Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Riepilogo

Descriviamo la procedura e analisi dei dati di un sistema di screening chimico per la segnalazione ormone dello stress glucocorticoide con larve di zebrafish: il Responsive dosaggio glucocorticoidi In vivo Zebrafish Luciferase attività (GRIZLY). Il test con sensibilità e in particolare rileva gli effetti sulla segnalazione glucocorticoide da composti che necessitano di metabolizzazione o influenzano la produzione di glucocorticoidi endogeni.

Abstract

Ormoni dello stress glucocorticoidi e loro derivati ​​artificiali sono ampiamente utilizzati farmaci per trattare l'infiammazione, ma il trattamento a lungo termine con glucocorticoidi può portare a gravi effetti collaterali. Sistemi di test sono necessari per cercare nuovi composti che influenzano segnalazione glucocorticoide in vivo o per determinare gli effetti indesiderati dei composti sulla via di segnalazione glucocorticoide. Abbiamo stabilito un saggio zebrafish transgenico che permette la misurazione delle attività di segnalazione glucocorticoide in vivo e in tempo reale, l'analisi GRIZLY (glucocorticoidi Responsive In vivo Zebrafish Luciferase attività). Il saggio basato luciferasi-rileva gli effetti sulla segnalazione glucocorticoide con elevata sensibilità e specificità, inclusi gli effetti di composti che necessitano di metabolizzazione o influenzano la produzione di glucocorticoidi endogeni. Presentiamo qui un protocollo dettagliato per lo svolgimento di schermi chimici con questa analisi. Descriviamo acquisizione dati, la normalizzazione, eanalisi, ponendo un focus sul controllo di qualità e la visualizzazione dei dati. Il saggio fornisce una semplice, risolta in tempo, e quantitativa lettura. Può essere utilizzato come una piattaforma stand-alone, ma è anche facilmente integrato in high-throughput screening dei flussi di lavoro. Esso permette inoltre per molte applicazioni al di là di screening chimico, come ad esempio il monitoraggio ambientale di interferenti endocrini o di ricerca stress.

Introduzione

Glucocorticoidi (GC) sono ormoni steroidei prodotti dalla ghiandola surrenale che svolgono ruoli importanti durante la risposta allo stress e nella regolazione del metabolismo ^1. GC legano citoplasmatici recettori glucocorticoidi (GRS) della superfamiglia dei recettori nucleari che, in seguito al legame, traslocare nel nucleo ^2. Qui, si possono per esempio reprimere la trascrizione interferendo con altri fattori di trascrizione (transrepression) o attivare la trascrizione genica attraverso elementi glucocorticoidi risposta (gres, transattivazione). A causa delle loro proprietà anti-infiammatorie, GC sia naturali che artificiali sono ampiamente utilizzati farmaci nel trattamento di una serie di malattie, come l'asma o artrite ^3. Tuttavia, in particolare l'uso a lungo termine di GC può portare a gravi effetti collaterali, tra cui il diabete e glaucoma ^4. Pertanto, nuovi composti destinati GC segnalazione con efficienza di trattamento potenzialmente più vantaggioso e tollerabilità sono molto ricercati poppaER. Importante, effetti ligando osservati in cellule in coltura possono differire da quelli osservati in vivo ^5. Tali effetti potrebbero risultati polarizzazione ottenuti con colture cellulari convenzionali basati test di screening farmaceutiche. Chimica in vivo screening abilitato dal modello zebrafish ha recentemente venuto a fuoco, in quanto consente la determinazione degli effetti non rilevabili in coltura cellulare ^6,7.

Vie di segnalazione ormonali possono anche essere influenzati da inquinanti ambientali. I cosiddetti interferenti endocrini (IE) influiscono vari ormone regolamentato processi ^8. Quindi, la riproduzione e la differenziazione sessuale degli organismi acquatici possono essere modulate sostanze con attività estrogeno-simile. Recentemente, sono state espresse preoccupazioni che i disturbi metabolici potrebbero essere collegati agli IE nell'ambiente ^9. Una via di mira da tale "disturbo metabolico" è la via glucocorticoide, che è stata anche implicata nella xenoBiotics effetti sullo sviluppo e la funzione immunitaria ^10,11. Tuttavia, rispetto alla grande quantità di informazioni disponibili sui composti che interferiscono con il sesso steroide azione ormonale, relativamente poco si sa circa gli effetti endocrini perturbazione mediati attraverso il GR. Pertanto, sono necessari strumenti che permettono di monitorare gli effetti degli inquinanti sulla segnalazione GC in vivo.

Il pesce zebra è stata a lungo un modello popolare in biologia dello sviluppo e più recentemente ha attirato anche ricercatori di altri campi, tra cui endocrinologia ^12. Rispetto ad altri teleostei, il sistema di segnalamento GC di zebrafish è più simile a quello dei mammiferi, poiché il genoma zebrafish contiene soltanto un gene GR rispetto ai recettori ripetuto in molte altre specie ittiche ^13-15. Inoltre, l'asse ipotalamo-ipofisi-surrene è già funzionale da 5 giorni di età larve zebrafish, che aumentano la produzione endogena GC in risposta a stress ^14,16-18.

Recentemente abbiamo generato una linea transgenica zebrafish, GRE: Luc, che consente il monitoraggio di attività di segnalazione GC in vivo e in tempo reale ^18. La linea porta un gene reporter luciferasi costrutto sotto il controllo di un promotore minimo TATA box e quattro GRE concatemerized (Figura 1A). GC bioluminescenza indotta può essere misurata dal singolo GRE: Luc larve in piastre da 96 pozzetti microtiter in vivo per periodi di tempo prolungati. Questo test GRIZLY (per "glucocorticoidi Responsive In vivo Zebrafish Luciferase attività") può essere utilizzato in una serie di campi di ricerca diversi, come la ricerca stress, monitoraggio ambientale, e le schermate farmacologici ^18. Siamo stati in grado di rilevare la crescita endogena di cortisolo dopo stress osmotico dal singolo larve e potuto seguire la maturazione della risposta durante lo sviluppo. Inoltre, abbiamo potuto monitorare gli effetti sulla segnalazione GC di composti organostannicis che richiedono metabolizzazione dalla larva. È importante sottolineare che la linea era in grado di rilevare questi effetti a concentrazioni rilevanti per l'ambiente. Infine, in una schermata pilota il saggio sensibile e specifico rilevato composti con attività GC da una libreria chimica, compreso un composto che stimola la produzione di cortisolo endogeno nelle larve. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per schermi chimici utilizzando il test GRIZLY.

Protocollo

1. Preparare la diluizione di lavoro della Biblioteca Chemical

Prediluire composti della libreria del medicamento da testare (ad esempio farmaci approvati dalla FDA, Enzo Life Science) in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂₎ con una stazione robotizzata di manipolazione dei liquidi (per es Multiprobe II, 8 aghi con Adattatore punta smaltimento, PerkinElmer). Concentrazioni adatti sono ad esempio 40 mg / ml a 3% DMSO, ma questo dipende dal tipo di libreria utilizzate. Le impostazioni Multiprobe II corrispondenti alle operazioni descritte di seguito vengono riportati in Tabella 1. Il protocollo descritto nella tabella permette la preparazione di quattro piastre aliquote in parallelo.

1. Pipettare 10 microlitri aliquote della biblioteca magazzino (2 mg / ml in DMSO) in pozzetti profondi (ad esempio piastra a 96 pozzetti bagagli, rotondo Bene, 0,8 ml, ABgene). Le colonne 1 e 12 devono essere lasciati liberi - questi riceveranno i controlli positivi e negativi all'interno della piastra.
i> Dispensare 490 ml di E3 con 1% DMSO nelle aliquote preparate della biblioteca con il Multiprobe II. Diluizione viene eseguita con aghi fissi, senza punte di smaltimento.
2. Aggiungere 10 ml di DMSO nella colonna 1 e 10 ml di una soluzione di desametasone 5 mM (in DMSO) a colonna 12 come controlli all'interno della piastra. La concentrazione di DMSO in tutti i pozzetti è ora 3%, la concentrazione di desametasone nei pozzetti di controllo positivi è 100 mM in E3 / 3% DMSO.
3. Sigillare la piastra con resistente DMSO adesivi fogli di tenuta. Conservare le piastre a -80 ° C fino al loro utilizzo.

2. Allevamento di Reporter Pesce

Raccogliere embrioni da riproduzione naturale di accoppiamenti di gruppo tra GRE: pesce Luc transgenico. Sollevare embrioni (non più di 60) in nove centimetri piastre di Petri contenenti E3 mezzo supplementato con 1 mg / ml di blu di metilene fungicida fino a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) in un incubatore a 28 ° C. Cambiare E3 mezzo regolarmente.

title "> 3. Preparazione di Luciferase Medium (E3L)

Preparare una soluzione acquosa luciferina magazzino di 50 mm con l'aggiunta di dH ₂ O al flaconcino contenente la polvere luciferina. Questa soluzione madre può essere conservato a -80 ° C per diversi mesi. Diluire il luciferina magazzino in E3 mezzo ad una concentrazione finale di 0,5 mm per ottenere E3L medie.

4. Distribuire larve in 96 pozzetti

1. Preparare 1 ml punte per pipette con ampio foro tagliando circa 5 mm di punta e brevemente fiammeggiante i bordi taglienti.
2. Pool larve da diverse croci da essi versando con attenzione di piastre di Petri in un becher. Raccolto circa 50 larve alla volta versandole delicatamente su un setaccio (dimensione dei pori di diametro 0,25 millimetri) e collocare immediatamente il setaccio in una piccola capsula di Petri (diametro 5,5 centimetri) riempito con E3L medie.
3. Con una punta larga foro pipetta, 225 ml di mezzo contenenti una larva ciascuno dei pozzetti di bianco96 pozzetti (Optiplate, PerkinElmer).
4. Sigillare le piastre con i fogli di colla di tenuta (ad esempio TopSeal-A, PerkinElmer) e incubare a 28 ° C durante la notte. Questo preincubazione impedisce la registrazione di cambiamenti transitori bioluminescenza subito dopo l'aggiunta di luciferina, un fenomeno che si verifica anche in cellule in coltura ^19.

5. Trattamento farmacologico

1. Rimuovere la piastra contenente la diluizione di lavoro della biblioteca dal -80 ° C freezer circa 4 ore prima dell'uso. Vortice delicatamente la piastra e brevemente girare in una centrifuga per raccogliere il liquido sul fondo della piastra.
2. Rimuovere i fogli adesivi di tenuta dalle piastre larve.
3. Con un dispositivo di dispensazione a 96 canali ad azionamento manuale (ad esempio Liquidator, Steinbrenner) pipetta la soluzione di farmaco su e giù per 3 volte. Poi aliquota 25 microlitri della diluizione di lavoro della biblioteca chimica nei pozzetti contenenti le larve (con l'esempio precedente, questarisultati in una concentrazione finale di 4 mg / ml in E3 con 0.3% DMSO). Preparare 10 (minimo: 5) piastre di replica con larve per piastra biblioteca.
4. Sigillare i piatti con i fogli adesivi di tenuta ed etichettare ogni piatto con un adesivo del codice a barre.

6. Luminescence registrazione

1. Mettere le piastre contenenti le larve nelle unità accatastamento di un lettore bioluminescenza EnVision con maggiore sensibilità luminescenza (PerkinElmer). In alternativa, utilizzare un sistema robotizzato incubatore come quelli impiegati per sistemi di screening di colture cellulari di mammifero in combinazione con il lettore.
2. Record bioluminescenza per due giorni utilizzando le impostazioni del lettore analoghi a quelli descritti nella tabella 2 per il lettore EnVision. Adattare il numero di ripetizioni del test per il numero di piatti nella corsa adatta al tempo di funzionamento richiesto.
3. Dopo la fine della corsa, controllare le piastre per la presenza di larve morte per valutare la tossicità generale del compounds.

7. Analisi dei dati

Tutte le analisi dei dati viene eseguita in R ambiente di programmazione statistica utilizzando script personalizzati.

1. Calcolo AUC
   Al fine di identificare i composti che attivano GC segnalazione indipendentemente dalle loro proprietà cinetiche, determinare l'area sotto la curva (AUC) delle tracce di luminescenza registrati (bioluminescenza conteggi in funzione del tempo) come parametro di screening. AUC sono approssimate con la regola trapezoidale (vedi figure 2a e un ').
2. Normalizzazione
   Log trasformare i valori AUC per garantire una maggiore normalità dei dati (figure 2b e b '). Poi normalizzare il registro trasformata valori di AUC per ogni piastra libreria con il metodo Z-score robusta (vedi ^20). Questo normalizzazione comporta valori che rappresentano il numero di deviazioni standard dalla media di tutti i punti di dati. In questo modo,errori sistematici, come la variabilità inter-run, vengono rimossi dai dati. I dati possono essere visualizzati tracciando il robusto Z-score medio delle repliche per ciascun bene (figure 2 quater e c ').
3. Metriche di qualità
   1. Heatmap
      Per visualizzare effetti piastra correlate, tracciare i dati per ogni piastra come heatmap utilizzando ad esempio la funzione heatmap.2 del pacchetto gplot ^21. In questo modo, effetti di bordo o per composti di riporto possono essere facilmente individuati (es confrontare figura 3a con 3b). Escludi piastre sub-ottimali da ulteriori analisi.
   2. Curva ROC
      Per determinare la sensibilità e specificità del test, calcolare un ricevitore operating characteristic (ROC) curva esempio con l'ausilio del pacchetto Bioconductor ROC ²² utilizzando i valori di Z-score determinati in 7.2 (figura 3c). Successivamente, determinare la AUC di questa curve. Un valore AUC vicino a 1 indica alta sensibilità e specificità del test.
4. Hit Identificazione
   Per ottimizzare il valore di cut-off per l'identificazione dei composti attivi, determinare l'indice Youden. Per calcolare l'indice, sottrarre il vero tasso positivo stimato (TPR) dal tasso di falsi positivi (FPR) della curva ROC per aumentare i valori di cut-off robusti Z-score. Prendete il robusto Z-score con il più alto indice Youden (TPR meno FPR) come punto di cut-off. Il TPR / FPR può essere stimato rilevazione dei pozzetti di controllo positivi o di composti attivi noti all'interno della biblioteca. Quando si utilizza il controllo positivo pozzi assicurarsi che essi corrispondano alla forza hit previsto.

8. Rianalisi

1. Rivalutare composti hit positivi trattando larve con diluizioni seriali dei composti ottenuti da un fornitore diverso, utilizzando la stessa registrazione set-up descritto sopra. I veri risultati dovrebbero indurre una luminescenzaLSO in questo saggio, idealmente in modo dose-dipendente.

Risultati

In una pubblicazione precedente ^18, abbiamo proiettato una libreria di 640 farmaci approvati dalla FDA in una schermata pilota per valutare le prestazioni del dosaggio GRIZLY. Questa biblioteca conteneva 12 bona fide GC, consentendo in tal modo di determinare le misure di qualità per la sensibilità e la specificità del test.

La Figura 2 mostra esempi tipici di analisi dei dati grezzi e la normalizzazione preso da questa schermata. Un tipico risultato di un controllo desametasone bene è illustrato nella figura 2a, che illustra l'informazione temporale indicata dai dati. Un picco in bioluminescenza che avviene a circa 12 ore dopo il trattamento diminuisce lentamente sopra il seguente 36 ore di misurazione. Figura 2a 'evidenzia l'approssimazione del valore AUC utilizzando il metodo trapezoidale. Questo calcolo avviene per tutti i pozzetti e ogni ripetizione tecnica. Il risultato della trasformazione logaritmica è mostrata nelle figure 2b </ Strong> e b '. Qui la media dei controlli positivi tracciati in un normale trama QQ. Log trasformazione porta ad una maggiore ravvicinamento dei punti dati ai valori teorici normalmente distribuiti indicate dalle diagonali rosse. Una trasformazione per ottenere normalità dei dati aumenta la potenza statistica delle analisi successive. Infine, figure 2c e 2c 'mostrano l'effetto della robusta Z-score normalizzazione sulla variabilità piastra-to-plate: I diversi valori basali ottenuti con diversi piatti (Figura 2c) sono normalizzati nel robusta trama Z-score in figura 2c'.

I valori di Z-score robusti possono essere usate per identificare gli errori sistematici nei dati visualizzando la distribuzione dei risultati attraverso le piastre. Figura 3a mostra un esempio di una mappa termica di un piatto biblioteca, in cui il robusto Z-score valUES vengono tracciate color-coded nelle posizioni pure. Un identifica facilmente colonna 12 con i controlli positivi in ​​piastra. Composti biblioteca segnare positivi sono visti in F8 bene e, anche se debole, E2. Figura 3b mostra una piastra in cui è presente un errore sistematico. Si osserva una serie di composti con valori decrescenti Z-score nelle righe A ed E su più colonne. Nessuno dei composti in questi pozzetti è stato testato positivo nel re-test. Poiché i pozzetti con questa diminuzione dell'attività prova GRIZLY sono collocati lungo il percorso del robot pipettaggio assume quando si dispensa le piastre di libreria, questo modello è indicativo di riporto di un composto positiva durante il processo di pipettaggio automatizzato.

Il robusto Z-score normalizzazione unitamente alla presenza di GC conosciuti nella biblioteca inoltre ha permesso di calcolare un ricevitore caratteristica (ROC) curva operativa per lo schermo ^18. Figura 3C mostra un grafico della stimaaccoppiato vero tasso positivo contro il tasso di falsi positivi stimato per diversi valori di cut-off robusti Z-score. Il vero tasso positivo stimato è definita come la percentuale di veri risultati positivi (qui, i glucocorticoidi noti presenti in biblioteca) che si trovano in un robusto determinato Z-score valore di cut-off. Il corrispondente tasso di falsi positivi stimato indica la percentuale di composti non positive colpito di questo valore di cut-off. L'AUC di questa curva è 0,95, indicando una elevata sensibilità e specificità dello schermo e eccellenti prestazioni dell'analisi. La curva AUC è stato utilizzato anche per stimare il valore di cut-off ottimale per l'identificazione hit di calcolo dell'indice Youden per i diversi punteggi Z robuste. Abbiamo identificato il robusto Z-score di 1.49 ad avere il più alto indice Youden. Questo valore cut-off è indicata in Figura 2c 'come una linea nera che separa i colpi dalla maggior parte dei composti.

Nel nostro schermo^18, siamo stati in grado di identificare GC quasi tutte le note presenti in biblioteca. Solo non sono stati individuati tre dei 12 CV in buona fede. Nel caso di acetato di melengestrolo, questo era un falso risultato negativo, poiché questo composto è risultato positivo nella ri-prova a una concentrazione superiore a quella utilizzata nella libreria. Gli altri due GC erano negativi anche nella ri-prova. Corticosterone è il principale GC nei roditori, ma non nei pesci o esseri umani ^1, mentre il prednisone profarmaco potrebbe non essere metabolizzato bene dal sistema larvale. È interessante notare, inoltre due farmaci non annotati come GC sono stati identificati nello schermo, di cui non si poteva essere confermate nel re-test (spironolattone, un antagonista del recettore dei mineralcorticoidi). L'altro composto, pregnenolone, è un precursore nella biosintesi di steroidi, che viene convertito in cortisolo da parte della ghiandola surrenale. Infatti, il trattamento con pregnenolone stimolato la produzione di cortisolo nelle larve ^18. Tutti questi risultati confermano l'elevata performance del dosaggio: solo un falso negativo e un composto falso positivo sono stati tra i risultati dello schermo primario e 10 dei 11 composti confermati con segnalazione GC stimolare l'attività sono stati già individuati nella schermata principale.

Figura 1. Principio generale del dosaggio e del flusso di lavoro della procedura di screening. A) Schema del saggio GRIZLY costrutto reporter. Luciferasi (giallo) espressione è controllata da un promotore minimo (P _min, arancione) e quattro elementi concatemerized GRE ((GRE) _4, bianco), che sono vincolati da ligando-attivati ​​GR omodimeri (GR, blu). Scatole rosse indicano i siti transposase Tol2 che facilitano l'integrazione del costrutto nel genoma. La scatola rosa rappresenta un sito di poliadenilazione (pA). Larve transgenici portatori questo contestostruct sono collocati in opachi piastre da 96 pozzetti microtiter per le misure di bioluminescenza. b) Schema della reazione luciferasi. Luciferasi catalizza l'ossidazione della luciferina a oxyluciferin, che porta ad emissione di luce (hv). La reazione richiede anche ATP e Mg ^{2 +,} che è fornito dalle larve. PP _i, pirofosfato. C) Workflow dello schermo. Lavoro archivi diluizioni sono preparate da un farmaco approvato dalla biblioteca di droga in piastre da 96 pozzetti, una colonna contenente un negativo entro piastra di controllo (solo DMSO, verde) e una colonna contenente un controllo positivo (desametasone, rosso) (Design Library). GRE: Luc larve sono distribuiti in piastre da 96 pozzetti (5-11 replicati) e trattato con i composti della biblioteca (Drug Application). Bioluminescenza tracce sono registrati con un lettore di bioluminescenza per due giorni (raccolta dei dati). Bioluminescenza tracce sono integrati (calcoli AUC), log-trasformati e robusto Z-score normalizzati (Normalizione). Dati normalizzati vengono utilizzati per determinare i parametri di qualità e per l'identificazione hit (analisi dei dati). Colpi scelti sono sottoposti nuovamente al test per l'attività dose-dipendente nel saggio (retest). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Analisi dei dati illustrato con i dati di uno schermo di un approvati dalla FDA libreria del medicamento. a) traccia rappresentativa da un controllo positivo. a ') L'area sotto la curva (AUC) è approssimata con la regola trapezoidale. I trapezi usati per il calcolo sono riportati in diverse tonalità di rosso. B) Normal QQ plot dei valori grezzi AUC dei pozzetti di controllo positivi (asse y) vs una popolazione normale (asse x di serie) prima trasformazione logaritmica. B ' ) Normal QQ plot dei valori di AUC dopo trasformazione logaritmica. Una distribuzione normale è indicata dalla linearità dei log trasformato punti dati. C) Appezzamento di log trasformato dati grezzi per tutti i composti testati nella schermata. Blu, bona fide glucocorticoidi,. Grigio, tutti gli altri composti c ') Terreno di dati schermo dopo robusto Z-score normalizzazione. Errori sistematici come le variazioni inter-piastra sono stati rimossi dai dati. Le linee rosse indicano la media ± SEM di positivi controlli all'interno della piastra. Linea nera: colpire valore di cut-off di identificazione come determinato dalla ottimizzazione Youden-Index (Figura 3). Riprodotto con il permesso dal ¹⁴ maggio 2012 ACS. Clicca qui per ingrandire la figura .

0439fig3.jpg "/>
Figura 3. Risultati dello schermo. a) Heatmap dei risultati dello schermo. Robusti valori Z-score di composti biblioteche sono riportati nelle rispettive posizioni pure. I controlli positivi nella colonna 12, nonché due composti hit positivi in pozzi F8 e E2 sono visibili. B) Heatmap di una placca con riporto di un composto positiva durante la preparazione biblioteca con un robot pipettaggio. Un gradiente di attività è visibile lungo il percorso pipettaggio presa dal robot. C) Ricevitore caratteristica ROC) curva (operante per lo schermo. I veri tassi stimati positivi (sinistra asse y) e tassi di falsi positivi (asse x) sono tracciate per valori crescenti di cut-off robusti Z-score (codice colore, a destra dell'asse y). Il valore AUC della curva risultante è vicino a 1, indicando buone prestazioni dell'analisi. Riprodotto con il permesso ^14, 2012 ACS. D) tavolo mostrando composti attivi (yellow) o inattivo (blu) nella schermata principale (prim.) o nel ripetere il test. glucocorticoidi Bona fide non sono sempre stati riesaminati (bianco). Ridisegnato con il permesso ^14, 2012 ACS. Clicca qui per ingrandire la figura .

Impostazioni generali:
Passo 1.1
Procedura	Tipo:	unico liquido
	Modalità:	spegnere
	dispensa per aspirare:	1
	ottimizzare la velocità:	Sì
	traferri sistema:	10 microlitri
	Trasporto:	0
Flush / Wash	No
Aspirare	Tipo di impostazione	Valore	Osservazioni
	Posizione	B7, B10, B13, B16
	Aspirare vol.	10 microlitri
	Velocità	200 microlitri / sec
	Monitoraggio Liquid	60%
	Aspirare Altezza	Predefinito Labware	22.28
Dispensare	Tipo di impostazione	Valore	Osservazioni
	Posizioni	D7, D10, D13, D16
	Dispensare vol.	10 microlitri
	Velocità	200 microlitri / sec
	Monitoraggio Liquid	100 microlitri
	Dispensare Altezza	Predefinito Labware	17.01
Passo 1.2
Procedura	Tipo:	reagente
	Modalità:	di scarto
	dispensa per aspirare:	3
	ottimizzare la velocità:	Sì
	traferri sistema:	15 ml
	Trasporto:	0
Flush / Wash		No
Aspirare	Tipo di impostazione	Valore	Osservazioni
	Posizione	A4
	Aspirare vol.	3 x 490 ml
	Traferri	15 e 0
	Velocità	200 microlitri / sec
	Monitoraggio Liquid	400%
	Aspirare Altezza	Superficie del liquido
Dispensare	Tipo di s Etting	Valore	Osservazioni
	Posizione	D7, D10, D13, D16
	Dispensare vol.	490 microlitri
	Traferri	15 e 0
	Velocità	200 microlitri / sec
	Monitoraggio Liquid	100%
	Dispensare Altezza	Predefinito Labware	17.01

Tabella 1. Impostazioni per Multiprobe II. Il protocollo nella tabella 1 descrive la preparazione di 4 piatti (ogni 96 pozzetti). Le piastre sono situate adattatori piastra nella zona di lavoro in posizioni specificato dal robot (es. B7, B10, B13, B16).

1 "fo: keep-together.within-page =" always "> Impostazioni generali: Numero di ripetizioni di analisi dipende dalla lunghezza della corsa Numero di piastre illimitato Controllo della temperatura 28 ° C Protocollo Calcoli US Lum 96 (cps) leggi Tempo di misura 2,5 sec Correzione Crosstalk Distanza tra piastra e rivelatore 0 millimetri Glow (CT2) fattore di correzione 0% contenuto "> Tabella 2. impostazioni Envision utilizzate per lo schermo.

Discussione

Vi presentiamo qui il flusso di lavoro e di analisi dei dati per uno schermo chimico misurazione dell'attività GC in vivo utilizzando il GRIZLY test ^18. Il saggio presenta caratteristiche di controllo di qualità e misure di performance che sono paragonabili con schermi cellulari basati convenzionali, un vantaggio importante per il suo utilizzo in ambienti ad alto rendimento. Inoltre, tuttavia, il saggio in vivo rileva anche i composti che non sono accessibili agli schermi in vitro. Questo è esemplificato dalla presenza del pregnenolone pro-ormone tra i risultati. Così, il saggio GRIZLY estende il campo di schermi volte a attività di segnalazione GC.

L'importanza del rilevamento di effetti in vivo con nostra analisi risulta anche da risultati ottenuti con il DBT inquinanti organostannici e TBT ^18. DBT, ma non TBT, ha mostrato di inibire la segnalazione GC in colture cellulari di mammifero, e abbiamo osservato lo stesso in colture cellulari zebrafish esprimerezione del GRE: Luc giornalista. Importante, tuttavia, nel saggio GRIZLY, TBT ha mostrato attività inibitoria sulla via GC, in quanto può essere convertito DBT dal metabolismo larvale. Questa inibizione è stata osservata già a rilevanza ambientale concentrazioni di TBT. Tali risultati illustrano ulteriormente il potenziale del dosaggio GRIZLY nella rilevazione degli effetti composti a base di inter-organo di cross-talk e metaboliche modifiche dei composti nell'animale vivo. Essi sottolineano anche la potenziale applicazione del test GRIZLY per il monitoraggio ambientale. Così, effetti interferenti endocrini possono essere studiate a livello di segnale del recettore, in cui il disgregatore interferisce con l'attività di segnalazione GC indotta da un agonista GR come desametasone. Un'altra possibilità è quella di studiare gli effetti composti su pregnenolone stimolata sintesi GC. L'alta qualità rendimento del saggio dovrebbe consentire un rapido screening delle librerie di campioni ambientali.

L'uso di luciferasi come argene eporter consente un elevato range dinamico di rilevazione di attività di segnalazione ^23. In effetti, la sensibilità del test permette di rilevare osmotica indotta da stress produzione GC dal singolo larve ^18. La risoluzione temporale massimo raggiunto con il reporter luciferasi permette di seguire attività di segnalazione nel tempo, che rende possibile analizzare anche la cinetica dei dati.

Un potenziale svantaggio per alcune applicazioni è l'idoneità limitata per il monitoraggio spaziale di questo sistema giornalista. Sistemi reporter fluorescenti potrebbero essere più adatto per saggi che richiedono il monitoraggio di alcune zone delle larve. Tuttavia, tali dosaggi possono soffrire di sensibilità inferiori a causa di effetti di sfondo causati dalla luce di eccitazione, che pone anche limiti al rilevamento di composti fluorescenti. Inoltre, potrebbero fornire la risoluzione cinetica meno a causa della generalmente maggiore stabilità delle proteine ​​fluorescenti ^23.Inoltre, essi presentano sfide in termini di apparecchiature di imaging, analisi dei dati e l'archiviazione dei dati che potrebbero limitare il loro utilizzo per i laboratori di ricerca più piccoli.

Il set-up del test GRIZLY come un saggio basato micropiastra consente una facile integrazione nei flussi di lavoro di screening tipici. Il saggio è facilmente applicabile anche nei laboratori di ricerca più piccoli grazie alla sua semplicità d'uso e l'analisi dei dati. Allo stesso tempo, permette un notevole grado di automazione, ad esempio automatizzato applicazione della droga pipettando robot o la distribuzione automatizzata di embrioni da embrioni ordinamento dispositivi ^24,25. La semplice lettura non richiede microscopi automatizzati di screening o sofisticato software di analisi delle immagini, ma offre un ricco insieme di dati su aspetti temporali e quantitativi della via di segnalazione studiato.

In sintesi, presentiamo un protocollo passo-passo per un saggio relativamente poco costoso, robusta e facile da maneggiare lo screening chimico per GCsegnalazione attività in vivo e in tempo reale. Il test permette la determinazione degli effetti in vivo di composti su GC segnalazione non rilevabile in coltura cellulare saggi basati. Tra le tante applicazioni per il dosaggio sono ad esempio la determinazione degli effetti genetici sulla segnalazione dei glucocorticoidi, il monitoraggio ambientale degli effetti interferenti endocrini sulla sintesi glucocorticoide e segnalazione di attività, e lo screening di composti per gli effetti indesiderati sulla segnalazione GC o per l'romanzo modulatori vivo di questo importante via di segnalazione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2
Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe