Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

Summary

מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.

Abstract

Microinjecting רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים המבטאים Cre recombinase לאזורים במוח עכבר ברורים לסלקטיבי גני נוקאאוט של עניין מאפשר שליטה באופן זמני ואזורי ספציפית משופרת של מחיקת גן, בהשוואה לשיטות קיימות. אמנם גם יכולה להיות מושגת על ידי מחיקה מותנית הזדווגות עכברים שמבטאים Cre recombinase תחת שליטת יזמים גנים ספציפיים עם עכברים שנשאו גן floxed, microinjection stereotaxic מאפשר מיקוד של אזורי מוח בדידים בנקודות זמן שנקבעו הנסיין של עניין. בהקשר של העדפת קוקאין מותנית מקום, ופרדיגמות התנהגות אחרות כגון קוקאין מנהל עצמי או רגישות פסיכומוטורי שיכול להיות כרוך בנסיגה, הכחדה ו / או שלבי כינון, טכניקה זו שימושית במיוחד בחקר תרומתו הייחודית של גני המטרה ברורים לאלה שלבים של מודלים התנהגותיים של פלסטיות-Induced קוקאין. באופן ספציפי,טכניקה זו מאפשרת לאבלציה סלקטיבית של גני המטרה במהלך שלבים של התנהגות כדי לבחון את תרומתם להתנהגות על פני זמן בדידים. סופו של דבר, הבנה זו מאפשרת לתרופות ממוקדות יותר כי הם מסוגלים הטובים ביותר לטפל בגורמי הסיכון החזקים ביותר שמציגים את עצמם במהלך כל שלב של התנהגות ממכרת.

Introduction

קוקאין הוא psychostimulant מאוד מחזק. בעקבות חשיפה חוזרת ונשנית, כמה עיבודים מולקולריים ותאיים מתרחשים בפרס רלוונטי-מעגלי מוח שהם האמינו לגרום כפייתיים סמים התנהגות חיפוש, מה שגרם שיעור גבוה של הישנות אשר מהווה בעיה רצינית ¹ קלינית. קוקאין מפעיל השפעות התנהגותיות ארוכת טווח אלה על ידי ויסות ביטוי גנים. כדי ללמוד את ההתאמות הנובעות משימוש בקוק כרוני, היו בשימוש נרחב במודלים של מכרסמים פרה. מודל אחד כזה הוא העדפת פרדיגמה המקום מותנה (CPP). מודל זה כולל את הפיתוח של עמותה למדה בין סביבה ניטראלית בעבר ואת המאפיינים המתגמלים של קוקאין. לאחר כמה זיווגים של קוקאין בחדר מסוים, בעלי חיים מותר לחקור בחופשיות את סביבת קוק לזווג ולא קוק לזווג ואם הם מעדיפים את תא סמים לזווג, הם אמרו שרכשו plac קוקאין-Inducedהעדפת דואר. יתר על כן, לאחר תקופת הכשרת הכחדה, יכולה לשמש פרדיגמה זו כדי ללמוד כינון הקשר ספציפי של שוחרת קוקאין התנהגות.

בהשוואה לדגמים אחרים של התנהגות כמו התנהגות ממכרת, כגון רגישות פסיכומוטורי, המשמש למחקר ארוך טווח התנהגות מושרה קוקאין ופלסטיות מולקולרית ^2,3 וממשל עצמי (SA), כי הוא חשב בצורה מדויקת יותר לחקות ממכר כמו התנהגות שנמצאה בבני אדם, את הפרדיגמה CPP היא הליך פשוט ללמוד קוקאין למידה קונטקסטואלית ^4. פרוטוקולי CPP יכולים להתארך בנוחות ולכלול את הכחדת שלבי שבה, בדומה לSA, המאפשר חקירה של המנגנונים שבבסיס תשוקת סמים והישנות ^5-7 ואשר האמינו לשחזר היבטים של מה שמתרחש באדם תרופה שוחרת התנהגות וסמים - וקיו-Induced הישנות ^8-10.

מנגנון אחד שעומד בבסיסקוקאין-induced פלסטיות התנהגותית שאופיינית לכל אחד מהשלבים שונים של CPP, כולל רכישה, הכחדה, ושבה, היא הפעלה של חתימות ייחודיות של ביטוי גנים באזורים שונים במוח. כדי לבחון ישירות אילו גנים בתוך אזורים במוח גמול רלוונטיים לתווך-Induced קוקאין שינויים התנהגותיים, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לתפעל אותם באופן סלקטיבי באופן אזורי ספציפי. אחת דרכים להשגת מטרה זו היא microinject רקומביננטי adenoassociated וקטורים (rAAV) נגיפיים שהמפורש Cre recombinase באמצעות ניתוח stereotaxic, לאזורים במוח שונים של עכברים שיש להם גני המטרה מוקפים אתרי loxP (עכברי floxed). שיטה זו מאפשרת שליטה זמנית ואזורית מאוד מדויקת על מתי והיכן גנים ablated, בשני נוירונים מתחלקים ולא החלוקה, ללא גרימת תגובה חיסונית ^11-13. רמה זו של שליטה מייצגת יתרון חשוב על פני טכנולוגיית Cre-LoxP המסורתי של רבייה עכברי floxed wעכברי ith מבטאים Cre recombinase תחת השליטה של ​​אמרגן גן אנדוגני, שבעיתוי וההפצה של מחיקת גן יכולים להיות מוסדרות יותר בחוזקה. בנוסף, נוקאאוט גן וקטור ויראלי עוקף בתיווך השפעות התפתחותיות פיצוי פוטנציאלי שעלולים להתרחש באמצעות אסטרטגיות נוקאאוט מסורתיות.

בנוסף לקוקאין CPP, שתואר כאן, microinjection של rAAV-Cre לתוך המוח של עכברי floxed כדי להעריך את התפקיד של גנים ספציפיים יכול להיות מיושם בכל מקום בגוף לפרדיגמות התנהגות הכרוכים בשלבים נפרדים, ובכלל זה ניהול עצמי ורגישות פסיכומוטורי. לדוגמה, במעבדה שלנו ניצל את טכנולוגית rAAV-Cre כדי ללמוד את התפקיד של CA _v 1.2 ליטר מסוג Ca ^{2 +} ערוצים ברגישות פסיכומוטורי קוקאין ^14. באופן ספציפי, rAAV-Cre היה microinjected לתוך גרעין האקומבנס (NAC) של עכברים עם גן קידוד Ca _V 1.2 floxed, על מנת להוכיח כי Ca _V 1.2 הפועל באזור זה מתווך את שלב הביטוי של רגישות פסיכומוטורי ^14,15. עם זאת, לא ניתן להשתמש באסטרטגיה rAAV-Cre אם עכברים עם גן floxed של עניין לא קיימים, כפי שהיה הניסיון שלנו בעת הערכת התפקיד של CA _v 1.3 ליטר מסוג Ca ^{2 +} ערוצים ברגישות פסיכומוטורי. לפיכך, מגבלה של שימוש rAAV-Cre מציגה את עצמו אם עכברים מותנים אינם קיימים לגן מסוים של עניין. עם זאת, rAAVs שsiRNA המפורש ניתן להשתמש בם למציאת גני המטרה, כפי שעשינו כדי לבחון את התפקיד של CA _v 1.3 הערוצים ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre לאזורים נפרדים במוח של עכברי floxed ולאחר מכן בודק אותם בפרדיגמה CPP מאפשר לחקירה את הגנים הספציפיים המתווכים את השלבים השונים של התנהגות דמוית הממכר ושבו הם פועלים. השימוש בפרדיגמה זו סייעה בהבנתנו כיצד ממשל קוקאין החוזר ונשנה במהות חוטפת brמעגלי גמול ains גורמים לשינויים הסתגלותי במסלולי העברת אותות מולקולריים וביטוי גנים שיובילו למדינה המכורה ^1,16,17.

Protocol

כל ההליכים מתבצעים בהתאם לטיפול Weill Cornell Medical College בבעלי החיים המוסדי וכללי ועדת שימוש.

1. הכנה והתקנה עבור משלוח Stereotaxic של וקטורים ויראליים

1. אם מכשיר, ספוגית סטרילית, או יד לובשת כפפה סטרילית מזוהם באים במגע עם משטח שאינו סטריליים, לבטל או לעקר מחדש את המכשיר באמצעות מעקר חרוז חם, לבטל או לשנות את ספוגית לכפפות סטריליות חדשות.
2. הצב כלוב עכבר עם מצעים על גוש חום כדי לחמם להחלמה שלאחר ניתוח.
3. הגדר את מכונת גילוח חשמלית לגילוח הראש ואתנול ויוד לחיטוי הקרקפת.
4. נגב את סורגי אוזן ולהחזיק את הפה של stereotax עם 70% אתנול.
5. באמצעות מזרק המילטון 5 μl, לצייר עד 5 μl של וקטור ויראלי (1 x 10 ⁶ / μl חלקיקים נגיפיים) ולהקים בבעל מזרק בstereotax.
6. כרית חימום במיקרוגל או להפוך כרית חשמלית עלמקום שני בstereotax. לכסות עם כרית סופגת נקיות כדי להפחית את הסיכון לכוויות. צג טמפרטורת גוף עכבר (שבין 97-99.5 מעלות פרנהייט) בתדירות גבוהה לאורך כל הליך.
7. הזרק עכבר (במשקל של בין 22-35 g) בתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) וxylazine (20 מ"ג / ק"ג). ברגע שעכבר הוא מורדם, קצה זנב קמצוץ כדי לבדוק את הרפלקסים של העכבר ושים לב כל תנועה או תגובה על מנת להבטיח שהעכבר הוא מורדם כראוי.
8. לגלח את הראש בין אוזניים ועיניים.
9. יש לנקות את הראש מגולח עם לסירוגין applicators כותנה סטריליים אתנול ויוד.
10. העבר את העכבר למשטח מחומם בstereotax.

2. Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים

1. ללבוש כפפות סטריליות במהלך הניתוח. אם כפפות מזוהמות בכל נקודה על ידי נגיעה משטחים שאינם סטריליים, לשנות את הכפפות.
2. בר שן אפס קשקשים ואוזן בר.
3. הגדר שיניים בבר שן.
4. בורג בפרצופו. אם נענוע או מהלך זיףment יצוין, בכל עת, לנהל חיסון דחף IP (~ 0.05 סמ"ק) מתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) וxylazine (20 מ"ג / ק"ג).
5. בורג בברים אוזניים.
6. לשמן את העיניים עם PuraLube.
7. חותכים את הקרקפת פתוחה לממש מאחורי אוזניים עם אזמל.
8. קליפים בולדוג מקום בפינות של הקרקפת כדי לקלף את העור מהגולגולת. גבחת ומבדה צריכה להיות גלויה לעין.
9. הפוך תפר בטוח מגבחת למבדה מיושרת ישר. אם התפר הוא מיצוב להסתגל עקום של הראש.
10. בדקו כדי לוודא שכל ההגדרות בstereotax הם התביית.
11. שים מחט קצה במקום בגבחת.
12. למדוד את כל הקואורדינטות עבור שניהם גבחת ולמבדה. זה כולל קואורדינטות גב / הגחון, המדיאלי / לרוחב וקדמית / אחורית.
13. התאם את הראש עד שקואורדינטות הגחון לגבחת ומבדה נמצאות ב0.02 מ"מ של כל אחד אחר.
14. ברגע שמיושר, מגבחת הולכים מדיאלית החוצה לקואורדינטות המדיאלי / רוחב (מ '/ ל'). לוודאהצדדים ימני והשמאליים מיושרים בתוך 0.02 מ"מ של כל אחד אחר.
15. קצה מחט מחדש מרכז בגבחת ומשם לנוע בכיוון הקדמי / אחורי (/ P) כדי לתאם הקדמי / אחורי הרצויים.
16. אם מחט צורך, זווית בכיוון אחד ולוודא stereotax נעול. לצאת לM / L לתאם השמאלי (+ / - 1.52)
17. מדוד את עמדת הגחון של החלק העליון של הגולגולת להשתמש כהפניה לאחר הקידוח הוא קדח.
18. לקדוח קידוח באמצעות מקדח סטרילי בקואורדינטות הרצויה. בדקו שהמחט יכולה להיכנס ללא הפרעה דרך הגולגולת.
19. מנמיכים את המחט לקואורדינטות הגחון הרצויה.
20. ברגע שהוא הגיע לתאם, לטבול 0.015 מ"מ מתחת ל~ 10 שניות כדי ליצור כיס קטן לוקטור ויראלי.
21. הזרק את הנפח הרצוי של וקטור ויראלי בשיעור של 0.1 ~ μl / דקה. לחכות 3 דקות לוקטור ויראלי לנטרל לחלוטין. הרם את קצה מחט מ"מ 0.015 ולחכות 2 דקות נוספות.
22. טובלים את המחט (אם עושה זריקות זווית) בכיוון ההפוך. שוב, להקליט את מיקום הגחון כהתייחסות לחלק העליון של הגולגולת.
23. חזור על אותם השלבים כמו בצד הראשון להזריק וקטור ויראלי בצד השני (אם עושה זריקות דו צדדיות).
24. החל שעוות עצם לשני החורים כדי לאטום אותם באמצעות סוף העץ של קצה מוליך כותנה סטרילי.
25. תפר את הקרקפת.
26. החל בלוק עצבי לאזור הפגוע.
27. הסר את העכבר מstereotax ומקום בכלוב בחום לחסום חימם להתאושש במשך 45 דקות.
28. לעקוב אחר סימנים של כאב, כולל: ירידה בפעילות כללית או חוסר מנוחה, ירידה בצריכת מזון ומים או ניקוד מוגבר. יכולות להינתן פעמיים ביום במשך שבוע במידת צורך לכאב - עצירות (0.2 מ"ג / ק"ג 0.05). חלופות מקובלות כוללות: meperidine (20-60 מ"ג / ק"ג), סחרחורת (10 מ"ג / ק"ג), nalbuphine (4-8 מ"ג / ק"ג).

3. העדפות מקום אוויר: Acquisition, הכחדה, והחזרה

1. עכברי מקום לחדר המרכזי של מנגנון העדפת מקום השלוש קאמרי (מד Associates Inc, סנט אלבנס, ורמונט, ארה"ב) לתקופה של 60 שניות הרגלה עם דלתות סגורות הגיליוטינה.
2. לאחר התרגלות, דלתות הגיליוטינה פתוחות ולאפשר חיפושי עכברים ללא כל 3 התאים ל1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל תא שהוקלט באמצעות התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc).
3. הקצאת עכברים לתאי מיזוג המבוססים על הביצועים שלהם במהלך המבחן מראש. באמצעות עיצוב, תרופות צמד מוטות במהלך 3 ימים שלאחר מכן עם התא שהיה הכי פחות מועדף במבחן מראש תחילת המחקר.
4. בימי מיזוג 3 הבאים, להזריק עכברים עם קוקאין (10 מ"ג / ק"ג; IP) במהלך ישיבת הבוקר ולהגביל אותם בחדר שהוקצה להם ל1,200 שניות מייד לאחר ההזרקה. להחזיר עכברים לכלובים בביתם לאחר הפגישה. לאחר 4 שעות, להזריק עכברים עם מי מלח (0.01 מ"ל / גרםמשקל גוף) ולהגביל אותם לתא ההפוך למושב 1,200 שניות אחר הצהריים.
5. כדי לבדוק לרכישה, עכברי מקום בתא המרכזי עם דלתות הגיליוטינה נסגרו לתקופה התרגלות שנייה 60. הגיליוטינה דלתות פתוחות ולאפשר חקירה ללא תשלום עבור 1,200 שניות, עם זמן מושקע בכל התאים שתועדו על ידי התוכנה הרביעית MedPC (מד Associates, Inc). חישוב העדפה על ידי הפחתת כמות הזמן שבילתה בתא מלוחים לזווג מכמות הזמן שבילתה בתא קוק לזווג.
6. כדי לכבות את העדפת המקום, תחשוף עכברים לשני מפגשי 20 דקות של חיפושים חופשיים יומי באותו המנגנון, מופרדים על ידי לפחות 2 שעות, 24 שעות לאחר תחילת המבחן לרכישה. שוב המשך זמן בכל התאים צריך להיות מוקלט וסדר הגודל של CPP הראשוני צריך להיות בהשוואה לזה של כל מושב הכחדה.
7. לקבוע אם עכברים כיבו את העדפת תוצאת משימוש בסמים על ידי בחינת האם העדפת נקובקאמרי ticular על פני יומיים רצופים הכחדה הוא נמוך באופן משמעותי בהשוואה לציון העדפת הרכישה.
8. להחזיר עכברים עם מנה תחול בקוקאין (5 או 10 מ"ג / ק"ג; IP) ולחשוף מחדש למנגנון המאפשר חקירה החופשית ולהקליט את משך זמן בכל תא.
9. לנהל פתרון המתת חסד Euthasol (150 מ"ג / ק"ג). Transcardially perfuse עכברים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ולבצע בדיקה היסטולוגית כדי לאמת את מיקום microinjection נכון.

תוצאות

CPP

לאחר ביצוע CPP על עכברי microinjected, צריך לוודא שהקבוצה של שליטה המוזרקת (rAAV-GFP) העכברים בדרך כלל רכשה העדפה הקאמרית סמים לזווג (איור 1 א, 1 ב). עכברים נחשבים לרכשו העדפה לחדר מסוים, כאשר העדפת קוקאין (משך זמן בחדר קוק לזווג מינוס ה...

Discussion

אזורי ואבלציה גן temporally הספציפית באמצעות microinjection stereotaxic של וקטורים ויראליים בשילוב עם CPP הכולל הכחדה ושלבי כינון מאפשרת חקירה של התרומות הספציפיות של גנים לשלושה שלבים ברורים של התנהגות דמוית ממכרת. בעוד נוקאאוט המותנה שמושג תוך ניצול מערכת Cre-LoxP המסורתי מספק למרחב ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004