion von einzelnen GC Larven ¹⁸ zu erfassen. Die hohe zeitliche Auflösung mit der Luciferase-Reporter erreicht ermöglicht es uns, Signalaktivitäten über die Zeit, die es ermöglichen, analysieren auch die Kinetik der Daten ist zu folgen.

Ein möglicher Nachteil für einige Anwendungen ist die begrenzte Eignung für die räumliche Überwachung dieses Reportersystem. Fluoreszierende Reportersysteme könnten für Tests und Überwachung bestimmter Bereiche der Larven benötigen besser geeignet sein. Jedoch können solche Assays von niedriger Empfindlichkeit aufgrund von Hintergrundeffekten durch das Anregungslicht, das auch stellt Grenzwerte für die Detektion von fluoreszierenden Verbindungen erleiden. Darüber hinaus könnte sie weniger kinetische wegen der allgemein höheren Stabilität von fluoreszierenden Proteinen ²³ zu liefern.Darüber hinaus präsentieren sie Herausforderungen in Bezug auf Bildausrüstung, Datenanalyse und Datenspeicherung, die ihre Verwendung für kleinere Forschungslabors einschränken könnten.

Das Set-up des Grizly Test, wie einer Mikrotiterplatte basierten Assay ermöglicht die einfache Integration in typische Screening-Workflows. Der Test ist auch in kleineren Forschungslabors durch seine einfache Handhabung und Datenanalyse leicht anwendbar. Gleichzeitig ermöglicht sie ein hohes Maß an Automatisierung, Drogenanwendung durch Pipettieren Roboter oder automatisierte Verteilung von Embryonen durch Embryo Sortiervorrichtungen ^24,25 zB automatisiert. Die einfache Anzeige erfordert keine automatisierten Screening-Mikroskopen oder anspruchsvolle Bildanalyse-Software, bietet aber einen umfassenden Satz von Daten über die zeitlichen und quantitativen Aspekte der untersuchten Signalweges.

Zusammenfassend stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine relativ kostengünstig, robust und einfach zu handhabendes chemisches Screening Assay für GCSignalaktivität in vivo und in Echtzeit. Der Assay erlaubt die Bestimmung der in vivo-Wirkungen von Verbindungen auf GC nicht nachweisbar Signalisierung in Zellkultur-Assays. Unter den vielen Anwendungen für den Test sind z. B. die Bestimmung der genetischen Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Signalisierung, die Umweltüberwachung von endokrinen Disruptoren Auswirkungen auf die Glukokortikoid-Synthese und Signalaktivität, und das Screening von Verbindungen für die unerwünschte Auswirkungen auf GC-Signalisierung oder für neue in-vivo-Modulatoren von dieser wichtigen Signalweg.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2
Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe